CN116042806B - 生物标志物在Cronkhite-Canada综合征诊断中的应用 - Google Patents

生物标志物在Cronkhite-Canada综合征诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生物标志物在Cronkhite‑Canada综合征诊断中的应用。本发明通过DIA蛋白质组测序分析及目标蛋白PRM验证对Cronkhite‑Canada综合征患者的蛋白质组学进行了探索，发现6个目标蛋白(C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO、F13B)具有显著性差异，其诊断Cronkhite‑Canada综合征的ROC曲线下面积在0.720‑0.980范围内。本发明提供的6种生物标志物具有成为CCS诊断的重要指标的潜力，有助于CCS的诊断，降低漏诊、误诊风险，从而有助于改变疾病预后。

Description

生物标志物在Cronkhite-Canada综合征诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及生物标志物在Cronkhite-Canada综合征诊断中的应用。
背景技术
Cronkhite-Canada综合征(Cronkhite-Canada syndrome,CCS)是一种以消化道多发息肉和外胚层改变为主要特征的罕见、非遗传性疾病，目前世界范围内共报道500余例。
CCS常有上、下消化道同时受累，但通常不累及食管；多发息肉通常无蒂，可呈现出息肉相互叠加的形态，也可只表现为黏膜弥漫增厚或萎缩。经典CCS息肉为错构瘤性息肉，其病理特征包括固有层水肿、腺体囊性扩张、单个核细胞浸润，与幼年性息肉有一定重叠之处；但病变间外观正常的黏膜也可有组织学异常。由于典型CCS息肉在组织病理学上被划归为错构瘤性息肉，CCS也被认为是一种特殊的错构瘤息肉病(HPS)但与经典的HPS不同，CCS往往无明确遗传倾向，老年发病，消化道症状及外胚层表现更突出，且对糖皮质激素治疗有效。此外，CCS息肉中可见IgG4阳性浆细胞浸润，但未达IgG4相关疾病确诊标准，其具体作用及机制尚不明确。
CCS的病因及发病机制尚未明确，目前倾向于认为其是一种慢性的“炎症性疾病”，可能与自身免疫紊乱相关。治疗手段有限，目前以糖皮质激素为主的免疫抑制治疗是主流治疗方案，继发恶性肿瘤风险高，预后差，早期文献报道5年死亡率可高达55％。CCS为罕见病，不存在明确的家族遗传背景。国内外对于CCS的发病机制的研究尚少，疾病的诊断尚缺乏特征性的生物标志物，早期诊断较困难。所以，亟需发掘可以早期筛查CCS疾病的生物标志物，做到早诊断早治疗。本研究通过对CCS患者进行血清蛋白质组学分析，发掘与CCS疾病诊断相关的生物标志物。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于发掘Cronkhite-Canada综合征患者诊断的血清生物标志物，并用血清生物标志物的试剂制备诊断Cronkhite-Canada综合征的产品或系统。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断Cronkhite-Canada综合征的产品中的应用。
进一步，所述生物标志物包含C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任意一种或多种。
进一步，所述检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂。
进一步，所述结合剂包括特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。
本发明第二方面提供了一种用于诊断Cronkhite-Canada综合征的产品，所述产品包含检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的试剂的任意一种或多种。
进一步，所述试剂选自：特异性识别C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任意一种或多种的寡核苷酸探针、特异性扩增C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任意一种或多种的引物、特异性结合C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任意一种或多种的编码的蛋白的结合剂。
进一步，所述产品包括能够检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B任意一种或多种表达水平的试剂盒、芯片或核酸膜条。
进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任意一种或多种mRNA或蛋白表达水平的试剂。
本发明第三方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备Cronkhite-Canada综合征诊断系统中的应用。
进一步，所述生物标志物包含C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B任意一种或多种。
进一步，所述检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂。
进一步，所述结合剂包括特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。
本发明第四方面提供了一种Cronkhite-Canada综合征诊断系统，所述诊断系统包含：
检测构件：所述检测构件用于检测所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的表达水平；
结果判断构件：所述结果判断构件用于根据所述检测构件检测得到的所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的表达水平的结果，输出受试者是否患有Cronkhite-Canada综合征的风险。
进一步，所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的表达水平包括所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的mRNA表达水平、所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的蛋白表达水平。
进一步，所述检测构件包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置或电化学发光检测装置。
