CN112877420B - 与视网膜病变相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与视网膜病变相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物包括FCGR3A、NAGLU和/或CNTN1，与NDR相比，FCGR3A、NAGLU、CNTN1在DR中呈现显著性差异，且ROC曲线具有较高的AUC值，提示FCGR3A、NAGLU、CNTN1可应用于DR的诊断。

Description

与视网膜病变相关的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及与视网膜病变相关的生物标志物及其应用。
背景技术
视网膜病变(retinopathy)是指视网膜在各种因素的影响下发生的改变，如出血、渗出、细胞异常数量增加或水肿。其分类较多，比较复杂，常见的有视网膜脱离、黄斑病变、眼外伤、糖尿病性视网膜病变、眼内炎、球内异物、先天性眼病，如新生儿视网膜病变(ROP)、眼内寄生虫。
糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病主要的微血管并发症之一，也是主要的致盲性疾病(Dow C,Mancini F,Rajaobelina K,et al.Diet and risk ofdiabetic retinopathy:a systematic review[J].Eur J Epidemiol,2018,33(2):141-156.doi:10.1007/s 10654-017-0338-8)。目前，已知DR发病与炎症、氧化应激、细胞因子异常表达和基因甲基化等因素相关，但仍不能明确具体发病机制。糖尿病患者视网膜由长期的高血糖、缺氧和氧化应激状态可引起视网膜微血管周细胞数量减少，基底膜增厚，内皮细胞增殖，异常的视网膜微循环导致视网膜血管渗漏增加，视神经发生退行性病变，直至进展到PDR，视网膜发生新生血管，玻璃体出血，纤维膜的形成和视网膜脱离。PDR发病较为隐蔽，晚期出现视力下降，很多患者由于发现较晚和治疗不及时导致视力丧失。目前，DR的治疗如激光光凝、玻璃体腔内注射抗VEGF药物或皮质类固醇、玻璃体视网膜手术等方法主要针对较晚期的患者，但难以逆转视网膜的结构和功能损害，仅能恢复和维持部分视力。因此早期诊断和及时治疗对疾病的控制和预后非常关键。虽然通过眼底图片和视网膜荧光造影等检查可以区别非增殖性(Non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(Proliferative diabetic retinopathy,PDR，但是，目前尚缺乏有效生物标志物作为DR发病危险因素和判断预后的临床指标。
随着生物技术的发展，蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。研究覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。蛋白质组学的研究领域愈加广泛。研究DR的蛋白组学，寻找无创的DR早期诊断和判断预后的生物标志物，以便在早期选择合适手段对疾病进行有效干预，提高患者视力和改善生活质量，是DR的研究重点。
发明内容
本发明基于基因在视网膜病变的发生发展中的作用，研究与视网膜病变发生发展相关的生物标志物，从而为视网膜病变的诊断和治疗提供新的手段。
本发明提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断视网膜病变的产品中的应用，所述生物标志物选自FCGR3A、NAGLU或CNTN1的一种或几种。
进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、色谱技术、质谱技术检测生物标志物水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别所述生物标志物的探针；或
特异性扩增所述生物标志物的引物；或
特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂。
特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。
作为一种优选实施方式，特异性结合剂为抗体。
进一步，所述样本选自组织或血液。
作为一种优选的实施方式，所述样本为血液。
进一步，所述视网膜病变为糖尿病性视网膜病变。
本发明提供了一种诊断视网膜病变的产品，所述产品包括检测样本中生物标志物的试剂，所述生物标志物选自FCGR3A、NAGLU或CNTN1的一种或几种。
进一步，所述视网膜病变为糖尿病性视网膜病变。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。
进一步，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包括评估受试者是否患有或易患视网膜病变的说明书。
进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。
本发明提供了生物标志物在构建预测视网膜病变的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用，所述生物标志物选自FCGR3A、NAGLU或CNTN1的一种或几种。
进一步，所述计算模型以生物标志物的水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出疾病的风险概率。
本发明提供了一种诊断视网膜病变的系统，包括：
