KR102343240B1

KR102343240B1 - 대장암 환자에서 세툭시맙에 대한 내성 예측용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR102343240B1
Application number: KR1020200037220A
Authority: KR
Inventors: 김태유; 김황필; 박예림
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-12-23
Also published as: KR20210120474A

Abstract

본원은 KRAS/BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커 CXCL1/5을 개시한다. 본원에 따른 CXCL1/5 검출은 대장암에 대한 조직검사 없이, 혈액 샘플을 이용하여, 대장암 표적항암제에 대한 저항성 여부를 미리 판단함으로써 치료효과를 모니터링 할 수 있으며, 보다 효과적인 개인 맞춤형 치료전략을 제시할 수 있어, 궁긍적으로 대장암 치료 향상에 크게 기여할 수 있다.

Description

대장암 환자에서 세툭시맙에 대한 내성 예측용 바이오마커 조성물 {Biomarker composition for predicition of cetuximab treatment effects in colorectal cancer}

본원은 약물의 내성을 예측할 수 있는 써로게이트 바이오마커와 관련된 것이다.

21세기의 암 치료는 선택적으로 암세포가 갖는 분자생물학적인 특성을 표적으로 하는 약제들의 개발과 이를 토대로 한 표적항암제(molecular targeted treatment)의 개발로 암 치료의 패러다임은 급속히 변화하고 있다.

그러나, 모든 환자가 표적항암제의 치료 효과를 볼 수 있는 것은 아니며, 효과가 있는 경우에도 치료 중에 내성이 발생해서 치료 효과가 지속하지 않는 것이 문제점이 있다. 종양은 단일 클론 질환으로 이해되어 왔으나, 종양 내 이질성(Heterogeneity)의 중요성이 부각되면서, 이를 극복하지 않고는 암의 완치를 기대하기 어렵다는 현실적 난제에 봉착하였다. 종양이 발생하고 다양성이 생기는 기전에는 다양한 설명이 있으나, 소수의 암 기원세포에서 분화하는 과정에서 다양성이 발생한다는 Hierarchical model과 암 세포는 모두 비슷한 분열능이 있으며, 증식 과정에서 생기는 유전학적 변화로 다양성이 생긴다는 clonal evolution model이 가장 중요하다. 실제로, 항암제를 사용한 후에 종양 내 암 기원세포의 빈도가 높아지며, 이는 항암제 내성과 직접적으로 관련되어있다. 이론적으로, 종양세포 모두가 비슷한 분열능을 가진다면 종양세포를 하나라도 제거하지 못하면 암의 완치가 불가능하나, 종양의 다양성 및 항암제 내성이 소수의 암 기원세포와 연관된다면 이를 효과적으로 제거하는 경우 암의 완치를 기대할 수 있다.

대장암의 경우 표적치료제로 세툭시맙이 사용되고 있고, 이에 대한 내성획득 여부는 EGFR에 대한 단일클론항체인 세툭시맙(cetuximab)의 경우에는 KRAS 돌연변이 여부를 바이오마커로 사용하고 있다. KRAS 돌연변이가 없는 대장암의 경우에는 cetuximab이 치료효과를 보이지만 KRAS 돌연변이가 있는 경우에는 치료를 하더라도 효과가 없다.

환자별 암의 분자적 분석을 위하여 암 조직 검체가 주로 이용 되어 왔으나, 조직을 얻는 방법은 침습적일 수 밖에 없어, 위험 및 비용 등을 고려할 반복 검사가 현실적으로 매우 어렵다. 그 결과 한 환자에서의 암의 공간적 이질성(tumor heterogeneity) 및 치료에 따른 시간적 이질성(clonal evolution), 항암치료 후 발생하는 항암제에 대한 저항성의 기전을 파악하기 어렵다는 단점이 있었다. 반면 혈액검체는 종양내 이질성을 반영하기에 항암제 저항성 기전을 파악하기에 적합한 모델이며, 혈액 검체를 활용하는 cfDNA(cell free DNA)를 통한 검사법은 검체를 얻기가 쉽고 환자가 감수해야 하는 위험 및 비용이 적어, 조직을 통한 검사법의 한계를 극복할 수 있다.

