KR20150140657A - 자간전증의 진단을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
자간전증의 진단을 위한 방법 및 조성물Info
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Abstract
본 명세서는 임신한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체의 존재를 검출하기 위한 결합제를 사용하는 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 이러한 방법 및 조성물은 자간전증의 발병을 예측, 자간전증의 진행을 모니터링, 자간전증의 퇴행을 모니터링, 자간전증에 대한 치료의 효율을 평가, 자간전증에 대한 치료를 받아야 하는 환자 하위 집단의 확인 및/또는 자간전증의 증상에 대해서 모니터링을 받아야 하는 환자 하위 집단의 확인에 유용하다.
Description
본 명세서는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로서 통합된 2013년 3월 14일 출원된 출원번호 61/785,934의 미국 특허 가출원에 대하여 우선권의 이익을 주장한다.
자간전증(preeclampsia: PEE)은 임신 중 발생하는 질병이며, 산모 및 태아 모두에서 병적상태(morbidity) 및 사망(mortality)에 이르게 할 수 있다. 이러한 상태는 미국 및 해외에서 모두 임신중인 산모에 만연하다. PEE는 전 세계 모든 출생의 5-15%에 영향을 미친다. 전세계적으로, 매년 1300만의 조기 출산의 20%가 PEE에 의한 것이다. 미국 한 국가에서는, 매년 총 500,000건의 조산 중 100,000건이 PEE의 결과이다. 전세계적으로, 매년 3,000만건의 자궁-내 성장 지연 유아 출생 중 15%(450만건)은 PEE와 관계가 있다. 전세계적으로 대략 50만명의 아기들, 및 미국 내 10,500명의 아기들이 매년 산모의 PEE로 인해 사망한다. 미국에서 PEE로 인한 사산은 대략 매년 2,200건이다. 전세계적으로 PEE가 제대로 보고되지 않는다는 점이 상기의 건 수를 더 배가시킨다.
PEE는 환자의 소변에서 단백질이 종종 관찰되는 임신-유도된 고혈압을 포함한다. 현재, PEE는 보통 임신 20주 이후에 그녀의 소변 내 과도한 단백질이 존재하는지 여부와 함께 임산부의 혈압의 상승에 의해 진단된다. PEE는 현재 고혈압, 신장 질환, 당뇨병, 또는 다른 심각한 질환의 병력이 없는 여성의 임신 후반부에 발생하는 혈압의 상승(>140/90 mm Hg) 및 소변 내 단백질(>300 mg/24시간)로 정의된다. PEE는 또한 많은 다른 이상 상태(abnormality)를 포함할 수 있다.
상기의 상태가 존재하는지 여부를 진단하기 위한 정확한 방법은 없으며, 따라서 20주 이상의 임신 이후 이러한 특정 증상을 보이는 여성들은 항상 PEE의 가능성이 고려된다. PEE는, 이의 증상이 많은 다른 질병들과 유사하고 두통, 복통, 시각 장애, 혼란, 불안, 호흡 곤란, 메스꺼움, 및 구토와 같은 증상을 포함하기 때문에 이를 진단하는 것이 특히 어렵다고 증명되어 있다. 만약 진단되지 않은 채로 남아있거나, 또는 너무 늦게 진단된 경우, 산모 및 그의 아기 모두에게 심각한 영향이 있을 수 있다. 더욱이, PEE는 경증(mild)에서 중증(severe)으로 급속도로 진행될 수 있다. 본 질병의 심각한 징후는 고혈압, 뇌손상의 위험, 신장 및 간 기능의 손상, 혈액 응고 장애, 폐부종 및 심지어 발작을 포함한다. 몇몇 여성은 종종 PEE의 발병을 식별하는 것이 어려운, 고혈압을 이미 나타내고 있다는 점이 진단을 더 복잡하게 한다. 오늘날, 증상의 발병에 앞서 이러한 잠재적으로 치명적인 상태를 진단하기 위한 효과적인 방법이 없다.
PEE는 경련 및 HELLP 증후군(용혈, 간 효소의 증가, 및 혈소판 감소)와 같은 산모 합병증으로 이어질 수 있다. PEE는 미숙아, 자궁 내 성장 제한과 같은 치명적인 합병증; 산증(acidosis), 학습 장애, 뇌성마비, 간질, 실명, 및 청각 장애와 같은 지속적인 삶의 문제, 또는 심지어 태아 사망에 이르게 할 수도 있다.
PEE 발병의 조기 발견, 진단 및/또는 예측은 수많은 PEE의 산모 및 태아에 대한 부정적인 결과를 예방 또는 지연시킬 것이다. 현재 자간전증 여성에 존재하는 초기의 분자 이상만이 진단되지만, 치료를 필요로 하는 여성을 정확 및/또는 민감하게 진단하는 방법이 여전히 요구된다. 그러므로 PEE를 겪기 쉬운 산모의 초기 발견을 위한 정확한 검사 방법에 대해 여전히 충족되지 않은 요구가 있다. 본 명세서에 기재된 본 발명은 이러한 요구를 해결하고 추가적인 이점 또한 제공한다.
본 명세서를 통틀어, 여러 참조 문헌, 공개 문헌, 특허, 및/또는 특허 출원이 인용된다. 이러한 참조 문헌, 공개 문헌, 특허, 및/또는 특허 출원은 이들의 모든 목적의 용도를 위한 전체 내용이 전체 본 명세서에 참조로서 통합된다.
본 명세서에 기재된 발명은 특히, 자간전증(PEE)의 발병 위험을 확인, PEE의 발병을 예측, PEE의 진행을 모니터링, PEE의 퇴행을 모니터링, PEE에 대한 치료를 받아야 하거나, 또는 PEE 치료를 지속해야 하는 환자 하위 집단을 확인, 임신한 여성의 PEE 치료에 대한 효율 평가, 및/또는 PEE 증상의 모니터링을 받아야 하는 환자 하위 집단을 확인하는데 유용한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 임신한 여성의 자간전증의 발병 위험을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 여성으로부터의 생물학적 시료를 결합제(binding agent)와 접촉시키고 시료 내에 존재하는 적어도 3종의 PEE 단백질에 대한 결합제의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 상기 결합제는 PEE 단백질에 10-12 내지 10-5 M의 Kd로 결합하고, 상기 시료 내의 상기 결합제의 PEE 단백질에 대한 결합은 동일한 3분기(trimester)의 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내의 PEE 단백질에 대한 결합제의 결합에 비교하여 증가한 것이고, 이에 의한 결합의 증가는 자간전증 발병의 위험을 적어도 80% 수준의 정확도로 나타내는 것인 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 결합의 증가는 자간전증 발병의 위험을 적어도 90% 수준의 정확도로 나타낸다. 다른 구체예에서, 결합의 증가는 자간전증 발병의 위험을 적어도 95% 수준의 정확도로 나타낸다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 자간전증의 발병의 예측, 자간전증의 진행을 모니터링, 자간전증의 퇴행을 모니터링, 자간전증에 대한 치료의 효율을 평가, 자간전증에 대한 치료를 받아야 하는 환자의 하위 집단을 확인 또는 자간전증의 증상의 모니터링을 받아야 하는 환자 하위 집단을 확인하기 위해 사용된다. 일 구체예에서, 적어도 3종의 PEE 단백질이 표 1에 나열된 PEE 단백질들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3종의 PEE 단백질이 표 2에 나열된 PEE 단백질들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3종의 PEE 단백질이 표 3에 나열된 PEE 단백질의 조합으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 표 1 또는 표 2로부터 선택된 또 다른 PEE 단백질에 추가적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 상기 결합제는 48종 이하의 PEE 단백질과 결합한다. 특정 구체예에서, 상기 여성은 임신 3기(third trimester of pregnancy)이다. 특정 구체예에서, 상기 여성은 임신 2기(second trimester of pregnancy)이다. 특정 구체예에서, 상기 여성은 임신 1기(first trimester of pregnancy)이다. 일부 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 비-태아 산모(non-fetal maternal) 시료이다. 일부 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 또는 태반 조직이다. 일부 구체예에서, 상기 결합제는 PEE 단백질 GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 개별적인 항체들의 혼합물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 시료 내에 존재하는 자가 항체(autoantibody)에 추가적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 결합제는 표 4 또는 표 5로부터 선택된 자가 항체에 추가적으로 결합한다. 특정 일 구체예에서, 상기 결합제는 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 PEE 자가항체에 결합하는 결합제이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 결합제는 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈(junction Plakoglobin)에 대한 PEE 자가항체와 결합한다. 본 명세서에서 제공되는 방법의 일 구체예에서, 상기 결합은 면역분석(immunoassay)에 의해 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역분석은 효소-연결된 면역흡착(enzyme-linked immunosorbent) 분석이다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 비드(bead)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 자성 입자(magnetic particle)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 자성 입자를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 단백질 결합 부위를 포함하는 핵단백질(nucleoprotein)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임신한 여성의 자간전증의 발병 위험을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 여성으로부터의 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키고, 상기 결합제의 시료 내 존재하는 PEE 자가 항체에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하는 것이고, 상기 결합제는 PEE 자가 항체에 10-12 내지 10-5 M의 Kd로 결합하는 것이고, 상기 결합제의 상기 시료 내의 PEE 자가항체에 대한 결합은 동일한 3분기의 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내의 PEE 자가항체에 대한 결합제의 결합에 비교하여 변화한 것이고, 이에 의한 결합의 변화는 자간전증 발병의 위험을 적어도 80% 수준의 정확도로 나타내는 것인 방법을 제공한다. 일 구체예에서 결합의 증가는 자간전증의 발병의 위험을 적어도 90% 수준의 정확도로 나타낸다. 다른 구체예에서, 결합의 증가는 자간전증 발병의 위험을 적어도 95% 수준의 정확도로 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 PEE 자가항체는 표 4 또는 표 5로부터 선택된 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 단백질 어레이(array)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 상기 결합제의 결합에 비교하여 증가한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 상기 결합제의 결합에 비교하여 감소한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 PEE 자가항체와 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 PEE 자가항체와 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 표 2로부터 선택된 PEE 단백질과 추가적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 GSN, THBS1 또는 PRG2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 48종 이하의 PEE 단백질과 결합한다. 일 구체예에서 상기 결합제는 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 표지(label)를 포함하는 단백질을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 표지는 형광 표지일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 여성은 임신 3기이다. 일 구체예에서, 상기 여성은 임신 2기이다. 일 구체예에서, 상기 여성은 임신 1기이다. 또 다른 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 비-태아 산모 시료이다. 