进一步，所述结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的表达水平；分析模块用于根据所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任一种或多种的表达水平，分析出受试者是否患有Cronkhite-Canada综合征的风险；输出模块用于输出分析模块的分析结果。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过转录组测序、DIA蛋白质组学方法及GO功能注释和KEGG通路注释的富集分析筛选Cronkhite-Canada综合征诊断的生物标志物，并对筛选出有差异的基因或蛋白进行PRM验证。首次发现了6个目标蛋白(C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO、F13B)具有显著性差异，其诊断CCS的ROC曲线下面积范围为0.720-0.980。筛选出的六种血清生物标志物具有成为CCS诊断的重要指标的潜力，有助于CCS的诊断，降低漏诊、误诊风险，从而有助于改变疾病预后。
附图说明
图1为差异表达基因火山图。
图2为GO功能注释富集分析图。
图3为KEGG通路注释富集分析图。
图4为六种血清生物标志物对CCS的诊断价值图。
具体实施方式
本发明基于国内最大规模的单中心CCS队列，收集了10例活动期CCS患者及15例健康对照患者的血清，通过DIA蛋白质组测序分析及目标蛋白PRM验证对CCS患者的蛋白质组学进行了探索。DIA蛋白质组学分析共发现362个差异表达蛋白质，其中69个上调，293个下调。并进一步分析所述差异表达的基因在PRM验证中的表达情况与诊断效能，从而发现适用于Cronkhite-Canada综合征诊断的生物标志物。
在本发明上下文中，所使用的术语“生物标志物”是指基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。在本发明的具体实施例中，所述生物标志物为C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO及F13B的任意一种或多种。
C9包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的C9，以及源自细胞中加工的任何形式的C9。该术语涵盖C9的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。C9包含人的C9以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的C9，在本发明中，C9为人的基因，其基因ID为735。
ERN1包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的ERN1，以及源自细胞中加工的任何形式的ERN1。该术语涵盖ERN1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。ERN1包含人的ERN1以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的ERN1，在本发明中，ERN1为人的基因，其基因ID为2081。
FGA包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的FGA，以及源自细胞中加工的任何形式的FGA。该术语涵盖FGA的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。FGA包含人的FGA以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的FGA，在本发明中，FGA为人的基因，其基因ID为2243。
ORM1包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的ORM1，以及源自细胞中加工的任何形式的ORM1。该术语涵盖ORM1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。ORM1包含人的ORM1以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的ORM1，在本发明中，ORM1为人的基因，其基因ID为5004。
MPO包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的MPO，以及源自细胞中加工的任何形式的MPO。该术语涵盖MPO的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。MPO包含人的MPO以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的MPO，在本发明中，MPO为人的基因，其基因ID为4353。
F13B包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的F13B，以及源自细胞中加工的任何形式的F13B。该术语涵盖F13B的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。F13B包含人的F13B以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的F13B，在本发明中，F13B为人的基因，其基因ID为2165。
生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的差异水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)，优选地，所述生物标志物具有统计学差异(P﹤0.05)。
在本发明中，术语“表达水平”是指生物标志物分子或基因组的量、积累或速率。表达水平可以例如由以下来表示：由基因编码的信使RNA(mRNA)的量或合成速率、由基因编码的多肽或蛋白质的量或合成速率、或在细胞或生物流体中积累的生物分子的量或合成速率。在本发明的上下文中，所使用的术语“样本”，是指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、细胞提取物及其组合。
术语“特异性扩增”是指引物能够扩增目的基因，而不扩增其他基因。
术语“引物”指的是寡核苷酸，其能够与邻近靶序列的RNA或DNA区位点特异性地退火，并作为合适条件下DNA合成的起始引物，在所述条件下引物延伸产物的合成被诱导，例如，在存在核苷酸和如DNA-依赖性DNA聚合酶的聚合诱导剂，以及合适的温度、pH、金属浓度和盐浓度的情况下。