따라서 이러한 혈액검체를 이용한 KRAS의 써로게이트 마커의 발굴이 필요하다.

대한민국 특허출원 2018-0058631은 대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 항암제 세툭시맙 내성여부를 검출하고 있으나, 바이오마커로 EphB3의 존재여부, 발현정도를 검출한다.

대한민국 특허출원 10-2014-0182573은 암 환자의 예후 및 항암제 감수성 예측용 마커 조성물에 관한 것으로, 세툭시맙 항암제는 개시하고 있지 않으며, CXCL1을 포함하는 유전자 분류자(classifier) TCA19를 바이오마커로 사용하고 있으나, 세툭시맙 및 이와 연관된 KRAS, BRAF를 CXCL1/5를 통하여 예측하는 것에 대해서는 개시하고 있지 않다.

본원은 대장암에서 세툭시맙에 대한 내성을 유발하는 KRAS/BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 마커로, 대장암에 대한 조직검사 없이, 혈액 샘플을 이용하여, 대장암 표적항암제에 대한 저항성 여부를 미리 판단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측을 위한 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5)의 써로게이트 바이오마커 및 그 용도를 제공한다.

본원에 따른 바이오마커는 대장암에서 세툭시맙에 대한 내성을 발생시킬 수 있는 RAS 또는 BRAF 유전자 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커로서, 본원에 따른 바이오마커의 혈액에서의 발현량 증가는 상기 세툭시맙에 대한 내성 발생과 연관된 것이다.

본원에 따른 써로게이트 바이오마커는 대장암에서 KRAS 또는 BRAF 돌연변이 발생 여부에 대한 써로게이트 바이오마커로서, 상기 돌연변이는 각각 61번째 아미노산의 글루타민에서 루이신으로의 돌연변이(KRAS Q61L) 및 BRAF V600E(600번째 아미노산의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이(BRAF V600E)에 의한 것이다.

일 구현예에서 본원은 혈액에서 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5) 바이오마커 중 하나 이상 유전자 또는 단백질의 검출용 물질을 포함하는 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물을 제공한다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 써로게이트 바이오마커는 대장암 특히 세툭시맙의 치료를 고려하는 진행성 대장암의 내성 발생 예측에 사용된다.

본원에 따른 써로게이트 바이오마커를 단백질 수준에서 검출할 수 있는 물질은 본원 바이오마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics), 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함한다.

본원에 따른 써로게이트 바이오마커를 핵산 또는 유전자 수준에서 검출할 수 있는 물질은 본원 바이오마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열을 특이적으로 인식하는 프라미어쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함한다.

일 구현예에서 본원에 따른 바이오마커 또는 조성물은 키트의 형태로 제공되며, 상기 키트는 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 핵산증폭용 키트로 제공될 수 있다. 본원에 따른 바이오마커를 검출하는 구체적 방법에 따라서 이러한 키트를 구성하는 물질, 성분 및 물품은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 검출결과에 따라 대장암 환자의 세툭시맙 내성 발생여부를 판단하는 대장암 환자의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원은 대장암 환자의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측에 대한 정보를 제공하기 위해 상기 대장암 환자에서 유래된 예를 들면 채혈 등에 의해 외부로 배출된 혈액 샘플을 제공하는 단계 및 상기 혈액에서 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5) 바이오마커 중 하나 이상 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과를 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측과 연관시키는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커의 상기 혈액에서의 발현량 증가는 상기 세툭시맙에 대한 내성이 발생할 것으로 예측되는 것인, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측을 위한, 인비트로에서 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커 검출 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에서 바이오마커의 발현량 측정은 단백질 수준에서 진행되며, 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이를 이용한 측정을 포함한다.

본원에 따른 방법에서 바이오마커의 발현량 측정은 유전자 또는 핵산 수준에서 진행되며, 예를 들면 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏을 이용한 측정을 포함한다.

본 발명의 바이오마커 CXCL1/5의 발현 양상은 KRAS/BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 마커로, 대장암에 대한 조직검사 없이, 혈액 샘플을 이용하여, 대장암 표적항암제에 대한 저항성 여부를 미리 판단함으로써 치료효과를 모니터링 할 수 있으며, 보다 효과적인 개인 맞춤형 치료전략을 제시할 수 있어, 궁긍적으로 대장암 치료 향상에 크게 기여할 수 있다.