또 다른 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 또는 태반 조직이다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합은 면역분석에 의해 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역분석은 효소-연결된 면역흡착 분석이다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 비드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 자성 입자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 자성 입자를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서,상기 결합제는 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 핵단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 형광 표지를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 표지된 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임신한 여성의 자간전증의 발병 위험을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 여성으로부터의 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키고, 상기 결합제의 시료 내 존재하는 하나 이상의 PEE 단백질 및 하나 이상의 PEE 자가항체에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하는 것이고, 상기 결합제는 하나 이상의 PEE 단백질에 10-12 내지 10-5 M의 Kd로 결합하는 것이고, 상기 결합제는 하나 이상의 PEE 자가 항체에 10-12 내지 10-5 M의 Kd로 결합하는 것이고, 및 상기 결합제의 상기 시료 내의 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 PEE 자가항체에 대한 결합은 동일한 3분기의 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내의 하나 이상의 PEE 단백질 및 PEE 자가 항체에 대한 결합제의 결합에 비교하여 변화한 것이고, 이에 의한 결합의 변화는 자간전증 발병의 위험을 적어도 80% 수준의 정확도로 나타내는 것인 방법을 제공한다. 일 구체예에서 결합의 증가는 자간전증의 발병의 위험을 적어도 90% 수준의 정확도로 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 결합의 증가는 자간전증 발병의 위험을 적어도 95% 수준의 정확도로 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 방법은 자간전증의 발병의 예측, 자간전증의 진행을 모니터링, 자간전증의 퇴행을 모니터링, 자간전증에 대한 치료의 효율을 평가하기 위해 추가적으로 사용된다. 일 구체예에서, 상기 PEE 자가항체는 표 4 또는 표 5로부터 선택된 것이다. 일 구체예에서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 상기 결합제의 결합에 비교하여 증가한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 상기 결합제의 결합에 비교하여 감소한다. 일 구체예에서, 상기 PEE 단백질은 표 1 또는 표 2로부터 선택된 것이다. 또 다른 구체예에서 상기 결합제는 GSN, THBS1 또는 PRG2로부터 선택된 단백질에 추가적으로 결합한다. 일 구체예에서, 상기 결합제는 하나를 초과하는 PEE 단백질에 결합한다. 특정 일 구체예에서, 상기 결합제는 GSN, THBS1 또는 PRG2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합한다. 일 구체예에서, 상기 결합제는 48종 이하의 PEE 단백질에 결합한다. 일 구체예에서, 상기 결합제는 하나를 초과하는 PEE 자가 항체에 결합한다. 특정한 일 구체예에서, 상기 결합제는 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 PEE 자가 항체에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 PEE 자가 항체와 결합한다. 일 구체예에서, 상기 결합제는 표지된 항체 및 표지된 단백질을 포함한다. 특정한 구체예에서 상기 표지는 형광 표지이다. 일 구체예에서 상기 여성은 임신 3기이다. 또 다른 구체예에서, 상기 여성은 임신 2기이다. 또 다른 구체예에서, 상기 여성은 임신 1기이다. 일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 비-태아 산모 시료이다. 일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 또는 태반 조직이다. 일 구체예에서, 상기 결합은 면역분석에 의해 수행된다. 특정 일 구체예에서, 상기 면역분석은 효소-연결된 면역흡착 분석이다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 비드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 자성 입자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 면역 분석은 자성 입자를 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CSNK1D, CUEDC1 또는 ZRANB2 자가항체에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CSNK1D, SULT4A1 또는 접합 플라코글로빈 자가항체에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 진단 분석 키트를 제공한다: (a) 임신한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 GSN, THBS1 및 PRG2를 검출하기 위한 시약; (b) 하나 이상의 GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물; 및 (c) 상기 분석의 사용을 위한 지시서.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 진단 분석 키트를 제공한다: (a) 임신한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체를 검출하기 위한 시약; (b) 하나 이상의 PEE 자가 항체에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물; 및 (c) 상기 분석의 사용을 위한 지시서. 일 구체예에서, 상기 키트의 조성물은 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2 PEE 자가 항체와 결합이 가능한 고체 표면을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트의 조성물은 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈 PEE 자가 항체와 결합이 가능한 고체 표면을 포함한다.
도 1은 일반적인 건강한 임신 여성으로부터의 혈청과 비교했을 때 혈청 단백질 중 PEE 양(ANOVA에 따른 p<0.001)이 차별화되는 48종의 PEE 단백질의 주요 성분 분석을 도시적으로 나타낸 것이다. 연구(n= 35 일반적인 임산부, n=25 PEE를 갖는 임산부) 내의 각각의 환자들에 걸친 48종의 PEE 단백질의 스펙트럼 카운트(spectral count)에 대한 상응하는 고유 값의 제곱근에 의해 조정된(scaled) 공분산 행렬의 고유 벡터들을 나타낸다. 표 1 참조.
도 2a, 2b는 PEE의 높게 예측되는 8종 단백질에 대한 산포도(scatter plot)를 나타낸다. 상기 8종 PEE 단백질(THBS1, PRG2, GSN, ITIH4, HPX, TF, APCS 및 F5)은 도 1의 48종 PEE 단백질의 하위 집합이다. 건강 시료 및 PEE 시료로부터의 각각의 단백질에 대한 평균 스펙트럼 카운트 값과 SEM이 표시되어 있다. 상기 8종 단백질의 3종의 무작위 조합이 평균 AUC 0.95이상을 나타내었다. 표 2 참조.
도 3은 3분기에 걸쳐 유사한 패턴을 나타내는 단백질 그룹을 확인하기 위한 바이오마커 패턴 분석을 위한 단백질 발현 도식(scheme)이다. 확인된 단백질 패턴은 표 1 및 2에서 "바이오 마커 패턴 분석"이라고 표시된 세로단에 상응한다.
도 4a 내지 도 4l은 표 1의 48종 PEE 단백질 세트에 대한 각각의 환자에 대한 개별적인 스펙트럼 카운트의 산포도를 나타낸다; 각각의 단백질에 대한 평균 스펙트럼 카운트와 SEM이 표시되어 있다.
도 5는 건강한 임신 여성 및 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 다르게 측정되는 것으로 나타나는 75종 PEE 자가 항체의, qFDR<0.05의 p-값으로 조정된 오류 발견율(false discovery rate) 및 1.5의 정상 및 PEE 사이의 최소 배수 변화 차이를 갖는, ANOVA에 따른 주요 성분 분석을 도시적으로 나타낸 것이다. 표 4 참조.
도 6a 내지 6c는 75종 PEE 자가 항체 집단(도 5 및 표 5)으로부터의 10종의 PEE 자가 항체의 하위 집단의 각각의 환자들에 대한 개별적인 평균 형광 강도(MFI) 카운트의 산포도를 나타내고, 이는 자간전증이거나, 또는 자간전증이 아닌 임신한 여성으로부터 채취된 혈청 내에서 현저하게 다르다(qFDR<0.05; 배수 변화>1.5). 25명의 건강한 임신 여성(정상) 및 20명의 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 각각의 자가 항체의 평균 MFI 카운트와 SEM이 표시되어 있다. 각각의 그래프의 왼쪽 상에 위치한 밝은 회색 세로 막대는 임신 1기(삼각형) 또는 임신 3기(사각형)의 정상 임신 여성을 나타낸다. 각각의 그래프의 오른쪽 상에 위치한 어두운 회색 그래프는 임신 3기의 PEE 여성을 나타낸다. 임신 1기의 정상 임신 여성에서 측정될 수 있고, 임신 3기와 최소로 중첩되며 PEE에서 정상 임신보다 배수 변화 1.5를 초과하는 현저한(qFDR<0.05) 증가 또는 감소를 나타내는 바이오마커가 선택되었다.
도 7a 내지 도 7c는 75종 PEE 자가 항체들로부터의 가장 현저한 10종의 자가 항체의 각각의 환자들에 대한 평균 형광 강도(MFI) 카운트의 산포도를 나타내고, 이는 자간전증이거나, 또는 자간전증이 아닌 임신한 여성으로부터 채취된 혈청 내에서 현저하게 다르다(qFDR<0.05; 배수 변화>1.5); 25명의 건강한 임신 여성 및 20명의 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 각각의 자가 항체의 평균 MFI 카운트와 각각의 SEM이 표시되어 있다.
도 2a, 2b는 PEE의 높게 예측되는 8종 단백질에 대한 산포도(scatter plot)를 나타낸다. 상기 8종 PEE 단백질(THBS1, PRG2, GSN, ITIH4, HPX, TF, APCS 및 F5)은 도 1의 48종 PEE 단백질의 하위 집합이다. 건강 시료 및 PEE 시료로부터의 각각의 단백질에 대한 평균 스펙트럼 카운트 값과 SEM이 표시되어 있다. 상기 8종 단백질의 3종의 무작위 조합이 평균 AUC 0.95이상을 나타내었다. 표 2 참조.
도 3은 3분기에 걸쳐 유사한 패턴을 나타내는 단백질 그룹을 확인하기 위한 바이오마커 패턴 분석을 위한 단백질 발현 도식(scheme)이다. 확인된 단백질 패턴은 표 1 및 2에서 "바이오 마커 패턴 분석"이라고 표시된 세로단에 상응한다.
도 4a 내지 도 4l은 표 1의 48종 PEE 단백질 세트에 대한 각각의 환자에 대한 개별적인 스펙트럼 카운트의 산포도를 나타낸다; 각각의 단백질에 대한 평균 스펙트럼 카운트와 SEM이 표시되어 있다.
도 5는 건강한 임신 여성 및 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 다르게 측정되는 것으로 나타나는 75종 PEE 자가 항체의, qFDR<0.05의 p-값으로 조정된 오류 발견율(false discovery rate) 및 1.5의 정상 및 PEE 사이의 최소 배수 변화 차이를 갖는, ANOVA에 따른 주요 성분 분석을 도시적으로 나타낸 것이다. 표 4 참조.
도 6a 내지 6c는 75종 PEE 자가 항체 집단(도 5 및 표 5)으로부터의 10종의 PEE 자가 항체의 하위 집단의 각각의 환자들에 대한 개별적인 평균 형광 강도(MFI) 카운트의 산포도를 나타내고, 이는 자간전증이거나, 또는 자간전증이 아닌 임신한 여성으로부터 채취된 혈청 내에서 현저하게 다르다(qFDR<0.05; 배수 변화>1.5). 25명의 건강한 임신 여성(정상) 및 20명의 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 각각의 자가 항체의 평균 MFI 카운트와 SEM이 표시되어 있다. 각각의 그래프의 왼쪽 상에 위치한 밝은 회색 세로 막대는 임신 1기(삼각형) 또는 임신 3기(사각형)의 정상 임신 여성을 나타낸다. 각각의 그래프의 오른쪽 상에 위치한 어두운 회색 그래프는 임신 3기의 PEE 여성을 나타낸다. 임신 1기의 정상 임신 여성에서 측정될 수 있고, 임신 3기와 최소로 중첩되며 PEE에서 정상 임신보다 배수 변화 1.5를 초과하는 현저한(qFDR<0.05) 증가 또는 감소를 나타내는 바이오마커가 선택되었다.
도 7a 내지 도 7c는 75종 PEE 자가 항체들로부터의 가장 현저한 10종의 자가 항체의 각각의 환자들에 대한 평균 형광 강도(MFI) 카운트의 산포도를 나타내고, 이는 자간전증이거나, 또는 자간전증이 아닌 임신한 여성으로부터 채취된 혈청 내에서 현저하게 다르다(qFDR<0.05; 배수 변화>1.5); 25명의 건강한 임신 여성 및 20명의 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 각각의 자가 항체의 평균 MFI 카운트와 각각의 SEM이 표시되어 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명은 특히, 자간전증(PEE)의 발병 위험을 확인, PEE의 발병을 예측, PEE의 진행을 모니터링, PEE의 퇴행을 모니터링, PEE에 대한 치료를 받아야 하거나, 또는 PEE 치료를 지속해야 하는 환자 하위 집단을 확인, 임신한 여성의 PEE 치료에 대한 효율 평가, 및/또는 PEE 증상의 모니터링을 받아야 하는 환자 하위 집단을 확인하는데 유용한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다.