术语“扩增”指的是应用例如各种引物延伸反应中的任何一种，复制核酸的一部分的方法。示例性的引物延伸反应包括但不限于PCR。除非明确说明，“扩增”指的是单个复制，或算术、对数或指数扩增。
术语“特异性识别所述生物标志物的探针”是指探针能够区分出含有所述生物标志物与不含有所述生物标志物。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有所述生物标志物与不含有所述生物标志物。还可以设计与所述生物标志物精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与所述生物标志物杂交，而不与不含有所述生物标志物杂交。在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
术语“特异性结合”是指两个分子之间的结合(例如配体与受体之间)，其特征在于一个分子(配体)即便在存在多种其他不同分子的情况下能够与另一个具体分子(受体)结合，也就是在异质分子混合物中一个分子对另一个分子表现出优先的结合能力。通过在存在过量未标记配体情况下可检测的标记配体与受体结合的减弱也可以说明配体与受体的特异性结合(亦即竞争结合检测)。
术语“结合剂”是指能够使用特定分子间相互作用与膜蛋白结合的蛋白质(蛋白质、蛋白质样或含蛋白质)分子的全部或部分。蛋白的结合剂是例如蛋白质的受体、结合蛋白质的凝集素、针对蛋白质的抗体、针对蛋白质的肽体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。更具体地，术语“结合剂”是指多肽，更具体地是蛋白质结构域。合适的蛋白质结构域是整体蛋白质结构的元件，它是自稳定的并且独立于蛋白质链的其余部分折叠并且通常被称为“结合结构域”。这种结合结构域的长度从约25个氨基酸直至500个氨基酸和更多之间变化。许多结合结构域可以分类为折叠并且是可识别的、可鉴定的、3-D结构。一些折叠在许多不同的蛋白质中非常常见，以至于它们被赋予了具体的名称。
术语“抗体”在本发明中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。术语“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。本发明的“抗体功能片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(诸如在小鼠模型中，或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。
本发明提供了一种用于诊断Cronkhite-Canada综合征的产品，所述产品中包含检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂，并且可包含使用所述产品判断受试者是否患有Cronkhite-Canada综合征或患有Cronkhite-Canada综合征的风险的说明书。
在本发明的上下文中，所使用的术语“诊断”是指基于与个体相关的一个或其以上的征兆、症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即，不存在疾病或疾患)，或者可被诊断为不健康的/异常的(即，存在疾病或疾患或特性的评估)。术语“诊断”包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现。
在本发明的一个实施方案中，产品可包含固体基片诸如芯片、载玻片、阵列等，其具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种样本生物标志物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样本中生物标志物的存在和/或浓度和/或量。如上所述，在患有Cronkhite-Canada综合征的受试者的样本中发现所述生物标志物的水平降低或增加。芯片可被配置成使得仅当这些生物标志物中的一种或多种的浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色的变化)，所述阈值被选择或区分指示对照受试者的生物标志物的浓度和/或量和/或表达水平与指示患有或易患Cronkhite-Canada综合征的患者的生物标志物的浓度和/或量和/或表达水平。因此，可检测到的输出(例如颜色的变化)的存在立即表明样本中包含显著降低水平或显著升高水平的生物标志物，表明受试者患有或易患Cronkhite-Canada综合征。
本发明中，术语“试剂盒”包括检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO、F13B基因或蛋白的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
本发明所述的试剂盒包括但不限于qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、电化学发光检测试剂盒。
在本发明中，“核酸膜条”包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，包括尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠，但不限于此。
术语“RT-PCR法”也称为“反转录聚合酶链式反应”或“逆转录聚合酶链式反应”，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
术语“qRT-PCR”也称为“定量实时聚合酶链式反应”，是指利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析。
术语“免疫印迹法”也称为“蛋白质印迹”或“western blot”指对固定化到载体上的蛋白质(或多肽)的分析。
在本发明的上下文中，所使用的术语“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。
木语“诊断系统”是指在其中需要监控一个或多个终点设备的运行的系统。诊断系统包含彼此传输和/或接收数据的至少两个设备。诊断系统可以是任何尺寸的系统，包括但不限于少则两个装置、多则如产生LAN、WAN、SAN、互联网、局域网等等所需的多个装置。
在本发明中，所述生物标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。
正如熟练技术人员会熟知的，可以以不同方式实施和实现将生物标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合蛋白质和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