구체적으로 예를 들면 본 발명은 혈액내 CXCL1/5의 발현수준을 분석하여, 치료시작시 세툭시맙에 치료반응을 보이던 환자가 치료 시작 후에 세툭시맙 저항성을 획득하였는지 여부를 조직검사 없이도 간단한 혈액 검사로 예측할 수 있다.

또한 본원에 따른 바이오마커를 이용한 검사 결과에 따라 효과를 보일 가능성이 높은 환자를 선별하여 치료하는 개별화 맞춤 치료가 가능한다. 아울러 불필요한 고가의 치료약제 남용을 줄여서, 제한된 의료자원의 효과적 분배, 사회 전체의 의료비 부담경감을 가능하게 한다.

도 1a은 세툭시맙에 대한 내성 획득에 따른 유전자 분석을 위한 인비트로 모델을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 세툭시맙 표적항암제에 대하여 반응성에 있어 고감수성(higher sensitive)을 갖는 대장암 세포주 NCI-508 세포주를 이용하여 지속적으로 표적항암제에 6개월 동안 노출을 시켜 세툭시맙 내성 세포주를 확립한 결과(왼쪽) 및 이러한 세포주의 특징(오른쪽)을 나타낸다.
도 1c는 확립된 세툭시맙 표적항암제에 대한 내성 단일 세포들의 특징적인 유전학적 변이들을 발굴하기 위해 whole exome sequencing/whole transcriptome sequencing을 수행한 결과로, 단일 세포별 특정 유전자의 변이가 다름을 확인할 수 있었다. 내성 획득 단일 세포들은 heterogeneity를 갖고 있기 때문에, 같은 세포주라도 각각 다른 KRAS, BRAF와 같은 돌연변이를 획득하기 때문이다. 관련 유전자에 대하여 기능 분석 구체적으로 KRAS, 및/또는 BRAF 돌연변이로 인한 cetuximab 저항성 획득, MAPK 경로의 활성화 그리고 EMT(Epithelial to mesenchymal transition) 현상증가 분석을 수행한 결과이다. 각 색은 내성획득단일세포와 그의 모세포의 whole exome sequencing 분석을 한 결과이다. 즉 같은 모세포로부터 발생한 내성획득단일세포이지만 다양한 유전체 변화가 있어서 heterogeneity를 가진다는 것을 의미한다.
도 2는 NCI-H508 세포주로부터 cetuximab 내성 획득 단일 세포주들의 cetuixmab의 반응성을 나타낸 결과이다. 모세포 보다 내성 획득 단일 세포주들은 cetuximab에 대해 저항성을 갖는 것으로 나타났다.
도 3은 도 1에 따라 선별된 단일 세포 유전체분석 결과를 바탕으로 계통도 분석을 시행하여 cancer evolution 확인한 결과이다. cancer evolution을 통해 KRAS/BRAF 돌연변이가 야생형으로부터 발생했다는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 세툭시맙 치료 개시 후에 이러한 돌연변이가 발생할 수 있음을 나타낸다.
도 4는 도 1에 따라 확립된 세툭시맙의 내성 단일 세포에서 CXCL1/5의 발현이 높은 것을 나타내는 결과로 이는 내성 단일세포들이 CXCL1/5를 분비한다는 것을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 CXL1/5 유전자의 암의 증식/진행/전이 과정에서의 작용기전을 검증한 결과이다.
도 6은 CXCL1/5의 유전자를 결손시켰을 때, 세포의 성장속도가 감소한 것을 나타내는 결과이다.
도 7은 대장암 환자(KRAS 야생형/돌연변이형)의 혈액으로부터 CXCL1의 분비량을 측정한 결과로, 돌연변이형을 가진 환자에서 CXCL1 더 높은 발현 양상을 나타냈다(왼쪽). 또한 KRAS 야생형 진단을 받고 Cetuximab 투여를 받은 환자의 CXCL1 분비량과 KRAS 돌연변이의 관계를 보여주는 결과이다(오른쪽). KRAS 돌연변이가 증가하면서 CXCL1의 분비량 또한 증가하였으며(Cetuximab에 대한 저항성 증가 예상), 그 후 저항성을 보임으로써 cetuximab 투여 중단 및 다른 약으로 바꾼 후 KRAS 돌연변이 감소 및 CXCL1 분비량 감소를 보인 결과이다.
도 8은 KRAS 야생형 진단을 받고 Cetuximab 투여를 받은 환자의 CXCL1 분비량과 KRAS 돌연변이의 관계를 보여주는 결과이다(왼쪽). KRAS 돌연변이가 증가하면서 CXCL1의 분비량 또한 증가하였으며(Cetuximab에 대한 저항성 증가 예상), 그 후 저항성을 보임으로써 cetuximab 투여 중단 및 다른 약으로 바꾼 후 KRAS 돌연변이 감소 및 CXCL1 분비량 감소를 보였다. 또한 BRAF 야생형 진단을 받고 Cetuximab 투여를 받은 환자의 CXCL5 분비량과 BRAF 돌연변이의 관계를 보여주는 결과이다(오른쪽). BRAF 돌연변이가 증가하면서 CXCL5의 분비량 또한 증가하였으며(Cetuximab에 대한 저항성 증가 예상), 그 후 저항성을 보임으로써 cetuximab 투여 중단 및 다른 약으로 바꾼 후 BRAF 돌연변이 감소 및 CXCL5 분비량 감소를 보였다.