하기에 더 자세하게 기재된 바와 같이, 특정 펩티드, 단백질 및 자가 항체 바이오마커는 나중에 PEE가 발병할 수도 있는 1기 내지 2기 임신 사이의 임신한 여성을 정확하게 확인하는데 유용할 수 있다고 확인되었다. 이러한 마커들은 PEE 및 유사한 증상을 보이는 다른 상태들 사이의 진단적 구분을 가능하게 할 수 있다. PEE의 위험이 매우 큰 환자의 조기 확인은 아기와 산모의 생명을 지키고 그들의 복지에 도움을 주기 위한 상당히 가치있는 것일 수 있다.
정의
본 명세서를 해석하기 위한 목적으로, 하기의 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우에 단수로 사용된 용어들은 또한 복수를 포함할 것이고 이의 반대의 경우도 마찬가지이다.
본 명세서에 사용된, "자간전증(preeclampsia)" 또는 "PEE"는 임신한 여성의 고혈압 발병(임신 전 그녀의 혈압에 상대적) 및/또는 소변 내 단백질이 발생한 때의 상태를 의미한다. 많은 경우에, 고혈압 및/또는 소변 내 단백질은 임신 20주(임신 2기 말 또는 임신 3기) 이후에 발생한다. 자간전증의 증상은 높은 혈압(고혈압), 소변 내 과도한 단백질(단백뇨), 두통, 시야 변화(일시적인 시야 상실, 흐린 시야, 광 민감성 포함), 복통(상부 복통과 같은, 즉 오른쪽 갈비뼈 아래), 메스꺼움, 구토, 현기증, 배뇨량 감소, 갑작스런 체중 증가, 시각적 장애, 즉, 빛에 대한 과민성, 흐린 시야, 깜박이는 점 또는 무리(aura), 혼란, 불안, 및/또는 호흡 곤란을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, PEE의 심각한 징후는 고혈압, 뇌손상의 위험, 손상된 신장 및 간의 기능, 혈액 응고 장애, 폐부종 및/또는 발작을 포함하나 이에 한정되지 않는다. PEE의 다른 증상들은 본 명세서에 기재되어 있으며, 치료 의사들을 포함하는 당업자에게 알려져 있다.
PEE 발병의 각각의 "위험(at risk)"은 본 명세서에 기재된 치료 방법에 앞서 검출 가능한 질병 또는 질병의 증상을 갖거나, 갖지 않을 수 있고, 검출 가능한 질병 또는 질병의 증상을 보이거나, 보이지 않을 수 있다. "위험"은 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 바와 같은, PEE의 발병과 관련 있는 측정 가능한 파라미터인 개별적인 하나 이상의 위험 요소를 의미한다. 이러한 하나 이상의 위험 요소를 가진 개체들은 이러한 하나 이상의 위험 요소를 가지지 않은 개체보다 PEE가 발병할 가능성이 높다. 예를 들면, 일부 구체예에서, PEE가 발병할 "위험"에 있는 개체는 표 1 또는 표 2에 나타나 있는 하나 이상의 PEE 단백질의 발현 수준의 변화를 보인다.
"개인(individual)"은 "환자(patient)"일 수 있다. "환자"는, 치료 의사의 관리 하에 있는 "개인"을 의미한다. 일 구체예에서, 환자는 여성이다. 또 다른 구체예에서, 환자는 PEE로 진단을 받지 않은 여성이다. 또 다른 구체예에서, 환자는 PEE로 진단을 받았으나, PEE를 해결하기 위한 어떤 치료도 받지 않은 여성이다.
"환자 하위 집단(patient sub-population)" 및 본 명세서에 사용된 이의 문법적 변형들은 환자가 속한 넓은 질병 카테고리 내에서 그 환자 집단을 다른 자들과 구분 짓는 하나 이상의 구별되고 측정 가능한 및/또는 확인 가능한 특징을 가지는 것으로 특징화되는 환자 집단을 의미한다. 이러한 특징들은 PEE 발병의 위험에 있는 것이 특징인 것으로 본 명세서에 기재된 PEE 단백질 및/또는 자가 항체 프로필을 갖는 것을 포함하고, 선택적으로는 본 명세서에 기재되고 치료 의사를 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 증상의 조합 내에 속하는 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물학적 시료(biological sample)"는 특징화 및/또는 확인되어야 하는, 예를 들면 물리, 생화학, 화학 및/또는 생리적 특징에 기반하여 확인되어야 하는 세포적 및/또는 다른 분자적 실체를 포함하는 개인으로부터 얻거나 또는 유래된 조성물을 의미한다. 일부 구체예에서, 생물학적 시료는 산모로부터의 혈액, 혈청, 생물학적 유체 또는 조직이다. 다른 구체예에서, 생물학적 시료는 태아로부터의 일부 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "예측(predicting 또는 prediction)"은 100%의 확실성으로 일어날 사건을 의미하는 것이 아니다. 그 대신, 이는 일어나지 않는 것보다 일어날 가능성이 높은 사건을 의미한다. "예측을 하다(predict 또는 make a prediction)"의 행위는 일어나지 않는 것보다 일어날 가능성이 높은 사건의 가능성의 결정을 포함할 수 있다.
"연관시키다(correlate)" 또는 "연관있는(correlating)"은 어떤 방법으로든 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 그 성과 및/또는 결과를 두 번째 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교한 것을 의미한다. 예를 들면, 특정인은 두 번째 프로토콜을 수행하는 중 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있으며, 및/또는 특정인은 두 번째 분석 또는 프로토콜이 수행되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "진단(diagnosis)"은 의료적 또는 병리적 상태의 확인 또는 분류를 의미하기 위해 사용된다. 예를 들면, "진단"은 PEE의 확인을 의미할 수 있고, "진단"은 또한 PEE의 중증도(severity)의 분류를 의미할 수 있다. PEE의 진단은 당업자(예를 들면, 산과의사)가 사용할 임의의 프로토콜, 예를 들면 "Pre-eclampsia: Etiology and Clinical Practice" (F. Lyall, Ed. and M. Belfort, Ed.), Cambridge University Press (2007) 및/또는 "Chesley's Hypertensive Disorders in Pregnancy, 3rd edition (M. Lindheimer, J. Roberts, F.G.Cunningham, Eds.), Elsevier (2009)에 기재되어 있는 것에 따라 수행될 수 있다.
용어 "보조 진단(aiding diagnosis)"은 PEE의 증상 또는 상태의 특정 형태의 존재, 정도 또는 다른 성질과 관련하여 임상적 결정을 내리는데 도움을 주는 방법을 의미하기 위해 사용된다. 예를 들면, PEE의 보조 진단의 방법은 개인으로부터의 생물학적 시료 내 하나 이상의 PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체의 양을 측정하거나 또는 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
용어 "예후(prognosis)"는 PEE의 발병(PEE의 재발 포함)의 가능성의 예측을 의미하기 위해 사용된다. 본 발명의 상기 예측 방법은 임의의 특정 환자에게 가장 적절한 치료 방법을 선택하여 치료 결정을 내리기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 예측 방법은 환자의 PEE 발병 가능성이 높은지, PEE가 재발하는지, 및/또는 PEE의 증상이 악화되는지 여부에 대한 예측 및/또는 진단을 보조하는 유용한 도구이다.
"치료(treatment)"는 개인의 자연적 과정(course)을 바꾸기 위한 시도 내의 임상적 개입(intervention)을 의미하고 임상적 진단 또는 예후 과정 전, 도중, 또는 후에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 PEE 또는 이의 상태 또는 증상의 발생 또는 재발을 예방, PEE의 상태 또는 증상을 완화, 임의의 PEE의 직접적 또는 간접적인 병리학적 영향을 감소, PEE 진행 또는 중증도의 속도를 감소, 및/또는 PEE의 상태 또는 증상의 개선 또는 증상 완화(palliating)을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 PEE 발병의 위험이 있다고 확인된 환자 하위 집단에게 사용된다. 일부 경우, 본 발명의 방법 및 조성물은 PEE의 발병을 지연시키기 위한 시도로서 유용하다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 측면 및 구체예는 "구성되는(consisting)" 및/또는 "필수적으로 구성되는(consisting essentially of)" 측면 및 구체예를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 용어 "펩티드(peptide)"는 한 아미노산의 카르복시기와 다른 아미노산의 알파 아미노기로 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 자연적 또는 합성적 분자를 의미하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 길이에 제한되지 않고, 또한 "펩티드"는 긴 폴리펩티드 및/또는 단백질의 부분일 수 있고, 또는 긴 폴리핍티드/단백질 그 자체일 수 있다. 용어 펩티드는 단백질 및/또는 폴리펩티드와 상호 교체적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "검출(detect)"은, 예를 들면 단백질, 펩티드 및 다른 생물학적 분자와 같은 하나 이상의 바이오마커의 탐지되지 않는(undetectable), 낮은, 중간의, 또는 높은 혈청 농도의 정량적 측정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "정량화(quantify 및 quantification)"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 상대적 또는 절대적으로 시료 내 물질(예를 들어, 바이오마커)의 양(quantity) 또는 풍부도(abundance)를 결정하는 단계를 의미한다.
본 명세서의 수치 또는 파라미터의 "약(about)"의 언급은 그 수치나 파라미터 그 자체(per se)를 가리키는 구체예를 포함(및 설명)한다. 예를 들면, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 용어 "약"은 바람직한 결과에 대한 영향 없이 주어진 수치가 "약간 위" 또는 "약간 아래"인 끝일 수도 있음을 제공하여 수적 범위의 끝에 유연함을 제공하기 위해 사용된다. 농도, 양(amount), 및 다른 수적 데이터가 본 명세서에 범위 형식으로 표현 또는 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식은 단지 편리하고 간결함을 위해 사용된 것이고, 따라서 명시적으로 그 범위의 한계로서 언급된 수적 수치뿐만 아니라, 마치 각각의 수적 수치 및 하위 범위가 명시적으로 언급된 것과 같은 범위 내에 포함된 모든 개별적 수적 수치 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단일("a", "an" 및 "the") 형식은 그 내용이 명시적으로 그렇지 않음을 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다.
"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 그 뒤에 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 이 기재는 그 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.
일반적 기술
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 실행은, 다르게 표시되지 않는 한, 당업계 내의 단백질 생물학, 단백질 화학, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술들을 채용할 것이다. 이러한 기술들은 "Pre-eclampsia: Etiology and Clinical Practice" (F. Lyall, Ed. and M. Belfort, Ed.), Cambridge University Press (2007); "Chesley's Hypertensive Disorders in Pregnancy, 3rd edition (M. Lindheimer, J. Roberts, F.G. Cunningham, Eds.), Elsevier (2009);" "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); 및 Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)과 같은 문헌들 내에서 완전하게 설명된다.