(1)视网膜病变评估装置，其包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有视网膜病变；和
(2)彼此通信地连接的信息通信终端装置，其提供关于来自受试者的样本中前面所述的生物标志物的水平的数据；
其中，所述视网膜病变评估装置的控制单元包括：
1)数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本的所述生物标志物的水平的数据，所述生物标志物选自FCGR3A、NAGLU或CNTN1的一种或几种。
2)判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述样本中所述生物标志物的水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的所述生物标志物的水平的判别来计算判别值；
3)判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的视网膜病变的情况进行评价；以及
4)评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
本发明的优点和有益效果：
本发明的标志物与视网膜病变具有极高的关联度，在判断视网膜病变时，均具有较好的诊断效能，准确性、敏感性以及特异性较高，可用于视网膜病变的早期发现。
附图说明
图1是差异基因的表达情况图，其中，图A是FCGR3A的表达情况图；图B是NAGLU的表达情况图；图C是CNTN1的表达情况图。
图2是基因作为检测变量的ROC曲线图，其中，图A是FCGR3A的ROC曲线图；图B是NAGLU的ROC曲线图；图C是CNTN1的ROC曲线图；图D是FCGR3A+NAGLU+CNTN1的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明为了筛选可用于视网膜病变诊断的生物标志物，通过收集糖尿病性视网膜病变患者的血液(血浆)样本与正常对照血液(血浆)样本，综合分析样本的蛋白表达谱，筛选在训练集中两个群组中水平呈现显著性差异的蛋白，并进一步分析差异蛋白的诊断效能，从而发现适于视网膜病变诊断和治疗的生物标志物。
在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因或其表达产物，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。术语“生物标志物”通常是指一种基因或其表达产物的存在/浓度/含量或两种或更多种基因或其表达产物的存在/浓度/含量。
生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。
优选地，生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。
在本发明的具体实施方式，所述生物标志物包括FCGR3A、NAGLU或CNTN1。
在本发明中，FCGR3A(基因ID：2214)包括CGR3A基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的CGR3A，以及源自细胞中加工的任何形式的CGR3A。该术语涵盖CGR3A的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
NAGLU(基因ID：4669)包括NAGLU基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的NAGLU，以及源自细胞中加工的任何形式的NAGLU。该术语涵盖NAGLU的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
CNTN1(基因ID：1272)包括CNTN1基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的CNTN1，以及源自细胞中加工的任何形式的CNTN1。该术语涵盖CNTN1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
在本发明中，可以使用任何合适的方法来分析生物样品以确定所述样本中所述生物标志物的水平。这些方法包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、质谱技术。
本发明的核酸测序方法的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
本发明的核酸测序方法的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
本发明中的核酸杂交方法包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
本发明所述核酸扩增方法选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。
本发明的蛋白免疫方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
根据本发明的免疫法可基于，例如，以下方法中的任一种。
免疫沉淀法是最简单的免疫测定方法；这种方法测量沉淀物的量，在试剂抗体已与样本一起孵育并与其中存在的靶抗原反应以形成不溶性团聚体之后形成所述沉淀。免疫沉淀反应可以是定性的或是定量的。
在颗粒免疫测定中，多种抗体与该颗粒连接，且所述颗粒能够同时结合很多抗原分子。这大大地加速了可见反应的速度。这允许生物标志物的快速且灵敏的检测。