본원은 대장암에서 세툭시맙에 대한 내성 여부를 혈액 샘플에서 검출할 수 있는 써로게이트 바이오마커 CXCL1 및 CXCL5의 발견에 근거한 것이다.

본원에서는 단일세포 분석을 통한 표적항암제 내성 바이오마커를 혈액검체를 이용하여 전향적 임상검증을 하였다. 구체적으로 본원에 확립된 단일 세포 모델을 이용하여, 세툭시맙 획득 내성 세포주를 확립하고 이들 세포주에 KRAS Q61L 돌연변이 및 BRAF V600E 돌연변이가 있음을 발견 하였다.

또한 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 갖는 이들 세포주로부터, EMT(Epithelial mesenchymal transition)에 관여하는 CXCL1 및 CXCL5의 발현양이 모세포와 비교하였을 때 매우 높게 발현되어있는 것을 확인하였다.

아울러 그 기전을 규명한 결과 CXCL1/5 단백질은 CXCR2/MMP1/sHB-EGF 신호전달 축을 통하여 EGFR(Epidermal Growth Factor Recptor)를 활성화시켰으며, 그 결과 EGFR에 대한 단일클론항체인 세툭시맙(cetuximab)에 대한 내성을 유도하고 지속시키는 것을 규명하였다.

또한 임상 시료를 분석한 결과 본원에서 규명된 바이오마커 CXCL1 및 5는 세툭시맙 치료 동안 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 획득 한 대장암 환자의 혈장 및 혈청 샘플에서 높게 발현되었고, CXCL1/5의 발현 수준은 KRAS 또는 BRAF 돌연변이율과 높은 상관관계를 가지는 것을 확인하였다. 따라서, CXCL1/5의 발현량의 양상은 KRAS/BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.

본원에서 써로게이트 바이오마커는 암의 발생 및 항암제에 대한 내성과 연관성이 있는 KRAS 또는 BRAF 돌연변이 여부를 직접 검출하지 않고도, 이러한 유전자의 돌연변이 발생여부를 예측할 수 있는 바이오마커를 일컫는 것이다.

특히 KRAS 또는 BRAF의 돌연변이 검출을 위해서는 암이 발생한 부위의 조직 생검이 필요하나, 써로게이트 바이오마커는 혈액 시료를 사용한 검출이 가능하여, 환자의 편리성 및 비용적 측면, 위험 감소 등의 측면에서 월등히 우수한 측면을 가진다.

따라서 한 양태에서 본원은 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5)의 대장암에서 KRAS 또는 BRAF 돌연변이 발생의 써로게이트 마커로서의 용도에 관한 것이다.