임신한 여성으로부터 생물학적 시료 수집
일반적으로, 생물학적 시료는 임신한 여성으로부터 수집된다. 생물학적 시료의 모든 형태가 수집될 수 있고, 혈청, 혈장, 혈액, 소변, 점액, 타액, 뇌척수액, 양수, 활액, 자궁 경부 질 내 유체, 세척액(lavage fluid), 태반, 다른 주변 조직, 조직 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 임신한 여성으로부터 수집된 생물학적 시료는 오직 비-태아 조직만을 포함한다. 다른 구체예에서, 일부 태아 조직이 산모의 비-태아 조직과 함께 수집된다.
본 명세서에 기재된 방법을 이용한 여성의 PEE 검사는 PEE를 나타내는 단백질, 펩티드, 및 자가 항체와 같은 바이오마커의 정량화가 가능한 임신 중 어느 때라도 시행할 수 있다. 바이오마커는 임신의 1기, 2기, 3기 동안 수집 및 검사될 수 있다. 일 구체예에서 바이오마커는 약 4주 내지 약 6주의 임신 기간에서; 약 6주 내지 약 8주의 임신 기간에서; 약 8주 내지 약 10주의 임신 기간에서; 약 10주 내지 약 12주의 임신 기간에서; 약 12주 내지 약 14주의 임신 기간에서; 약 14주 내지 약 16주의 임신 기간에서; 약 16주 내지 약 18주의 임신 기간에서; 약 18주 내지 약 20주의 임신 기간에서; 약 20주 내지 약 22주의 임신 기간에서; 약 22주 내지 약 24주의 임신 기간에서; 약 24주 내지 약 26주의 임신 기간에서; 약 26주 내지 약 28주의 임신 기간에서; 약 28주 내지 약 30주의 임신 기간에서; 또는 약 30주 내지 그 초과의 임신 기간에서 수집 및 검사될 수 있다. 이러한 범위는 이와 같은 검사가 임신의 특정 지점에서 수행될 수 있다는 한정으로서 보아서는 안된다. 오히려 이러한 범위는 이와 같은 검사가 대부분의 임신 여성에게 수행되기 쉬운 임신 주기의 기간을 증명하기 위해 제공된 것이다.
PEE 단백질 및 펩티드의 확인 및 생물학적 시료의 검사
PEE에 대한 임신 여성의 검사를 위한 방법은 PEE가 발병하지 않은 건강한 임신 여성에 비교하여 생물학적 시료 내에 존재하는 PEE와 관련 있는 하나 이상의 펩티드, 단백질, 및/또는 자가 항체의 농도, 발현, 세포 내 전위(translocation) 또는 활성의 차이를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 추가적으로 기재된 바와 같은, 다양한 시스템 및 방법이 상기 펩티드, 단백질 또는 자가 항체의 확인, 특징화, 정량화를 위해 사용될 수 있다. 본 명세서는 제한 없는 시스템 및 방법들을 제공한다.
일 구체예에서, 질량 분석법이 PEE를 갖거나 또는 PEE의 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 임신 여성 및 임신한 건강한 여성 사이에서 다르게 발현되는 펩티드 또는 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 여러 생물학적 시료로부터의 여러 질량 분석들을 비교하고, 비 생물학적 변동(non-biological variability)에 대한 보정을 위한 접근법(approach)을 이용한 후 정량적으로 달라지는 질량 이온을 특정하고(locating), 분리하고, 및 관심있는 단백질 또는 펩티드 바이오마커를 특징화하는 것이 사용될 수 있다..
또 다른 구체예에서, 모세관 액체 크로마토그래피가 PEE를 갖거나 또는 PEE의 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 임신 여성 및 임신한 건강한 여성 사이에서 다르게 발현되는 펩티드 또는 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 다른 기술들이 PEE 단백질 및/또는 펩티드를 확인하기 위해 사용될 수 있음을 인식할 것이다. PEE에 대한 진단 마커로서 이들을 사용할 수 있게 하는 PEE 단백질 및/또는 펩티드의 특징은 하기에 설명되어 있다.
다르게 발현되는 단백질 또는 펩티드는 PEE 및 건강한 임산부 사이에서 다르게 발현되는 단백질을 확인하기 위한 분위수(quantile) 정규화(normalization) 후 일원- 또는 다중 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석될 수 있다. 예로서, 도 1 및 표 1을 참조한다. 일 구체예에서, 0.05 미만의 오류 발견율(false discovery rate)을 갖는 p-값을 갖는, 배수 변화가 1.5를 초과하는 상향 조절된 단백질, 또는 배수 변화가 1.5를 초과하는 하향 조절된 단백질은 중요한 것으로 여겨질 수 있고 예측 모델을 구축하는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 0.05 미만의 오류 발견율을 갖는 p-값을 갖는, 배수 변화가 2를 초과하는 상향 조절된 단백질, 또는 배수 변화가 2를 초과하는 하향 조절된 단백질은 중요한 것으로 여겨질 수 있고 예측 모델을 구축하는데 사용될 수 있다. 소프트웨어의 다양한 형태가 통계 분석을 위해 사용될 수 있다. 이러한 소프트웨어의 일 예시는 Partek Genomics Suite이다. 단백질 또는 펩티드의 PEE의 검출 및/또는 예측을 위한 강력한 모델을 선별하기 위한, 하기의 분류 모델에 따른 통계적 분석을 수행할 수 있다: K-근접 이웃(K-nearest neighbor), 최단 중심(nearest centroid), 판별 분석(discriminate analysis), 지지 벡터 기계(support vector machine), 부분 최소 자승법(partial least squares), 사선 판별 분석(diagonal discriminant analysis), 랜덤 포레스트(random forest), 로지스틱 회귀분석(logistic regression). 실시예에서 더욱 자세히 설명된 바와 같이, 복수의 모델에서 불과 3종의 단백질로 곡선 아래 면적(area under the curve: AUC)과 함께 수신자 조작 특성 곡선(receiver operator characteristic curve: ROC)를 산출해낼 수 있다. 1.0의 AUC는 그 코호트에서 100% 정확도를 의미한다. 다양한 구체예에서, ROC 곡선 아래의 면적은 PEE의 검출의 정확성, PEE의 진단의 정확성, PEE의 예측의 정확성, PEE의 발병의 예측의 정확성, 및 그와 유사한 것들의 통계적 측정치일 수 있다.
이러한 방법론을 이용하여, PEE와 연관된 것으로 발견된 예시의 펩티드 및/또는 단백질이 실시예 1 및 표 1에 기재되어 있다. 이러한 펩티드 및/또는 단백질은 상호 교환적으로 "PEE 단백질" 또는 "PEE 펩티드" 또는 "PEE 폴리펩티드"로 언급될 수 있고 PEE의 진단, 진단의 보조, 및/또는 치료에 유용하다. 이러한 PEE 단백질은 PEE의 치료를 위한 환자 하위 집단을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
생물학적 시료의 검사 및 PEE 자가 항체의 확인
임신한 여성으로부터 채취된 생물학적 시료는 PEE(즉, PEE 자가 항체)를 갖거나 또는 PEE가 발병할 임신 여성을 평가하는데 사용될 수 있는 자가 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 자가 항체를 측정하는 다양한 기술들이 당업자에게 알려져 있다. 비-제한적 방법 중의 하나는 건강한 임신 여성 및 PEE 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 다양한 자가 항체들을 측정하기 위해 ProtoArray® 인간 단백질 마이크로어레이 V5(마이크로어레이)(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하는 것이다. 건강한 임산부 및 PEE 임산부로부터의 시료 내 각각의 자가 항체의 양을 나타내는 상대적인 형광 단위가 Partek's Genomics Suite(Partek Inc, St.Louis, MO)와 같은 임의의 형태의 분석 소프트웨어에 업로드되고 이를 사용하여 분석될 수 있다. 그 데이터는 분위수 정규화될 수 있고, 그 후 PEE 및 건강한 임산부 사이에 다르게 발현되는 자가 항체를 확인하기 위한 일원 또는 다중 분산 분석(ANOVA)이 따른다.
예시적인 PEE 및 건강한 임산부 사이에서 다르게 발현되는 자가 항체들이 표 4, 표 5 및 도 5-7에 나타나있다. 일 구체예에서, 일 구체예에서, 0.05 미만의 오류 발견율(false discovery rate)을 갖는 p-값을 갖는, 배수 변화가 1.5를 초과하는 상향 조절된 자가 항체, 또는 배수 변화가 1.5를 초과하는 하향 조절된 자가 항체는 중요한 것으로 여겨질 수 있고 예측 모델을 구축하는데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 적어도 약 8종의 항체가 PEE 및 건강한 임산부 시료 사이의 변화의 70%의 설명을 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 약 15종의 항체가 시료 사이 차이의 총 95%의 설명을 제공할 수 있다. 본 명세서에 개시된 PEE 자가 항체는 본 명세서에 기재된 다른 용도뿐 아니라 PEE 발병 위험의 평가, PEE 발명의 모니터링 및 치료를 위한 환자의 선별의 다양한 방법에 사용될 수 있다.
PEE 검출 또는 자간전증 발병의 위험을 진단하기 위한 PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체를 이용한 결합제 및 방법
본 발명의 결합제는
PEE 발병에 대한 위험이 있다고 의심되는 임신 여성, 이미 PEE를 겪는 임신 여성, 또는 건강한 임신 여성으로부터 채취된 생물학적 시료 내에 존재하는 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 결합제는 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 펩티드, 하나 이상의 항체, 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 핵단백질일 수 있다. 상기 결합제는 단백질, 펩티드, 및 자가 항체에 대한 복수의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 결합제는 임신 여성에 PEE가 발병할 것인지 또는 임신 여성이 PEE를 가지는지, 또는 PEE로부터 회복하고 있는지 여부를 예측할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 확인하기 위해 사용된다. 이러한 경우에, 상기 결합제는 PEE 또는 PEE 상태의 진단에 도움을 주는데 사용될 수 있다.
본 발명의 결합제는 당업자에게 알려진 방법으로 표지되거나 변형될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 형광 표지, 면역표지, 자성 표지, DNA 표지, 저분자 표지, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
단백질 결합제는 일부 방법으로 표지되거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면 단백질 결합제는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 형광 표지, 면역표지, 자성 표지, DNA 표지, 저분자 표지, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
펩티드 결합제는 일부 방법으로 표지되거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면 펩티드 결합제는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 형광 표지, 면역표지, 자성 표지, DNA 표지, 저분자 표지, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
핵산 결합제는 일부 방법으로 표지되거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면 핵산 결합제는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 형광 표지, 면역표지, 자성 표지, DNA 표지, 저분자 표지, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
핵단백질 결합제는 일부 방법으로 표지되거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면 핵단백질 결합제는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 형광 표지, 면역표지, 자성 표지, DNA 표지, 저분자 표지, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 결합제는 하나 이상의 단백질, 펩티드, 또는 자가 항체와 10-15M, 10-14M, 10-13M, 10-12M, 10-11M, 10-10M, 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M, 10-5M, 10-4M, 10-3M, 또는 10-2M의 해리 상수(Kd)로 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 결합제는 하나 이상의 단백질, 펩티드, 또는 자가 항체와 10-12M to 10-5M, 10-10M to 10-5M, 10-8M to 10-5M, 10-7M to 10-5M, 10-10M to 10-8M, 10-9M to 10-7M, 또는 10-8M 내지 10-6M의 해리 상수(Kd) 범위로 결합할 수 있다.