在免疫比浊法(immunonephelometry)中，抗体和生物标志物上的靶抗原的相互作用引起免疫复合物的形成，所述免疫复合物太小而不能沉淀。但是，这些复合物将散射入射光，这可使用比浊计来测量。可在反应的几分钟之内测定抗原(即生物标志物)的浓度。
放射免疫测定(RIA)法使用放射性同位素例如I125来标记抗原或抗体。所使用的同位素发射γ射线，通常在除去非结合的(游离的)放射性标记之后测量所述射线。与其它的免疫测定相比较，RIA的主要优势在于更高的灵敏度、容易的信号检测和确认的、快速的测定。主要的劣势在于由放射物的使用引起的健康和安全风险和与维护许可放射物安全和处理程序相关的时间和费用。出于该原因，在常规临床实验室实践中，RIA已很大程度上被酶免疫测定所取代。
酶免疫测定(EIA)发展为放射免疫测定(RIA)的替代物。这些方法使用酶来标记抗体或靶抗原。EIA的灵敏度接近RIA的灵敏度，且不存在由放射性同位素引起的危险。用于检测的最广泛使用的EIA方法之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA方法可使用两种抗体，其一对于靶抗原是特异性的，而另一与酶偶联，酶底物的添加引起化学发光信号或荧光信号的产生。
荧光免疫测定(FIA)指使用荧光标记或酶标记的免疫测定，所述荧光标记或酶标记作用在底物上以形成荧光产物。荧光测量固有地比比色(分光光度法的)测量更加灵敏。因此，FIA方法具有比利用吸收(光密度)测量的EIA方法更高的分析灵敏度。
化学发光免疫测定使用化学发光标记，当其被化学能激发时产生光；使用光检测器测量发射。
因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。
本发明的生物标志物的水平还可以使用质谱技术进行测定，所述质谱技术包括但不限于电喷射电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解析离子化渡越时间质谱测定法(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解析/电离渡越时间质谱测定法(SELDI-TOF-MS)、硅表面的激光解吸/离子化质谱(DIOS)、次级离子质谱法(SIMS)、四极杆渡越时间(Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术，称作ultraflex III TOF/TOF，大气压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS).sup.N、大气压光离子质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS).sup.N、四极杆质谱测定法、傅立叶变换质谱测定法(FTMS)、定量质谱测定法和离子阱质谱测定法。
在对蛋白生物标志物进行质谱表征和确定生物标志物值之前使用样品制备策略来标记和富集样品。标记方法包括但不限于用于相对定量和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)和细胞培养中用氨基酸标记的稳定同位素(SILAC)。在质谱分析之前用来关于候选生物标志物蛋白选择性地富集样品的捕捉试剂包括但不限于适体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体(affybody)、纳米抗体、锚蛋白、域抗体、可选的抗体支架(例如，双特异抗体等)印迹的聚合物、avimer、多肽模拟物、类肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成的受体和这些的修饰形式和片段。
术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。
作为优选的实施方式，所述样本选自血液、血清、血浆。
本发明提供了一种诊断视网膜病变的产品，所述产品包括检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂；并且可包括使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患视网膜病变的说明书。
当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以产品形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的生物标志物，以降低测定的复杂性和成本。
可使用本文所述的能够检测样本生物标志物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中生物标志物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本生物标志物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。高于或低于预定阈值的生物标志物的存在或不存在可以例如通过发色、发荧光、电化学发光或其他输出(例如在酶免疫测定(EIA)，诸如酶联免疫测定(ELISA)中)来显示。
在一个实施方案中，产品可包含固体基片诸如芯片、载玻片、阵列等，其具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种样本生物标志物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样本中生物标志物的存在和/或浓度和/或量。如上所述，在患有视网膜病变的受试者的样本中发现所述生物标志物的水平降低或增加。芯片可被配置成使得仅当这些生物标志物中的一种或多种的浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色变化)，所述阈值被选择或区分指示对照受试者的生物标志物的浓度和/或量与指示患有或易患视网膜病变的患者的生物标志物的浓度和/或量。因此，可检测到的输出(诸如颜色变化)的存在立即表明样本中包含显著降低水平的生物标志物，表明受试者患有或易患视网膜病变。