일 구현예에서 KRAS 야생형으로 진단 받았던 환자가 세툭시맙 cetuximab 투여를 받고 상기 약물에 대한 내성 또는 저항성을 보였을 때에, 본원에 따른 바이오마커 검출을 통해서 KRAS 돌연변이가 발생을 예측하고, 보다 효과적인 다른 치료방향을 전환하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 써로게이트 바이오마커 CXCL1 및 CXCL5은 CXC 케모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이다. CXCL1 및 CXCL5의 NCBI 인간 유전자 정보는 다음과 같다: CXCL1 (NM_001511); CXCL5 (NM_002994).

본원에 따른 CXCL1 및 CXCL5 바이오마커는 대장암에서 발생하는 세툭시맙에 대한 내성과 연관된 KRAS 및 BRAF에 대한 써로게이트 마커로 사용된다.

세툭시맙(cetuximab)은 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 대한 키메릭(마우스/인간) 모노클로날 항체로서, EGFR의 억제자로 작용하며, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 두경부 암 등의 치료에 사용되나, 치료 중 내성 발생이 큰 문제로 대두되고 있다.

KRAS 및 BRAF 돌연변이는 세툭시맙 치료 전에 대장암 환자 또는 세툭시맙 치료 중에 발생할 수 있다.

RAS는 타이로신 인산화 효소기능을 갖는 인자 수용체로 인체 내에서 종양 형성에 관여하는 종양 단백질 또는 유전자로, 다양한 암에서 돌연변이가 관찰된다. RAS는 세 개의 기능적 구성원으로 HRAS, KRAS, NRAS 등 3가지가 존재한다. 일 구현예에서 RAS는 KRAS이다. 인간 KRAS 유전자 및 단백질의 서열을 알 수 있는 공개된 DB 번호는 다음과 같다: NM_004985 (NCBI); ENSG00000133703 (Ensembl)).

일 구현예에서 상기 KRAS 돌연변이는 KRAS Q61L, 즉 61번째 아미노산의 글루타민에서 루이신으로의 돌연변이이다.

BRAF는 세린/쓰레오닌 프로테인 카이나제 B-Raf로 불리우며, 세포내로 세포성장과 관련된 신호를 전달하는 분자로서 다양한 암에서 돌연변이가 관찰되었다. 인간 BRAF 유전자 및 단백질의 서열을 알 수 있는 공개된 DB 번호는 다음과 같다: NM_001354609 (NCBI); ENSG00000157764 (Ensembl).

일 구현예에서 BRAF 돌연변이는 BRAF V600E, 즉 600번째 아미노산의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이다.

본원에 따른 바이오마커가 사용되는 대장암은 세툭시맙 치료 전에 또는 치료 개시 후, 예를 들면 세툭시맙 투여 중에 돌연변이가 발생하였고, 이에 의해 세툭시맙에 대한 내성이 발생할 수 있으나, 이러한 내성 발생은 오로지 대장에 대한 조직검사로만 확인이 가능하기 때문에, 혈액 써로게이트 마커는 편리성 및 비용절감 등의 측면에서 유용성이 매우 크다.

본원에 따른 일구현예에서는 세툭시맙의 치료를 고려하는 진행성 대장암의 내성 발생 예측에 사용된다.

본원에서 진행성 대장암이란, 조직이 고유 근육층이나 그 이상을 침범하였거나 주변 림프절에까지 전이된 상태이며, 단순한 외과적인 절제로는 치유 가능성에는 한계가 있기 때문에 외과적 수술 및 수술후 보조 항암제 투여 뿐만 아니라, 수술전에 방사선 치료가 필요한 대장암을 일컫는 것이다.

일 구현예에서는 본원에 따른 바이오마커 검출용 물질을 포함하는 조성물 또는 키트의 형태로 제공될 수 있다.

본원에 따른 바이오마커는 단백질 또는 유전자 수준에서 측정될 수 있고, 이러한 측정에 사용된 물질이 검출용 물질로, 조성물 또는 키트에 포함될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 분석으로 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

예를 들면 일반적으로 암 환자들은 항암제를 투여하기 전부터 혈액 채취를 시작하여 정기적으로 혈액 체취 및 검사를 진행을 하게 되는데, 이 때 CXCL1 및 5의 발현양 양상 분석결과, 만약 증가하는 현상을 보인다면 KRAS와 BRAF 돌연변이를 획득했을 가능성이 높은 것으로 판단을 하고, 이를 근거로 세툭시맙의 투여를 개시하지 않거나 또는 중단하고 다른 치료방법을 선택할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 일 구현예에서는 세툭시맙 대신에 MEK 억제제 또는 BRAF 억제제를 처리하였을 때에, CXCL1.5의 발현양도 감소시킬뿐만 아니라 항암 효과도 있는 것으로 나타났다.