특정 일 구체예에서 상기 결합제는 1 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체와 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 2 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체와 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 3 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체와 결합할 수 있다. 관련있는 구체예에서, 상기 결합제는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체, 그리고 최대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체와 결합할 수 있다. 특정 일 구체예에서, 상기 결합제는 최대 48종의 PEE 단백질 및/또는 펩티드와 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 단백질, 펩티드, 및 자가 항체의 조합 중 임의의 조합과 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 PEE 단백질 및 PEE 자가 항체는 PEE 발병의 위험에 있는 개인의 진단에 있어서 진단 또는 보조를 위해 사용될 수 있다. PEE 단백질 및 PEE 자가 항체는 또한 자간전증 발병의 위험 확인, PEE 발병의 예측, PEE 진행의 모니터링, PEE 감퇴의 모니터링, PEE 치료를 받아야 하거나 또는 PEE 치료를 계속해야 하는 환자의 하위 집단의 확인, 임신한 여성의 PEE 치료의 효율 평가, 및/또는 PEE 증상을 모니터링 해야하는 환자의 하위 집단의 확인을 위해 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 결합제는 항체, 자가 항체, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 저분자, 및 이들과 유사한 것들로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 결합제는 형광 표지, 또는 형광 면역표지를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 결합제는 자성 표지 또는 자성 면역표지를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 결합제는 방사성 표지 또는 자성 방사성 표지를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 올리고뉴클레오티드 또는 저분자로 표지된다.
일 구체예에서 결합제는 면역 분석법(immune assay)을 포함한다. 면역 분석법은 PEE가 발병할 위험이 있다고 의심되는 임신 여성 및 건강한 임신 여성으로부터 채취된 생물학적 시료에 존재하는 단백질 또는 펩티드를 검출, 확인 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 면역 분석법은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 임의의 면역 분석법은 형광, 자성, 또는 방사성 면역표지를 통합할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 결합제는 진단 분석법(diagnostic array)을 포함한다. 진단 분석법은 PEE가 발병할 위험이 있다고 의심되는 임신 여성 및 건강한 임신 여성으로부터 채취된 생물학적 시료에 존재하는 단백질 또는 펩티드를 검출, 확인 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다. 상기 분석법은 기질 상 알려진 영역인 별개의 다수를 포함하는 단백질 또는 항체-코팅된 물질을 포함할 수 있다. 상기 분석법은 다공성 또는 비-다공성일 수 있고, 크기가 다양할 수 있는 입자, 나노입자, 비드, 나노비드 또는 다른 고체 표면을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 진단 분석법은 형광 입자를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 진단 분석법은 형광 입자를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 진단 분석법은 자성 입자를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서 상기 진단 분석법은 자성 입자를 포함한다.
관련 있는 구체예에서, 본 발명의 결합제는 입자, 나노입자, 비드, 나노비드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 나노입자, 비드, 또는 나노비드는 형광적으로 표지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노입자, 비드, 또는 나노비드는 자성적으로 표지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노입자, 비드, 또는 나노비드는 방사성 표지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노입자, 비드, 또는 나노비드는 올리고뉴클레오티드 또는 저분자로 표지된다.
또 다른 구체예에서, 결합제는 자성-기반 단백질 분석 요소 및/또는 나노태그(nanotag)를 포함한다. 이러한 구체예에서, 자성 나노태그를 사용하는 자성 다중 단백질 분석(magnetic multiplex protein assay)이 생물학적 시료 내 존재하는 단백질 또는 펩티드를 검출, 확인, 정량화하기 위해 사용된다(Osterfeld et al., “Multiplex Protein Assays Based on Real-Time Magnetic Nanotag Sensing,” PNAS, 105, 20637-20640 (published online Dec.12, 2008). 예를 들면, MagArray 단백질 칩이 진단 분석법에 활용될 수 있다. 본 구체예에서, 단백질 또는 펩티드 검출은 3단계로 수행된다. 첫째로, 표면 상의 프로브가 특이적으로 시료 내의 단백질 또는 펩티드에 결합한다. 둘째로, 나노태그-표지된 항체가 결합된 단백질 또는 펩티드에 결합하여, 샌드위치-유사 구조를 형성한다. 마지막으로, 외부 자기장이 칩에 적용되고 나노태그에 의해 생성된 누설 자기장(stray magnetic field)이 전기적으로 측정되어 시료 내 표적 분자의 존재를 결정한다.
관련 있는 구체예에서, 본 발명의 결합제는 나노태그를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 나노태그는 형광적으로 표지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노태그는 자성적으로 표지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노태그는 방사성 표지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노태그는 올리그뉴클레오티드 또는 저분자로 표지된다.
또 다른 구체예에서, 카르복시 비드 세트가 관심 있는 단백질, 펩티를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 여기에서, 모든 단백질 또는 펩티드는 안정한 마이크로 비드 표면에 공유적으로 부착될 수 있으며 이후 형광 표지 및 형광 강도 측정이 수행된다. Illumina의 VeraCode Technology(Illumina Inc., Hayward, CA)는 표준 96-웰 마이크로플레이트에서 단일 반응의 다양한 조합에서 최대 48개의 면역분석 수행을 가능케한다.
또 다른 구체예에서, 펩티드 및 자가 항체는 전기화학발광(electrochemiluminesense) ELISA에 의해 측정될 수 있다. Meso Scale Discovery(MSD, Gaithersburg, MD)의 다중 전기화학발광 ELISA 플랫폼이
맞춤 설계가 가능하고, 동일한 웰 내에서 여러 분석물을 동시에 측정할 수 있는 높은 처리량을 가진 다가 ELISA이다.
또 다른 구체예에서, 기능적 단백질-기반 분석이 관심 있는 단백질, 펩티드, 또는 자가 항체 바이오마커의 활성, 결합, 세포 내 전위, 또는 번역 후 변형(post-translational processing)의 차이를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석은 경쟁적 결합 분석, 웨스턴 블롯 면역블롯 분석, 리포솜 면역 분석, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 특정 일 구체예에서, 그리고 단지 예시로서, Invitrogen's ProtoArray® Microarray와 같은 분석법이 관심 있는 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 분석법은 PEE에 걸릴 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 혈청 또는 소변과 같은 생물학적 시료의 프로파일링을 가능케 하고, 생물학적으로 관련된 단백질 키나제 기질, 저분자 결합 짝, 유비퀴틴 리가제 기질, 및 항체의 단백질 상호작용자(interactor)를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 스펙트럼 이미징이 단백질들의 특성의 차이점을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
상기 절에 기재된 바와 같이, PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체는 기능적 파라미터를 갖는 결합제에 의해 검출될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 PEE 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체를 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이는 PEE의 발병, PEE의 발병 위험의 에측, PEE의 진단, 또는 PEE의 증상의 중증도의 결정에 유용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이 PEE 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체를 사용하는 것의 한 이점은 자간전증 발병 위험의 결정이 높은 수준의 정확도로 이루어질 수 있다는 것이다. 정확도는 민감도(자간전증 양성 환자가 정확하게 확인되는 정확도) 및 특이도(자간전증 음성 환자가 정확하게 확인되는 정확도)로서 묘사될 수 있다; 각각 양성 예측도(PPV) 및 음성 예측도(NPV).
본 명세서에 기재된 구체예에서, PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체 또는 펩티드/단백질 및 자가 항체 모두의 조합을 이용한 PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성의 PEE의 발병 위험의 결정은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 높은 정확도를 가진다. 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 정확도를 제공한다. 또한, 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 정확도를 제공한다.
본 명세서에 제공된 구체예에서, PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체 또는 펩티드/단백질 및 자가 항체 모두의 조합을 이용한 PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성의 PEE 발병의 위험의 결정은 높은 민감도를 가진다. 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 민감도를 제공한다. 또한, 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 민감도를 제공한다.
더욱이, 본 명세서에 제공된 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체 바이오마커의 분석은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 매우 특이적이다. 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 특이도를 제공한다. 또한, 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 특이도를 제공한다.
더욱이, 본 명세서에 제공된 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체 바이오마커의 분석은 PEE의 검출 또는 예측에 대하여 양성 예측값(PPV; 실제로 양성/정확한 진단인 양성 검사 결과의 비율)을 갖는다. 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 PPV를 제공한다. 또한 본 명세서에 제공된 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체 바이오마커의 분석은 PEE의 검출 또는 예측에 대하여 음성 예측값(PPV; 정확하게 진단된 음성 검사 결과를 갖는 환자의 비율)을 갖는다. 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 PEE의 검출 또는 예측에 있어서 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 NPV를 제공한다.
본 명세서에 제공된 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 바이오 마커의 분석은 곡선 아래 면적(AUC)를 제공하고, 이는 PEE의 검출 가능성의 통계적 측정 또는 PEE 발병의 예측 가능성의 통계적 측정이다. 본 명세서에 제공된 구체예에서, 상기 방법은 PEE의 발병을 예측하는데에 있어서 적어도 0.80, 적어도 0.81, 적어도 0.82, 적어도 0.83, 적어도 0.84, 적어도 0.85, 적어도 0.86, 적어도 0.87, 적어도 0.88, 적어도 0.89, 적어도 0.90, 적어도 0.91, 적어도 0.92, 적어도 0.93, 적어도 0.94, 적어도 0.95, 적어도 0.96, 적어도 0.97, 적어도 0.98, 적어도 0.99 및 1.0 의 AUC를 제공한다.
PEE의 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성 또는 건강한 임신 여성으로부터 채취된 생물학적 시료의 분석은 오직 1의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체 검사, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체의 조합에 대한 검사를 포함하고, 본 명세서에 개시된 최대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 PEE 단백질, PEE 펩티드, 및/또는 PEE 자가 항체에 대한 검사를 포함한다.