在本发明中，生物标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。
正如熟练技术人员会领会的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合蛋白质和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于视网膜病变的风险或与有助于评估视网膜病变患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有视网膜病变风险的个体、具有视网膜病变的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。
用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估视网膜病变中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
接受者操作曲线下面积(＝AUC)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的接受者操作特征(ROC)描述得最好。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。
实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或者疾病进展对无疾病进展。
在每种情况中，ROC线图通过对于决策阈的整个范围将灵敏度对1-特异性绘图来描绘两种分布之间的交叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目)]。这也称作疾病或状况的存在的阳性。它仅仅自受影响亚组来计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的一项指标，而且完全自不受影响的亚组来计算。因为真和假阳性分数通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算，所以ROC线图不依赖于样品中疾病的流行程度。ROC线图上的每个点代表一个对应于特定决策阈的灵敏度/1-特异性对。一项具有完美区分(两种结果分布没有交叠)的测试具有通过左上角的ROC线图，那里真阳性分数为1.0，或100％(完美灵敏度)，且假阳性分数为0(完美特异性)。一项不区分(两个组的结果分布相同)的测试的理论线图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数线图落在这两种极端之间。(如果ROC线图完全落在45°对角线以下，那么这容易通过将“阳性”的标准从“大于”颠倒成“小于”或反之来矫正。)定性地，线图越接近左上角，测试的整体精确性越高。
量化实验室测试的诊断精确性的一项便利目标是通过单一数值来表述它的性能。最常见的全局度量是ROC曲线下面积(AUC)。常规地，此面积总是≥0.5(如果不是这样，那么可以颠倒决策规则来使之这样)。数值范围介于1.0(完美分开两个组的测试值)和0.5(两个组的测试值之间没有明显分布差异)之间。面积不仅取决于线图的特定部分诸如最接近对角线的点或90％特异性处的灵敏度，而且还取决于整个线图。这是ROC线图如何接近完美者(面积＝1.0)的一种定量、描述性表述。
整体测定法灵敏度会取决于实施本文公开的方法要求的特异性。在某些优选设置中，特异性75％可能是充分的，而且统计方法和所得算法可以基于此特异性要求。在一个优选实施方案中，用于评估有视网膜病变风险的个体的方法基于特异性80％、85％、或还优选90％或95％。
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1筛选视网膜病变差异蛋白
1、样本收集
收集14例糖尿病性视网膜病变的患者的血液样本作为实验组(DR)和6例无视网膜病变的糖尿病患者的血液样本作为正常对照(NDR)，其中14例糖尿病性视网膜病变患者包括7例非增殖期糖尿病性视网膜病变组(NPDR)和7例增生性糖尿病视网膜病变组(PDR)患者。纳入的所有患者无高血压、心脑血管疾病等病史。患者资料统计如表1所示。
表1患者资料
Figure BDA0002945358140000131
2、蛋白测序
2.1蛋白质提取
1)冷冻状态下取出样品；
2)使用PierceTMTop 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns去高丰度试剂盒进行高丰度蛋白去除；
3)按照试剂盒说明书进行高丰度蛋白去除并收集蛋白溶液；
4)使用3KD超滤管浓缩样品至适量体积，用8M尿素溶液(含蛋白酶抑制剂)进行置换，共置换3次；
5)BCA定量，SDS-PAGE电泳。
2.2总蛋白质BCA法含量测定
1)BCA工作液配制：按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；
2)将标准品按0、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加尿素裂解液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；
3)各样品均取2μl与18μl水混合，之后加入200μl BCA工作液。震荡混匀，37℃反应30min；