본원에 따른 마커는 정량적 분석을 통해 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질의발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다. 일 구현예에서 이러한 본원에 따른 바이오마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다. 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 검출용 물질은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 마커의 정량적 분석에는 공지된 핵산 및 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 질량분석기 또는 항체와 같은 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정략적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 시스템, 핵산 증폭 시스템, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

일 구현예에서는 ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA(Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱(예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에서 본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

다른 양태에서 본원은 전이성 대장암 환자의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측에 대한 정보를 제공하기 위해,상기 대장암 환자의 외부로 배출된 혈액 샘플을 제공하는 단계, 상기 대장암은 RAS 또는 BRAF 돌연변이를 갖으며, 상기 돌연변이는 각각 KRAS Q61L(61번째 아미노산의 글루타민에서 루이신으로의 돌연변이) 돌연변이 및 BRAF V600E(600번째 아미노산의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이) 돌연변이이고; 상기 혈액에서 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5) 바이오마커 중 하나 이상 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계, 상기 바이오마커는 상기 대장암의 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커이고; 및 상기 측정 결과를 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측과 연관시키는 단계로, 상기 바이오마커의 상기 혈액에서의 발현량 증가는 상기 세툭시맙에 대한 내성이 발생할 것으로 예측되는 것인, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측을 위한, 인비트로에서 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커 검출 방법에 관한 것이다.

본원의 방법에서 마커의 발현량의 검출은 단백질 및/또는 핵산수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 앞서 언급한 바와 같다.

본원에 따른 방법에 사용되는 생물학적 시료는 검사 대상 대장암 환자 유래의 외부로 배출된 혈액이다. 혈액은 전혈 및 혈장을 포함한다. 일 구현예에서 생물학적 시료는 혈장이다.

본원의 방법에 따른 마커의 검출은 정량적 검출을 포함하는 것으로, 세툭시맙 치료가 개시된 환자의 세툭시맙에 대한 내성 획득의 예측에 사용될 수 있다.

본원 방법에서 마커의 검출 결과를 세툭시맙에 대한 내성 예측과 연관시키는 단계는 결정된 마커의 단백질 양, 또는 핵산의 양을 대조군, 예를 들면 세툭시맙 내성이 발생하지 않은 대조군 세포 내의 발현양, 또는 세툭시맙 내성이 발생하지 않은 환자의 혈액 시료에서 결정된 상기 마커의 검출결과와 비교하여 이를 근거로 판단하는 것이다. 본원에서 바이오마커는 대조군과 비교하여 내성이 발생이 예측되는 환자의 혈액에서 차별적으로 발현되며, 대조군의 검출 결과와 비교하여 본원에 따른 마커의 양이 유의하게 증가한 경우, 대장암 환자에서 세툭시맙 치료에 대한 내성이 발생할 것으로 예측할 수 있다. 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상체의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상체의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 세툭시맙 내성을 갖는 인비트로 모델 제조

세툭시맙 표적항암제에 대해 고 감수성을 갖는 한 대장암 세포주 NCI-H508 세포주(한국세포주은행 KCLB NO.10253)를 배양하면서 지속적으로 표적항암제에 6개월 동안 노출을 시켜 세툭시맙 내성 세포주를 도 1a와 같이 수립하였다.

NCI-H508은 37도, CO2 5% 환경에서 배양되었으며, 배지조건은 RPMI1640 ( + heat inactivated fetal bovine serum (FBS) 10%, Gentamycin 1%)의 media에서 배양하였다.

세툭시맙(MERK millipore)은 100ug/ml의 농도로 매 2일마다 3개월 동안 배지에 추가하였다.