일 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 바이오마커의 분석은 표 1로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 증가 또는 감소의 검출을 포함한다. 이러한 구체예에서, PEE 발병의 위험은 IGLC1, C8G, C2, APOA4, TF, SERPIND1, C1S, THBS1, APCS, CRP, IGFBP3, IGKC V-IV, ITIH1, CLU, APOC2, PROS1, PAPPA, AFM, VWF, PRG2, APOB, FCN3, C8A, IGHG1, CD14, IGHG3, HPX, IGHG1, IGHG1, CLEC3B, APOE, PSG9, CP, GSN, FN1, FBLN1, KRT86, A2M, APOB, F5, ITIH4, hCG, KRT31, APOL1, HP, MBL2, C4BPB, 및/또는 F13B의 단백질 농도 변화를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 바이오마커의 분석은 표 2로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 변화를 포함한다. 이러한 구체예에서, PEE 발병의 위험은 APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, 및/또는 TF의 단백질 농도 변화를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, PEE 발병의 위험에 있는 임신 여성은 3종의 단백질을 이용하여 높은 수준(예를 들면, 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100%)의 정확도로 확인될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 3종의 단백질은 표 1로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 임의의 3종의 단백질이 APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, TF, APOB, A2M, C4BPB, FN1, PAPPA, 및 VWF로 구성된 군으로부터 선택된다. 이와 관련한 구체예에서, 3종의 단백질의 조합은 표 3에 나타난 조합으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에서, 분석은 표 1에 개시된 48종 PEE 단백질 중 임의의 하나 또는 조합(2 이상, 또는 3 이상의)까지; 또는 표 2에 개시된 8종의 단백질 중 임의의 하나 또는 조합(2 이상 또는 3 이상의)까지 검사하는 것을 포함할 수 있다. 표 1의 48종 PEE 단백질의 조합은 건강한 임산부로부터 PEE가 발병할 위험을 구분시키기 위한 최소한의 단백질 세트를 제공할 수 있다. 표 3은 임신한 여성에서 PEE가 발병할 위험을 검출하는데 사용될 수 있는 3종의 단백질의 예시적인 조합을 제공한다. 이러한 구체예들 모두에서, 상기 검사는 하기에 추가적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 PEE 자가 항체와 함께 선택적으로 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 3종 단백질의 최소 세트(그 정체성은 3종 단백질의 조합에 따라 다양할 수 있다)는 정상적인 임신 과정을 겪을 여성으로부터 PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성을 분리하는 것에서 AUC > 0.96의 값을 낼 수 있다. 일 구체예에서, 3종 단백질의 임의의 조합은 APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, TF, APOB, A2M, C4BPB, FN1, PAPPA, 및 VWF으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 3종 단백질의 조합 중 하나는 GSN, THBS1, 및 PRG2일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 2종 단백질의 최소 세트가 정상적인 임신 과정을 겪을 여성으로부터 PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성을 분리하는 것에서 AUC > 0.95의 값을 낼 수 있다. 예를 들면, 2종 단백질의 조합 중 하나는 THBS1 및 PRG2일 수 있다.
본 명세서에 제공된 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성으로부터의 바이오마커의 분석은 표 4 또는 표 5로부터 선택된 하나 이상의 자가 항체의 변화(증가 또는 감소)를 포함한다. 표 4는 PEE 및 건강한 임산부 사이에서 다르게 발현되는 75종의 PEE 자가 항체를 제공한다. 표 5는 PEE 및 건강한 임산부 사이에서 다르게 발현되는 10종의 자가 항체의 하나의 하위 집단을 제공한다. 일 구체예에서, PEE 발병의 위험은 RNF111, ACY3, GSTZ1, SCAMPI, KIAA1826, OSBPL1A, NDUFB2, JAK3, PI16, SCP2, SULT4A1, LOC283861, DLX1, KRT33B, PRKD2, BNIP1, U1snRNP68, KLHL29, PSPH, MEIS3, C16orf28, JUP, CTNNA3, CUEDC1, EMILIN1, CCDC53, UBE1DC1, JAK2, CD40, CAPZA2, DSN1, LOC284837, IGHA1, DACT3, CLIP3, TEC, PSMA1, SNURF, CSNK2A1, CSNK1D, 또는 이들의 조합에 대한 자가 항체의 농도의 증가를 포함한다. 또 다른 구체예에서, PEE 발병의 위험은 AKT1,GAGE7B, SUGT1L1, SLC5A2, HMGB1, GPBP1L1, APEX1, RPS28, RPS10, RBMX, RPL39L, C18orf22, TSLP, GPR45, PIM1, RBMS3, IGLV2-14, CCL19, FGFR3, ANKHD1, ACP1, BEX5, GLO1, PIK3CG, MGC16075, PRC1, ZRANB2, HSPA5, CDK5, HOXC8, TNFSF13B, SUPT4H1, ORC6L, FKSG44, 또는 이들의 조합에 대한 자가 항체의 농도의 감소를 포함한다. 일 예시적 구체예에서, PEE 발병의 위험은 글루타티온 트랜스퍼라제 제타 1(말레일아세토아세테이트 이소머라제, GSTZ1), 술포트랜스퍼라제 패밀리 4A, 멤버 1(SULT4A1), 접합 플라코글로빈(JUP), CUE 도메인 포함 단백질 1(CUEDC1), 가상 단백질 LOC284837, 및 이들의 조합에 대한 자가 항체의 농도의 증가를 포함한다. 또 다른 예시적 구체예에서, PEE 발병의 위험은 카세인 키나제 1, 델타(CSNK1D), pim-1 발암유전자(PIM1), 시토키네시스 1의 단백질 조절자(PRC1), 징크 핑거, RAN-결합 도메인 포함 단백질 2(ZRANB2), 시클린-의존적 키나제 5(CDK5), 또는 이들의 조합에 대한 자가 항체의 농도의 감소를 포함한다. CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2는 0.93의 곡선 아래 면적을 갖는, 93%의 정확도로 PEE의 검출이 가능한 3종의 자가 항체의 예시적 세트의 하나이다. CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈은 0.94의 곡선 아래 면적을 갖는, 94%의 정확도로 PEE의 검출이 가능한 또 다른 3종의 자가 항체의 예시적 세트이다.
또 다른 구체예에서, PEE 발병의 위험이 있다고 의심되는 임신 여성의 평가는 표 1 또는 2로부터 선택된 하나 이상의 단백질, 표 4 또는 표 5로부터 선택된 하나 이상의 자가 항체 및, 단백질 및 자가 항체의 조합을 포함하는, 이들의 조합의 변화의 조합에 대한 검사를 포함한다.
본 발명의 PEE 단백질 및/또는 PEE 자가 항체는 치료 목적으로 자간전증의 위험이 있는 임신한 여성의 환자 하위 집단을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 하위 집단은 PEE 증상의 발병, 진행 또는 퇴행에 대해 모니터링된다.
일부 구체예에서, 이러한 하위 집단은 PEE 증상에 앞서, 또는 이의 발병시에 PEE에 대해 치료된다. 일부 구체예에서, 상기 치료는 아기의 출산이다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 임산부에게 적절한 혈압을 낮추기 위한 항-고혈압 약제, 코르티코스테로이드 및/또는 항-경련 약제를 투여하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 치료는 임산부의 혈압을 낮추고 및/또는 태반의 혈액 흐름을 증가시키기 위한 임신 여성의 침상 휴식일 수 있다. 이러한 환자 하위 집단은 그들의 안전 및 그들 자녀의 안전을 보장할 수 있는 모든 단계에서, 치료 의사들에게 알려진 다양한 생리학적 파라미터에 대해 모니터링을 받을 수 있다. 일부 경우에, 상기 모니터링은 치료가 계속되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 또는 치료가 효과적인지 여부를 보기 위해 수행된다.
그러므로, 본 발명의 PEE 단백질 및/또는 PEE 항체 본 명세서에 기재된 방법론을 사용하여, 당업자는 PEE 발병의 위험을 결정할 수 있고, PEE 발현을 결정할 수 있고, PEE의 진행을 모니터링할 수 있고, PEE의 퇴행을 모니터링할 수 있고, PEE에 대한 치료를 받아야 하거나 또는 PEE에 대한 치료가 계속되어야 하는 환자의 하위 집단을 확인할 수 있고, 임신한 여성의 PEE 치료의 효율을 평가할 수 있고, 및/또는 PEE 증상의 모니터링을 받아야 하는 환자의 하위 집단을 확인할 수 있다.
PEE 증상의 진단, 검출, 또는 예측을 위한
키트
본 발명은 추가적으로 PEE의 진단, 검출 및 예측을 위한 분석 키트를 제공한다. 키트는 임신한 여성으로부터의 생물학적 시료 내의 PEE와 관련 있는 단백질, 펩티드, 또는 자가 항체 또는 단백질, 펩티드 및 자가 항체의 조합의 검출을 위한 시약을 포함한다. 상기 시약은 본 발명의 결합제를 포함할 수 있다. 상기 키트 내에서 발견되는 결합제 및 시약은 표지될 수 있다. 예를 들면, 이들은 형광 표지, 방사성 표지, 면역 표지, 자성 표지, 저분자 표지, DNA-기반 표지, 및/또는 당업계에 알려진 임의의 표지로 표지될 수 있다. 상기 키트는 적어도 생물학적 시료 내의 관심 있는 단백질, 펩티드, 또는 자가 항체 바이오마커(또는 이들의 조합)에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물을 추가적으로 포함한다. 상기 키트는 또한 상기 분석의 사용을 위한 지시서(instruction)을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 결합제는 펩티드 또는 단백질에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제는 자가 항체에 결합할 수 있다. 일 특정 구체예에서, 상기 키트는 APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, TF, APOB, A2M, C4BPB, FN1, PAPPA, 및 VWF로부터 선택된 PEE 단백질에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 키트는 PEE 단백질 THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 키트는 PEE 단백질 GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 키트는 PEE 자가 항체 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 키트는 PEE 자가 항체 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 포함한다.
PEE의 진단, 검출 또는 예측을 위한 조성물
본 발명은 PEE 단백질 및 PEE 자가 항체에 특이적인 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 고체 표면은 적어도 1, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상의 단백질, 펩티드, 및/또는 자가 항체, 최대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 단백질, PEE 펩티드, 및/또는 PEE 자가 항체에 대한 결합제를 포함한다. 일 구체예에서, 최대 48종 PEE 단백질 및/또는 펩티드가 위혐 평가를 위해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 상기 결합제(들)은 최대 48종의 PEE 단백질 및/또는 펩티드에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 고체 표면은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 PEE 단백질, 펩티드 및 항체의 조합 중 임의의 조합에 결합할 수 있는 결합제를 포함할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, TF, APOB, A2M, C4BPB, FN1, PAPPA, 및 VWF에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 PEE 단백질 THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 PEE 단백질 GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 PEE 자가 항체 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 PEE 자가 항체 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 결합제를 포함하는 고체 표면을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서 상기 고체 표면은 표지를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 표지는, 예를 들면, 표지를 포함하는 하나 이상의 항체 또는 자가 항체인 면역표지이다. 또 다른 구체예에서, 상기 표지는 형광 표지이다.
하기의 실시예는 예시적인 목적으로 제공된다. 이는 본 발명의 특정한 측면 및 구체예를 보여주기 위한 것으로 의도한 것이며, 본 발명을 어떠한 방법으로도 한정하는 것으로 의도하지 않는다.