4)采用SPECTRA MAX酶标仪，读取562nm吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度，样品浓度如表2所示。
表2样品浓度
序号 样品编号 浓度(mg/ml) 总量(μg) 初始体积
1 4 1.527 99 30
2 5 1.28 83 30
3 7 1.34 87 30
4 8 1.048 68 30
5 10 1.277 83 30
6 11 1.263 82 30
7 13 1.373 89 30
8 15 1.018 66 30
9 18 1.21 79 30
10 19 1.372 89 30
11 20 1.182 77 30
12 21 1.229 80 30
13 22 1.356 88 30
14 23 1.34 87 30
15 24 1.164 76 30
16 25 1.31 85 30
17 26 1.328 86 30
18 28 1.01 66 30
19 29 1.461 95 30
20 41 1.057 69 30
3、多肽样品制备
1)取待检测样品的蛋白溶液各100μg；
2)加入TEAB(三乙基碳酸氢铵缓冲液，Triethylammonium bicarbonate buffer)，使TEAB终浓度100mM；
3)加入TCEP(三(2-羧乙基)膦)，使TCEP终浓度为10mM，在37℃下反应60min；
4)加入IAM(碘乙酰胺，Iodoacetamide)，使IAM终浓度40mM，室温下避光反应40min；
5)10000g离心20min，取沉淀；
6)用100μl 100mM TEAB充分溶解样品；
7)按照酶：蛋白(m/m)＝1:50加入胰蛋白酶(Trypsin)，37℃酶解过夜。
4、建立谱图库
4.1高pH RP-UPLC第一维分离
将已酶解好的多肽样品取等量混合后真空离心浓缩，用UPLC上样缓冲液复溶后的多肽样品；
用反相C18柱进行高PH液相分离，参数如下：
柱子信息：ACQUITY UPLC BEH C18 Column 1.7μm,2.1mm X 150mm(Waters公司，USA)
色谱仪器：Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC
A相：2％乙腈(氨水调至pH10)
B相：80％乙腈(氨水调至pH10)
紫外检测波长：214nm
流速：200μl/min
梯度：47min时间
表2 UPLC梯度
Figure BDA0002945358140000151
Figure BDA0002945358140000161
根据峰型和时间共收取20个馏分，真空离心浓缩(rotation vacuumconcentration，Christ RVC 2-25，Christ，Germany)后，用质谱上样缓冲液溶解，按比例添加10×iRT肽段并混匀进行第二维分析。
4.2液相串联质谱检测
数据采集软件：Thermo Xcalibur 4.0(Thermo,USA)
反相柱信息：C18 column(75μm×25cm,Thermo,USA)
色谱仪器：easy nLC-1200(Thermo,USA)
质谱仪器：Q_Exactive HF-X(Thermo,USA)
色谱分离时间：120min
A相：2％ACN 0.1％甲酸
B相：80％ACN 0.1％甲酸
流速：300nL/min
梯度：表3所示
表3 easy 1200液相梯度
Figure BDA0002945358140000162
MS扫描范围(m/z)：350-1500，采集模式：DDA，Top 20；
Top 20(选择母离子中信号最强的20个进行二级碎裂)；
一级质谱分辨率：60000，AGC target：3e6，最大注入时间：20ms，碎裂方式：HCD；
二级分辨率：15000，AGC target：5e4，最大注入时间：45ms，fixed first mass：100m/z；
minimum AGC target：8e3，Intensity threshold：1.8e5，动态排除时间：30s。
4.3数据库搜索
搜库使用软件版本为ProteomeDiscovererTM Software 2.4。搜库时将raw文件提交至软件所在服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。
5、个体样品SWATH质谱检测
5.1肽段脱盐、定量
1)胰蛋白酶消化后，取等量样本真空离心浓缩仪抽干肽段；
2)将酶解抽干后的肽段用0.1％TFA复溶肽段；
3)用HLB进行肽段脱盐，真空浓缩仪抽干；
4)使用Thermo Fisher Scientific(货号：23275)肽段定量试剂盒进行肽段定量。
5.2液相串联质谱检测
用质谱上样缓冲液溶解等量的肽段，按比例添加10×iRT肽段并混匀后进行SWATH检测分析；
数据采集软件：Thermo Xcalibur 4.0(Thermo,USA)
反相柱信息：C18 column(75μm×25cm,Thermo,USA)
色谱仪器：easy nLC-1200(Thermo,USA)
质谱仪器：Q_Exactive HF-X(Thermo,USA)
色谱分离时间：120min
A相：2％ACN 0.1％甲酸
B相：80％ACN 0.1％甲酸
流速：300nL/min
梯度：同上
MS扫描范围(m/z)：350-1500；
碎裂方式HCD，Variable Window：30。
SWATH窗口设置如下：
表4 SWATH窗口
SWATH Exp Index Mass[m/z] Window width[m/z]
1 372 45
2 406.5 26
3 430.5 24