세툭시맙 내성 세포주는 단일 콜로니 형태로 분리하여 내성 세포주를 확립하였다. 이어 MTT 분석(NAD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes based solution), western blot(p-EGFR, p-BRAF, p-MEK, 또는 p-ERK 항체)을 수행하여 세툭시맙 내성을 확인하여, 내성을 갖는 세포주 만을 선별하여 사용하였다.

실시예 2. 대장암 표적 항암제 내성 예측 바이오마커 선별

실시예 1에서 확립된 단일세포의 유전체·단백체 통합분석을 통한 세툭시맙 저항성 예측 바이오마커를 선별하였다.

구체적으로 실시예 1에서 확립된 세툭시맙의 내성 단일세포들은 10개 이상 개별 whole exome sequencing(WES)/ whole transcriptome sequencing(WTS)을 수행하였다. 서열 분석은 NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB)를 제조사의 방법대로 the Illumina HiSeq 2500 platform 장비를 사용하여 수행하였다.

이어 WES/WTS 통합 분석 후 (WES 결과와 WTS 결과를 통합하여 TARGET을 잡고 연관성을 분석) 단일세포들의 heterogeneity 확인하였다(도 1c 참조). 내성 획득 단일 세포들은 heterogeneity를 갖고 있기 때문에, 같은 세포주라도 각각 다른 KRAS, BRAF와 같은 돌연변이를 획득하기 때문에, 이를 확인하였고, 이러한 돌연변이들로 인해 CXCL1/5의 발현양이 증가하였다.

또한 단일 세포 유전체분석 결과를 바탕으로 계통도 분석을 시행하여 cancer evolution 확인하였다(도 3 참조). 이를 위해 Illumina사의 HiSeq X Ten Sequencing 장비 및 HiSeq 4000이란 seqeuncing platform 사용하였고, 또한 결과 분석은 SureSelect V4이라는 프로그램을 사용하여 분석하였다. Cancer evolution을 통해 KRAS/BRAF 돌연변이가 야생형으로부터 발생했다는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 세툭시맙 치료 개시 후에 이러한 돌연변이가 발생할 수 있음을 나타낸다.

또한 내성이 없는 모세포주와 비교하여 특이적 유전체 변이(SNV, in/del, amplification, loss, fusion-gene)를 분석하였다.

그 결과 특히 내성이 없는 모세포주와 비교하여 내성획득 세포주에 KRAS Q61L(61번째 아미노산의 글루타민에서 루이신으로의 돌연변이) 돌연변이 및 BRAF V600E(600번째 아미노산의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이) 돌연변이가 있음을 발견 하였다(도 3).

또한 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 갖는 이들 세포주로부터 특이 유전자 발현 양상을 분석하여 세툭시맙 내성 바이오마커 후보들을 발굴하여 분석한 결과 세툭시맙의 내성 단일세포들은 CXCL1 및 CXCL/5의 발현이 높은 것으로 나타났다(도 4). 이러한 CXCL1/5의 발현 수준은 KRAS 또는 BRAF 돌연변이율과 높은 상관관계를 가지는 것을 확인하였다(도 4, 7 및 8). 또한 수립된 세툭시맙의 내성 단일세포들을 배양한 배지에서도 CXCL1/5 발현이 높은 것을 배양 배지를 모아서 필터를 한 후 ELISA를 통해 확인하였고, 이는 내성 단일세포들이 CXCL1/5를 분비한다는 것을 나타낸다.

이러한 결과는 CXCL1 및 5의 발현양의 양상은 KRAS/BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 3. 선별된 바이오마커 검증 및 내성기전 규명

암의 증식/진행/전이 과정에서의 CXCL1 및 5 유전자의 작용기전을 다음과 같이 검증하였다.

실시예 2에서 선별된 CXCL1 및 5 유전자는 lenti-virus 시스템을 이용하여 NCI-508 세포주에 전달이입하여 CXCL1 및 5 유전자를 발현하는 세포주를 수립하였다.

이어 CXCL1 및 5 유전자를 발현하는 상기 세포주에 0.1ug/ml, 1ug/ml, 10ug/ml, 100ug/ml로 세툭시맙 처리하고 72시간 후 MTT 분석(AD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes based solution)으로 확인하였다.