실시예
실시예
1: 프로테오믹스에
기반한
질량 분석기에 의한 혈청 단백질
바이오마커의
확인
건강한 임산부 및 PEE 임산부로부터의 혈청 시료에서 가장 풍부한 20개의 혈청 단백질을 ProteoPrep20 Plasma Immunodepletion Kit(Sigma-Aldrich, Cat.no PROT20)로 제거(deplete)하였다. 각각의 시료의 용출액에 이후 표준 트립신 소화 프로토콜로 트립신 소화를 수행하였다. 트립신 소화된 펩티드(tryptic peptide)는 질량 분석에 앞서 0.2% 포름산, 2% 아세토니트릴, 및 97.8% 물을 포함하는 버퍼에서 재구성하였다. Eksigent nano2D(Ekisigent)와 자체 포장된(self-packed) 150μM ID C18, 15 cm 칼럼이 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 사용하였다. 전자분무원은 600 nL/min에서 LTQ Orbitrap Velos(Thermo Fisher) 상에서 작동하는 Michrom Advance였다. 데이터 수집은 데이터 의존적 방식으로 수행하였다. 상위 12(Velos)종의 가장 강한 전하를 띤 펩티드 이온을 2+ 및 3+ 전하 상태의 MS/MS 조각화를 위해 선택하였다. 데이터는 이후 msconvert 스크립트를 이용한 mzXML 포맷으로, Sequest 알고리즘을 이용한 Sorcerer(SAGE-N) 분석에 앞서 추출하였다. 전구체 이온 상의 50 ppm 질량 창(mass window)을 이용하여, 국제 단백질 인덱스(International Protein Index: IPI) 인간 데이터베이스를 탐색하였다. Cys 상의 프로피온아미드 및 Met 산화의 다양한 변형 및 Lys 아세틸화의 정적 변형(static modification)이 고려되었다. 모든 탐색은 각각의 확인된 단백질에 대한 누적 스펙트럼 카운트와 함께 확인된 단백질을 나열하는 Scaffold(Proteome software) 인터페이스로 집계하고 표시하였다. 상응하는 스펙트럼 카운트와 함께 단백질 ID를 Partek's Genomics Suite (Partek Inc, St. Louis, MO)에 업로드하였고 분석하였다. 그 데이터는 분위수 정상화 후 분산 분석(ANOVA)하여 PEE 및 건강한 임산부 사이에 다르게 발현되는 단백질을 확인하였다. 도 1 및 표 1. 0.05 미만의 오류 발견율을 갖는 p-값을 갖는 배수 변화가 1.5 초과 또는 미만인 단백질이 중요한 것으로 여겨졌고 예측 모델을 구축하는데 이용되었다. Partek Genomics Suite를 하기의 분류 모델 중 PEE의 예측을 위한 하나의 강력한(robust) 모델을 선택하기 위해 사용하였다: K-근접 이웃, 최단 중심, 판별 분석, 지지 벡터 기계, 부분 최소 자승법, 사선 판별 분석, 랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀분석. 복수의 모델에서 불과 3종의 단백질로 곡선 아래 면적(AUC)과 함께 수신자 조작 특성 곡선(ROC)를 산출해낼 수 있다. 이러한 모델 모두가 단 2종의 단백질(예를 들면 THBS1 및 PRG2) 또는 3종의 단백질(예를 들면, GSN, THBS1, PRG2)만으로도 PEE의 진단에 유용하고 0.9 또는 초과의 민감도, 1.0(100%)의 특이도, PPV 1.0(100%), NPV 0.92(92%)를 제공한다. 표 2는 건강한 임신 여성에 비교하여 PEE를 갖는 임신 여성에서 다르게 발현되는 8종의 단백질 한 세트를 제공한다. 표 3은 임신한 여성의 PEE 발병 위험을 검출하기 위해 사용될 수 있는 3종의 단백질의 예시적 조합을 제공한다.
표 1: PEE 및 건강한 임신 여성 사이에서 다르게 발현되는 단백질
표 2: PEE를 갖는 임신 여성에서 건강한 임신 여성에 비교하여 8종의 다르게 발현되는 단백질의 일 세트
표 3: 임신한 여성에서 PEE의 진단, PEE 발병의 위험의 검출, PEE의 진행 또는 퇴행의 모니터링에 사용될 수 있는 3종의 PEE 단백질의 예시적 조합
실시예
2: 고-밀도 단백질
마이크로어레이에
의한 항체-기반
바이오마커의
확인
ProtoArray® 인간 단백질 마이크로어레이 V5(마이크로어레이)(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 혈청 IgG의 항원 패널과의 상호작용을 확인하기 위해 사용하였다. 각각의 마이크로어레이는
바큘로바이러스에서 발현된 N-말단 GST 에피토프를 갖는 두 번 인쇄된(printed) 9400개의 분리된 단백질 항원을 포함하였고, 이들의 세포의 효소적 활성/천연의 입체성을 유지하는 자연적인 상태하에서 친화도 정제(affinity purified)하였다. 각 단백질은 Ultimate ORF collection(Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 유래하였다. 마이크로어레이는 -80℃에서 보관하였고, 4℃에서 20분간 사용전에 평형화하였다. 상기 마이크로어레이 슬라이드는 4℃에서 1시간 동안 4-웰 트레이에서 부드러운 교반과 함께 5.0 mL 블로킹 버퍼(100 mM Sod. 포스페이트 pH 7.4, 200 mM NaCl, 0.08% Triton X-100, 25% 글리세롤, 20 mM 환원된 글루타티온, 1.0 mM DTT, 1% Hammarstein Grade Caesin)로 블로킹하였다. 블로킹 단계 후, 상기 블로킹 버퍼를 흡입(aspiration)하여 제거하였고 PBST 버퍼(1X PBS, 1% Hammerstein Grade casein, 0.1% Tween 20) 중 5.0 mL 희석된 혈청(1:150)을 상기 플레이트 상에 첨가하여 4℃에서 90분간 부드러운 교반과 함께 배양하였다. 다음 단계로, 상기 혈청 시료를 제거하였고 상기 플레이트를 5.0 mL 신선한 PBST 버퍼로 세척 당 부드러운 교반과 함께 5분간 배양하면서 5회 세척하였다. PBST 버퍼 중 희석된 2차 항체(항-인간 항체--Alexa Fluor® 647 컨주게이트) 의 5.0 mL 부분을 첨가하였고 상기 플레이트를 부드러운 교반과 함께 4℃에서 90분간 배양하였다. 상기 2차 항체 용액은 흡입으로 제거하였다. 상기 플레이트는 이후 5.0 mL 신선한 PBST 버퍼로 5회 세척하였고, 세척 당 부드러운 교반과 함께 5분간 배양하였다. 마지막으로, 상기 슬라이드를 원심분리기로 건조하였고 Axon GenePix 4000B 스캐너(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 스캔하였다. 데이터는 마이크로어레이 분석 소프트웨어 GenePix pro 6.0(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)을 사용하여 획득하였따. 상기 슬라이드는 635 nm, 600의 PMT 게인(gain), 레이저 파워 100%, 및 0 μm의 포커스 초점에서 스캔하였다. Invitrogen 웹사이트(www.invitrogen.com/ProtoArray) 상의 ProtoArray 중앙 포털로부터, 각 단백질 마이크로어레이의 바코드를 제출하여 ".gal" 파일들을 얻었다. 제조사의 지시서에 따라 Prospector Analyzer® 5.2 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 .gpr 파일들로부터 데이터를 추출하였다.
건강 및 PEE 임산부의 혈청 내의 각각의 자가 항체의 양을 나타내는 상대적인 형광 단위를 Partek's Genomics Suite (Partek Inc, St. Louis, MO)에 업로드 하고 분석하였다. 분위수 정규화된 데이터는 이후 분산 분석(ANOVA)하여 PEE 및 건강한 임산부 사이에서 다르게 발현되는 자가 항체를 확인하였다(표 4-5, 도 5-7). 도 5는 건강한 임신 여성 및 PEE를 갖는 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 다르게 측정되는 것으로 밝혀진 0.05 미만의 p 값을 갖는, 75종 PEE 자가 항체의 ANOVA에 따른 주요 성분 분석을 도시적으로 나타낸 것이다. 이러한 자가 항체의 다양한 조합 세트로부터 PEE를 정확하게 예측할 수 있다. 자가 항체에 대한 배수 변화가 2배 초과의 임계 값에 설정된 경우, 하기의 10종의 자가 항체들이 PEE를 구별하기 위한 예시적 세트의 하나로서 확인되었다.: CSNK1D, GSTZ1, CDK5, PIM1, ZRANB2, PRC1, CUEDC1, SULT4A1, LOC283861, 접합 플라코블로빈. 3종의 자가 항체의 세트가 PEE의 예측율을 제공하기 위해 통계적 모델링에 의해 선택될 수 있다. CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2는 AUC 0.93인 PEE의 예측율을 제공하는 3종의 자가 항체의 세트의 한 예시이다. 또 다른 3종 자가 항체의 세트인, CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈은 PEE에 대한 AUC 0.94를 나타낸다.
0.05 미만의 오류 발견율을 갖는 p-값을 갖는 2 초과의 배수 변화를 갖는 자가 항체는 중요한 것으로 여겨졌고 예측 모델을 구축하기 위해 사용하였다. Partek Genomics Suite를 하기의 분류 모델 중 PEE의 예측을 위한 하나의 강력한 모델을 선택하기 위해 사용하였다: K-근접 이웃, 최단 중심, 판별 분석, 지지 벡터 기계, 부분 최소 자승법, 사선 판별 분석, 랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀분석. 복수의 모델에서 불과 3종의 단백질로 곡선 아래 면적(AUC)과 함께 수신자 조작 특성 곡선(ROC)를 산출해낸다. 이러한 모델의 하나 이상이 PEE의 진단을 위해 사용될 수 있다.
표 4: PEE 및 건강한 임산부에서 다르게 발현되는 자가 항체
표 5: PEE 및 건강한 임산부에서 다르게 발현되는 10종 자가 항체의 일 세트
실시예
3: 임신 여성으로부터의 시료 내 PEE의 예측
임신 13주 또는 그 이후에 고혈압을 갖는 임신 여성으로부터 50밀리리터의 혈액 시료를 채취하고, 따라서 PEE를 갖거나 또는 발병중인 것으로 예측된다. 혈청을 수득하기 위해 혈액을 응고시킨다. 그 혈청 시료 중 가장 풍부한 20개의 혈청 단백질을 ProteoPrep20 Plasma Immunodepletion Kit(Sigma-Aldrich, Cat.no PROT20)로 제거하였다. 혈청 단백질을 이후 표준 프로토콜을 이용한 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 확인하고 정량화한다. 일 구체예에서, 하기의 단백질에 대해 특이적인 항체들이 상기 ELISA 분석에서 사용될 수 있다: APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, 및 TF.
또 다른 분석에서는, 상기 혈청 단백질을 스펙트럼 관측기(spectral imager)를 이용하여 확인하고 정량화한다.
또 다른 분석에서, 상기 혈청 단백질을 MagArray 단백질 칩을 이용하여 확인하고 정량화한다. 상기 MagArray 단백질 칩을 위해, 상기 혈청을 표면 상의 프로브가 특이적으로 시료 내 혈청 단백질에 결합하는 칩 상에 올려둔다. 두 번째로, 관심 있는 단백질에 특이적인 나노태그-표지된 항체가 샌드위치-유사 구조를 형성하며 상기 프로브에 결합한 상기 혈청 단백질에 결합한다. 세 번째로, 상기 칩에 외부 자기장이 적용하고, 상기 나노태그에 의해 생산된 누설 자기장을 전기적으로 측정하여 관심 있는 각 단백질의 존재 및 양을 결정한다. 일 구체예에서, 하기의 표적 단백질에 특이적인 항체들이 상기 MagArray 분석에서 사용될 수 있다: APCS, THBS1, PRG2, ITIH4, GSN, HPX, F5, 및 TF. 일 분석법 형식에서, 이전의 목록으로부터의 3종의 표적을 검출 및 정량화를 위해 선택할 수 있고 상기 분석에서 샌드위치 유사 구조를 형성하기 위해 사용할 수 있다. 3종의 단백질에 대한 결합 데이터를 정량화 한다. 단백질의 농도를 결정하고, 대략적으로 동일한 임신 주수인 건강한 임신 여성의 혈청으로부터 채취된 참조 시료 농도 값과 비교한다.