优选地，在生物标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于Cronkhite-Canada综合征的风险或与有助于评估Cronkhite-Canada综合征患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体进行分类入组，例如正常人、有患有Cronkhite-Canada综合征风险的个体、患有Cronkhite-Canada综合征的患者等；b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物；c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值；d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。
用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估Cronkhite-Canada综合征中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
受试者工作特征曲线下面积(＝AUC)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的受试者工作特征(ROC)描述得最好。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。
实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或者疾病进展对无疾病进展。
在每种情况中，ROC线图通过对于决策阈的整个范围将灵敏度对1-特异性绘图来描绘两种分布之间的交叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目)]。这也称作疾病或状况的存在的阳性。它仅仅自受影响亚组来计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的一项指标，而且完全自不受影响的亚组来计算。因为真和假阳性分数通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算，所以ROC线图不依赖于样品样本所涉及的疾病的流行程度。ROC线图上的每个点代表一个对应于特定决策阈的灵敏度/1-特异性。
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1与Cronkhite-Canada综合征相关的生物标志物的筛选
1、收集受试者样品
从北京协和医院收集10名活动期CCS患者的血样和15名健康对照的血样，将血浆离心后，低温下运输至技术中心送检蛋白质组测定。对收集的测序样本的基本情况进行统计，结果如表1所示。
表1测序样本基本情况
2、DIA蛋白组学测序
2.1蛋白质提取和肽段酶解
1)每例样品取适量蛋白，混合成Pool样品，用于构建Spectral Library。抽取样本20μg蛋白进行SDS-PAGE电泳测试，评估提取效果。
2)所有样品，包括混合Pool样品用Trypsin进行溶液内酶解。加DTT至终浓度20mM，30°反应2h，冷却至室温，加入适量IAA至终浓度为25mM，600rpm振荡1min，避光室温30min，加入适量NH4HCO3 buffer(50mM)，将UA浓度稀释至低于1.5M。加入40μLNH4HCO3 buffer(2μgLys-C)，600rpm振荡1min，37℃4h，然后往样品中加入2μg Trypsin，37℃16h。脱盐冻干后用0.1％FA复溶。OD280测定肽段浓度。取100μg高丰度分离后的低丰度肽段，采用HPRP方法进行分级，收集所有组分。每个组分肽段冻干后，用10μl 0.1％FA复溶，并用OD280测定肽段浓度。然后分别取出2μg肽段，掺入适量iRT标准肽段，进行DDA质谱检测。
2.2、质谱分析
1)DDA分析采用纳升流速HPLC系统Easy nLC-1200进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品进样到Trap Column后经过色谱分析柱25cm tip-column进行梯度分离。纳升级高效液相色谱分离后的样品用Q-Exactive HFX质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA质谱分析。
2)DIA分析，每例样品各取2μg肽段，分别掺入适量iRT标准肽段，每个样品进行1次DIA质谱测试。采用纳升流速HPLC系统Easy nLC进行色谱分离。色谱柱以95％的A液平衡。样品进样到Trap Column后经过色谱分析柱25cm tip-column进行梯度分离。纳升级高效液相色谱分离后的样品用Q-Exactive HFX谱仪(Thermo Scientific)进行DIA质谱分析。
2.3获得表达差异的蛋白
DDA、DIA质谱分析后获得差异表达的蛋白。分析不同组间具有表达差异的蛋白质，对实验数据进一步进行差异筛选，在显著性差异蛋白质筛选中，以表达倍数(Fold Change,FC)＞1.5倍(上调＞1.5倍或下调＜0.67倍)且P.value＜0.05为阈值。
3、富集分析
采用Fisher精确检验，比较各个GO分类、KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，对目标蛋白质集合进行GO功能注释或KEGG通路注释的富集分析。针对表达差异的蛋白进行GO分析或KEGG通路分析后取p值最小的前20个GO功能条目，进行作图。
1)GO功能注释
利用Blast2 GO对目标蛋白质集合进行GO注释，过程大致可以归纳为序列比对、GO条目提取、GO注释和InterProScan补充注释等四个步骤。
2)KEGG通路注释
利用KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)软件，对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释。
4、筛选表达差异的蛋白
通过数据分析，筛选出在DIA测序和IL-17信号通路、NOD样受体通路、凋亡相关、免疫反应中的白细胞活化相关、癌症中的转录失调通路上都有差异的基因编码蛋白。
5、筛选结果
5.1 DIA测序分析
本项目建立的DIA数据库，其中包含了39015个肽段和7151个蛋白质。分析不同组间表达差异的蛋白质如图1所示，结果表明在显著性差异蛋白质筛选中，共发现362个差异表达蛋白质，其中69个上调，293个下调。