또한 CXCL1 및 5 유전자를 발현하는 세포주 대상으로 웨스턴블랏을 이용하여 하위 신호전달 체계를 확인하여 내성기전을 규명하였다. 웨스턴블랏의 경우, 세툭시맙을 10ug/ml, 100ug/ml로 처리하고 24시간 후 확인하였다. 웨스턴블랏에 사용한 항체는 다음과 같다: phosphorylated (p)-EGFR (pY1068), p-BRAF (pS445), p-MEK1/2 (pS218/222), p-ERK1/2 (pY204), 모두 Cell Signaling Technology.

그 결과 도 5b에 나타난 바와 같이, 세툭지맙 저항성 세포주(CR1-CR12)들은 모세포주(NCI-508)와 비교하여 EGFR 상위 분자(AKT, ERK, BRAF, MEK)의 신호가 효과적으로 저해되지 않는 것으로 나타났고, 내성의 기전임을 나타낸다.

실시예 4. 차세대 유전체 분석 결과와 임상 정보의 연관 분석

세툭시맙 표적 항암제에 대한 내성 바이오마커 CXCL1/5)를 발굴 후 임상적 검증을 위해 전형적 임상코호트 구축 하여 혈액샘플을 이용하여 실험을 수행하였다. 대장암 환자는 미리 고지되었고, 동의하에 혈액샘플을 채취하였다. 총 92명의 환자이며, 48명은 KRAS 야생형환자, 44명은 KRAS 돌연변이형 환자이다.

구체적으로 전이성 대장암으로 진단 확인 후 첫 항암화학요법(FOLFIRI+cetuximab) 시작 전(baseline) 혈액 샘플 채취하고, 항암화학요법 시작 후 첫 반응 평가 시, 그리고 질병 진행으로 중단 시 혈액 샘플 12-15ml을 채취한 후 채혈 직후 혈장을 분리하여 시퀀싱 진행시까지 보관하였다. 이어 환자의 혈장으로부터 DNA를 추출하여 Droplet PCR을 통해 KRAS Q61H, KRAS G12V, BRAF V600E를 확인하고, 혈장에서 CXCL1/5 발현량을 확인하여 바이오마커 확인 및 유효성 검증을 하였다. 상기 결과와 임상 정보의 연관 분석을 수행하였다. 결과는 도 7 및 8에 기재되어 있으며, 분석 결과 KRAS, BRAF 돌연변이 발생은 CXCL1/5의 양이 깊은 관련성이 있는 것을 확인하였다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

혈액에서 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5) 바이오마커 유전자 또는 단백질의 검출용 물질을 포함하는 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물로,
상기 바이오마커는 상기 대장암의 KRAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커로서, 상기 바이오마커의 혈액에서의 발현량 증가는 상기 세툭시맙에 대한 내성 발생과 연관된 것인, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 대장암은 세툭시맙의 치료를 고려하는 진행성 대장암인, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 단백질 검출용 물질은 상기 바이오마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics), 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함하는, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유전자 검출용 물질은 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열을 특이적으로 인식하는 프라미어쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 키트의 형태로 제공되며, 상기 키트는 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 핵산증폭용인, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측용 조성물.
전이성 대장암 환자의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측에 대한 정보를 제공하기 위해,
상기 대장암 환자의 외부로 배출된 혈액 샘플을 제공하는 단계,
상기 혈액에서 CXCL1 (C-X-C motif chemokine ligand 1) 및 CXCL5 (C-X-C motif chemokine ligand 5) 바이오마커 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계, 상기 바이오마커는 상기 대장암의 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커이고; 및
상기 측정 결과를 상기 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측과 연관시키는 단계로, 상기 바이오마커의 상기 혈액에서의 발현량 증가는 상기 세툭시맙에 대한 내성 발생이 예측되는 것인, 대장암의 세툭시맙에 대한 내성 발생 예측을 위한, 인비트로에서 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커 검출 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 발현량 측정은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이를 이용한 측정인, 인비트로에서 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커 검출 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 유전자 발현량 측정은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏을 이용한 측정인, 인비트로에서 RAS 또는 BRAF 돌연변이에 대한 써로게이트 바이오마커 검출 방법.