또 다른 분석에서, 카르복시 비드 세트를 관심 있는 단백질, 펩티드, 및 자가 항체를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 분석에서, 임의의 단백질 또는 펩티드가 매우 안정적인 마이크로비드 표면에 공유적으로 부착될 수 있고, 이후 형광 표지하고 형광의 강도를 측정할 수 있다. Illumina사의 VeraCode Technology(Illumina Inc., Hayward, CA)를 이용하면 표준 96-웰 마이크로플레이트 내 단일 반응의 다양한 조합으로 최대 48 면역분석을 수행할 수 있다.
또 다른 대안에서, 단백질, 펩티드 및 자가 항체를 전기화학발광 ELISA로 측정할 수 있다. Meso Scale Discovery(MSD, Gaitherburg, MD)의 감도 높은 다중화 전기화학발광 ELISA 플랫폼은 동일한 웰 내의 최대 10개 분석물까지 동시에 측정 가능하고 사용자 정의 사용을 위한 매우 높은 효율의 다중화 ELISA이다.
PEE를 갖고 있다고 의심되는 여성으로부터 채취된 혈청 시료 내 3종의 단백질의 농도의 어떠한 변화(상향 조절 또는 하향 조절)든, 건강한 임신 여성으로부터의 혈청 시료 내 상기 단백질들의 수준과 비교하여, 이는 PEE의 진단을 나타낸다. 이러한 결과는 이후 임신 여성의 의사에게 전달되고 임신한 산모 및 자라나는 태아를 보호하기 위한 적절한 치료 대책이 취해진다.
Claims (89)
- 임신 여성의 자간전증의 발병의 위험을 검출하기 위한 방법으로서,
a. 여성으로부터의 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키는 단계; 및
b. 시료 내 존재하는 3종 이상의 PEE 단백질에 대한 결합제의 결합을 검출하는 단계로서, 상기 3종 이상의 PEE 단백질은 표 1에 나열된 단백질, 표 2에 나열된 단백질, 또는 표 3의 단백질의 조합으로부터 선택된 것인 단계를 포함하고,
상기 결합제는 상기 PEE 단백질과 10-12M 내지 10-5M의 Kd로 결합하고, 상기 결합제의 시료 내 PEE 단백질에 대한 결합은 동일한 임신 3분기의 건강한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 PEE 단백질에 대한 결합제의 결합과 비교하여 증가된 것이고, 이에 의한 결합의 증가는 80% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 표 1 또는 표 2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 표 1로부터 선택된 PEE 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 표 2로부터 선택된 PEE 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 결합제는 48종의 PEE 단백질 이하와 결합하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 여성은 임신 3기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 여성은 임신 2기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 여성은 임신 1기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 시료는 비-태아 산모 시료인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 또는 태반 조직인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합의 증가는 90% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합의 증가는 95% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 PEE 단백질 GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 개별적인 항체의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 시료 내 존재하는 PEE 자가 항체에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 결합제는 표 4 또는 표 5로부터 선택된 PEE 자가 항체에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 결합제는 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 PEE 자가 항체에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 결합제는 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 PEE 자가 항체에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 항체를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 핵단백질을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 펩티드를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 형광 표지를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 표지된 항체를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합은 면역 분석법에 의해 수행된 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 면역 분석법은 효소-연결된 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay)인 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 면역 분석법은 비드(bead)를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 면역 분석법은 자성 입자를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 면역 분석법은 자성 입자(magnetic particle)를 포함하지 않는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합제는 단백질 결합 부위를 포함하는 핵단백질인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 자간전증의 발병의 예측, 자간전증의 진행의 모니터링, 자간전증의 퇴행의 모니터링, 자간전증에 대한 치료의 효율을 평가, 자간전증의 치료를 받아야 하는 환자의 하위 집단을 확인 또는 자간전증 증상에 대한 모니터링을 받아야 하는 환자의 하위 집단을 확인하기 위해 추가적으로 사용되는 것인 방법.
- 임신한 여성의 자간전증의 발병의 위험을 검출하기 위한 방법으로서,
a. 여성으로부터의 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키는 단계; 및
b. 시료 내 존재하는 PEE 자가 항체에 대한 결합제의 결합을 검출하는 단계로서, 상기 결합제는 상기 PEE 자가 항체와 10-12M 내지 10-5M의 Kd로 결합하고, 시료 내 상기 결합제의 PEE 자가 항체에 대한 결합은 동일한 임신 3분기의 건강한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합제의 결합과 비교하여 변화된 것이고, 이에 의한 결합의 변화는 80% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법. - 청구항 30에 있어서, 상기 PEE 자가 항체는 표 4 또는 표 5로부터 선택된 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제는 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 32에 있어서, 상기 결합제는 표지를 포함하는 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 표지는 형광 표지인 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제는 단백질 어레이(array)를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 결합제의 결합에 비교하여 증가된 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 결합제의 결합에 비교하여 감소된 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제는 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 PEE 자가 항체에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제는 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 PEE 자가 항체에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제는 표 1 또는 표 2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합제는 GSN, THBS1 또는 PRG2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 40에 있어서, 상기 결합제는 48종의 PEE 단백질 이하와 결합하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 여성은 임신 3기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 여성은 임신 2기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 여성은 임신 1기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 생물학적 시료는 비-태아 산모 시료인 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 또는 태반 조직인 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합의 증가는 90% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합의 증가는 95% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 결합은 면역 분석법에 의해 수행된 것인 방법.
- 청구항 50에 있어서, 상기 면역 분석법은 효소-연결된 면역흡착 분석인 것인 방법.
- 청구항 50에 있어서, 상기 면역 분석법은 비드를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 50에 있어서, 상기 면역 분석법은 자성 입자를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 50에 있어서, 상기 면역 분석법은 자성 입자를 포함하지 않는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 방법은 자간전증의 발병의 예측, 자간전증의 진행의 모니터링, 자간전증의 퇴행의 모니터링, 자간전증에 대한 치료의 효율을 평가, 자간전증의 치료를 받아야 하는 환자의 하위 집단을 확인 또는 자간전증 증상에 대한 모니터링을 받아야 하는 환자의 하위 집단을 확인하기 위해 추가적으로 사용되는 것인 방법.
- 임신한 여성의 자간전증의 발병의 위험을 검출하기 위한 방법으로서,
a. 여성으로부터의 생물학적 시료를 결합제와 접촉시키는 단계; 및
b. 시료 내 존재하는 하나 이상의 PEE 단백질 및 하나 이상의 PEE 자가 항체에 대한 결합제의 결합을 검출하는 단계를 포함하고;
상기 결합제는 상기 적어도 하나 이상의 PEE 단백질과 10-12M 내지 10-5M의 Kd로 결합하고, 상기 결합제는 상기 적어도 하나 이상의 PEE 자가 항체와 10-12M 내지 10-5M의 Kd로 결합하고,
상기 결합제의 시료 내 하나 이상의 PEE 단백질 및 하나 이상의 PEE 자가 항체에 대한 결합은 동일한 임신 3분기의 건강한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 하나 이상의 PEE 단백질 및 하나 이상의 PEE 자가 항체에 대한 결합제의 결합과 비교하여 변화된 것이고, 이에 의한 결합의 변화는 80% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법. - 청구항 56에 있어서, 상기 자가 항체는 표 4 또는 표 5로부터 선택된 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 결합제의 결합에 비교하여 증가된 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합제의 시료 내 PEE 자가 항체에 대한 결합은 건강한 임신 여성으로부터의 생물학적 시료 내 자가 항체에 대한 결합제의 결합에 비교하여 감소된 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 단백질은 표 1 또는 표 2로부터 선택된 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합제는 GSN, THBS1 또는 PRG2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합제는 하나 이상의 PEE 단백질에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 62에 있어서, 상기 결합제는 GSN, THBS1 또는 PRG2로부터 선택된 PEE 단백질에 추가적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 62에 있어서, 상기 결합제는 48종의 PEE 단백질 이하와 결합하는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합제는 하나 이상의 PEE 자가 항체와 결합하는 것인 방법.
- 청구항 65에 있어서, 상기 결합제는 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2에 대한 PEE 자가 항체에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 65에 있어서, 상기 결합제는 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈에 대한 PEE 자가 항체에 결합하는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 여성은 임신 3기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 여성은 임신 2기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 여성은 임신 1기의 임신 중인 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 생물학적 시료는 비-태아 산모 시료인 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변, 혈액, 또는 태반 조직인 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합의 증가는 90% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합의 증가는 95% 수준의 정확도 이상으로 자간전증 발병의 위험을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합제는 표지된 항체 및 표지된 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 표지는 형광 표지인 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 결합은 면역 분석법에 의해 수행된 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 면역 분석법은 효소-연결된 면역흡착 분석인 것인 방법.
- 청구항 77에 있어서, 상기 면역 분석법은 비드를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 77에 있어서, 상기 면역 분석법은 자성 입자를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 77에 있어서, 상기 면역 분석법은 자성 입자를 포함하지 않는 것인 방법.
- 청구항 56에 있어서, 상기 방법은 자간전증의 발병의 예측, 자간전증의 진행의 모니터링, 자간전증의 퇴행의 모니터링, 자간전증에 대한 치료의 효율을 평가하기 위해 추가적으로 사용되는 것인 방법.
- GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물.
- CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2 PEE 자가 항체에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물.
- CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈 PEE 자가 항체에 대한 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물.
- a. 임신한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 GSN, THBS1 및 PRG2의 검출을 위한 시약;
b. GSN, THBS1 및 PRG2에 대한 하나 이상의 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물; 및
c. 본 분석의 사용을 위한 지시서(instruction)를 포함하는 진단 분석 키트. - a. 임신한 여성으로부터의 생물학적 시료 내 PEE 자가 항체의 검출을 위한 시약;
b. PEE 자가 항체에 대한 하나 이상의 결합제를 포함하는 하나 이상의 고체 표면을 포함하는 조성물; 및
c. 본 분석의 사용을 위한 지시서를 포함하는 진단 분석 키트. - 청구항 87에 있어서, 상기 조성물은 CSNK1D, CUEDC1 및 ZRANB2 PEE 자가 항체와 결합이 가능한 고체 표면을 포함하는 것인 키트.
- 청구항 87에 있어서, 상기 조성물은 CSNK1D, SULT4A1 및 접합 플라코글로빈 PEE 자가 항체와 결합이 가능한 고체 표면을 포함하는 것인 키트.
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