4 453.5 24
5 473 17
6 489 17
7 505 17
8 521 17
9 537 17
10 553 17
11 569 17
12 585 17
13 601 17
14 617 17
15 634 19
16 652 19
17 670.5 20
18 690.5 22
19 711.5 22
20 733 23
21 755.5 24
22 779 25
23 804 27
24 831 29
25 862 35
26 899 41
27 942.5 48
28 995 59
29 1065.5 84
30 1303.5 394
6、SWATH数据分析
采用ProteomeDiscovererTM Software 2.4对分级建库数据进行搜索并建立数字化谱图库作为后续SWATH定量分析的定性依据，将谱图库导入SpectronautTM对SWATH原始数据进行子离子峰提取，iRT校正保留时间，每个蛋白选择6个肽段及每个肽段选择3个子离子进行定量分析，Protein FDR≤0.01，Peptide FDR≤0.01，Peptide Confidence≥99％，XICwidth≤75ppm，排除共享肽段及修饰肽段，计算峰面积加合得出定量结果。iRT非线性矫正大多数数据点均匀分布在拟合曲线上，实验结果理想。将鉴定到的蛋白定量结果用总峰面积比值进行归一化后用于差异蛋白筛选及统计。
7、差异蛋白分析
使用R语言中t.test函数计算样本间差异显著性p值，显著差异表达蛋白的筛选标准为：p＜0.05&(FC＜0.83或FC＞1.20)
8、结果
分析结果如图1所示，FCGR3A、NAGLU或CNTN1在DR中显著上调。
实施例2诊断效能验证
使用R绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。
在判断指标联合的诊断效能时，首先是对基因进行logistics回归，其中，自变量为对应的指标，因变量为患病情况，通过拟合出的回归曲线可以计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率划分阈值即可得到预测结果。最佳概率划分阈值通过约登指数最大的一点确定。根据确定的概率划分阈值，可以计算得出每种联合检测方案在训练集和验证集的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值等。
FCGR3A、NAGLU、CNTN1单独或联合的诊断效能如表5和图2所示，FCGR3A、NAGLU、CNTN1的AUC值分别为0.893、0.798、0.833，提示FCGR3A、NAGLU、CNTN1应用于DR的诊断具有较好的效能。
表5 AUC值
Figure BDA0002945358140000191
Figure BDA0002945358140000201
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断糖尿病性视网膜病变的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物选自FCGR3A、NAGLU或CNTN1的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、色谱技术、质谱技术检测生物标志物水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：
特异性识别所述生物标志物的探针；或
特异性扩增所述生物标志物的引物；或
特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述样本选自组织、血液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括评估受试者是否患有或易患视网膜病变的说明书。
8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。
9.生物标志物在构建预测糖尿病性视网膜病变的计算模型中的应用，其特征在于，所述生物标志物选自FCGR3A、NAGLU或CNTN1的一种或几种；所述计算模型以生物标志物的水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算。
10.一种系统，其特征在于，包括：
（1）糖尿病性视网膜病变评估装置，其包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有糖尿病性视网膜病变；和
（2）彼此通信地连接的信息通信终端装置，其提供关于来自受试者的样本中权利要求1中所述的生物标志物的水平的数据；
其中，所述糖尿病性视网膜病变评估装置的控制单元包括：
1）数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本的所述生物标志物的水平的数据；
2）判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述样本中所述生物标志物的水平以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的所述生物标志物的水平的判别来计算判别值；
3）判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的糖尿病性视网膜病变的情况进行评价；以及
4）评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
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