5.2富集分析
GO功能注释分析如图2所示，结果表明Gene Ontology生物过程富集分析主要与细胞凋亡信号通路、细胞活化、细胞信号传导相关。
KEGG通路注释分析如图3所示，结果表明KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)信号通路主要与中性粒细胞外杀菌网络(NET)、吞噬体形成、IL-17信号通路、细胞凋亡通路相关。
6.4筛选表达差异的蛋白
通过数据分析，筛选出DIA测序和IL-17信号通路、NOD样受体通路、凋亡相关、免疫反应中的白细胞活化相关、癌症中的转录失调通路上都有差异的6个基因编码蛋白(包括C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO、F13B)。
实施例2差异基因的验证及诊断效能检测
1、PRM验证
对实施例1筛选出的差异表达的6个蛋白进行PRM验证。
具体步骤如下：
1)将实施例1中的样本蛋白质提取酶解，进行PRM预实验。
2)利用四级杆质量分析器(如Orbitrap系列)的选择能力，用Q1选择目标肽段的母离子；
3)在collision cell中对母离子进行碎裂；
4)利用高分辨、高质量精度分析器在二级质谱中检测所选择的母离子窗口内的所有碎片的信息。
2、诊断效能分析
将实验组与对照组样本的PRM验证数据导入SPSS软件进行数据分析，通过logistic回归分析建立复合诊断模型。
3、实验结果
3.1 PRM验证分析结果
6个目标蛋白(包括C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO、F13B)在PRM验证中均具有显著性差异。
筛选结果的诊断效能结果见图4和表2、表3，结果显示，其诊断CCS的ROC曲线下面积为0.720-1.000。
表2六种血清蛋白诊断CCS的曲线下的面积
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
表3六种血清蛋白诊断CCS的效能数据
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (16)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断Cronkhite-Canada综合征的产品中的应用，
所述生物标志物包含C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结合剂包括特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。
5.一种用于诊断Cronkhite-Canada综合征的产品，其特征在于，所述产品包含检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的试剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的寡核苷酸探针、特异性扩增C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的引物、特异性结合C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的编码的蛋白的结合剂。
7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B表达水平的试剂盒、芯片或核酸膜条。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的mRNA或蛋白表达水平的试剂。
9.检测样本中生物标志物的试剂在制备Cronkhite-Canada综合征诊断系统中的应用，所述生物标志物包含C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测样本中生物标志物的试剂包括检测样本中生物标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中生物标志物的蛋白表达水平的试剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性扩增所述生物标志物的引物、特异性识别所述生物标志物的探针、特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的结合剂。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述结合剂包括特异性结合所述生物标志物编码的蛋白的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。
13.一种Cronkhite-Canada综合征诊断系统，其特征在于，所述诊断系统包含：
检测构件：所述检测构件用于检测生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的表达水平；
结果判断构件：所述结果判断构件用于根据所述检测构件检测得到的所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的表达水平的结果，输出受试者是否患有Cronkhite-Canada综合征的风险。
14.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的表达水平包括所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的mRNA表达水平、所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的蛋白表达水平。
15.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，所述检测构件包括qPCR试剂盒、ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、电化学发光检测试剂盒、qPCR仪、ELISA检测装置、免疫印迹检测装置、流式细胞分析装置、免疫组化检测装置、免疫层析检测装置或电化学发光检测装置。
16.根据权利要求13所述的系统，其特征在于，所述结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的表达水平；分析模块用于根据所述生物标志物C9、ERN1、FGA、ORM1、MPO和F13B的表达水平，分析出受试者是否患有Cronkhite-Canada综合征的风险；输出模块用于输出分析模块的分析结果。
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