TWI598444B - 用以評估乳癌罹患風險之方法及基因標記 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種乳癌罹患風險之評估方法,其特徵在於評估因雙酚A而導致罹患乳癌的易感性基因的表現量之檢測方法。
對於婦女族群而言,乳癌為最常見之癌症之一,每年全球約有130萬名婦女罹患乳癌,其中46.5萬名因其殞命,而儘管科學技術及醫學水準不斷改革演進,相較於過去已能顯著提前發現癌變徵兆的時間以及術後存活的機會,但國內乳癌發生率仍呈現倍數增加的情形。
因此目前市面上有許多乳癌檢測之產品及方法,以進行乳癌的預測及檢查,但其檢測效果之準確度仍需加強,如美國食品藥品管理局(FDA)所認證的MammaPrint公司之乳癌檢測產品,其用70個基因進行乳癌篩檢,其特異性為82%,而敏感度為85%,仍是會有誤診的情況。
內分泌干擾物質為”干擾負責維持生物體內恆定、生殖、發育或行為的內生賀爾蒙之外來物質,影響荷爾蒙的合成、分泌、傳輸、結合、作用及排除”。雙酚A(Bisphenol A;BPA)為常見的內分泌干擾物質,其中雙酚A在生活周遭可說是無所不在,過去研究顯示,當聚碳酸酯(PC)
材質的器皿被重複刷洗使用,或是所盛裝之物質溫度過高及酸鹼值較為極端時,會增加雙酚A滲入食物及飲水的程度,因此民眾有非常高的頻率暴露在雙酚A等環境賀爾蒙中。故目前內分泌干擾物質近期也受到許多學者及相關規範機構關注,特別是針對此類物質對健康所造成負面影響之相關議題。
因此發展環境荷爾蒙(如雙酚A)可能影響乳癌發生風險之準確度高的相關生物分子標記,以提高乳癌早期預防及診斷之機會,為刻不容緩之研究主題。
本發明是利用習知的基因微陣列晶片表現資料庫,交集出雙酚A(Bisphenol A;BPA)相關基因調控路徑與乳癌易感性基因具有高度相關性。首先,以暴露於雙酚A之MCF-10F細胞株,並進一步與乳癌組織之生物晶片(皆為GPL570平台)資料進行交集比對,基因表現量皆達顯著差異者,得到60個共同表現之嶄新候選基因,並利用敏感度、特異度以及接收者操作特徵曲線(Receiver Operator Characteristic curve;ROC curve)之曲線下的面積(Area Under Curve;AUC)來評估準確率。進一步再與其他不同生物晶片平台(GPL571及GPL96)之乳癌晶片進行驗證,選出敏感度及特異度皆達75%以上,且AUC大於80%之6個最具顯著性嶄新基因,並進行最佳之預測基因排列組合,找出最適合環境荷爾蒙影響乳癌異感性之相關基因或基因組合。本發明顯示乳癌與環境荷爾蒙相關之基因路徑有高度顯著相關,無論以訓練模式(training set)及驗證模式(validation set)之
基因組,皆顯示可有效預測或評估受測檢體是否為環境荷爾蒙誘發之乳癌。顯示以該6個最具顯著性嶄新基因為標的之檢測方法可用於評估易受環境荷爾蒙(如雙酚A)影響之罹患乳癌風險的診斷,具有發展成乳癌生物分子標的之潛力。
本發明所篩選的基因群或其組合可更進一步其他乳癌相關基因進行搭配組合,以探究或判斷環境荷爾蒙影響之乳癌的基因路徑以及乳癌的病程等。而該些基因亦可進一步發展為治療或預防環境荷爾蒙所誘發之乳癌的治療標的。
本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種,且除非明顯地另有所指,表示單數時亦包括複數。於申請專利範圍中和”包含”一詞一起使用時,該用語「一」可意謂一個或超過一個。
本文中的用語「或」其意同「及/或」。
本發明提供一種乳癌罹患風險之評估方法,其步驟包含:(a)取得一個體之一樣本;(b)量測該樣本的至少兩個基因標記之表現量,其中該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組;及(c)將該樣本的該至少兩個基因標記之表現量與一控制組的相對應的至少兩個基因標記之表現量相比,若該樣本的該至少兩個基因標記之表現量為該控制組的相對應的至少兩個基因標記之表現量為兩倍以上及/或0.5倍以下時,藉此判定該個體具有受雙酚A影響
而導致罹患乳癌症的風險,其中用於該基因標記之表現量相比為兩倍以上的基因標記為FN1,用於該基因標記之表現量相比為0.5倍以下的基因標記為TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36。
術語「乳癌」係指乳房之任何增生性病變或增生性異常,包括(例如)良性病變、前惡性及惡性病變、實體腫瘤及轉移性疾病(局部轉移,例如III期;與更廣泛轉移,例如IV期)。乳癌包括(但不限於):腺癌、小葉(小細胞)癌瘤、管內癌、髓性乳癌、黏液性乳癌、管狀乳癌、乳頭狀乳癌、佩吉特氏病(Paget's disease)及發炎性乳癌。乳癌亦係指起源於乳房之轉移性病變的於諸如肺、肝及骨之其他器官中之疾病。乳癌亦涵蓋激素反應性癌症與激素非依賴性癌症。
本文中用語「個體(subject)」一詞係指動物。於一較佳具體實施例中,該個體係指哺乳動物,其包含但不限於人類、靈長類、鼠類、貓類、狗類、牛類等。於一更佳具體實施例中,該個體係指人類。
本文中術語「樣本」係指一種生物樣本,例如由個體中所分離出之組織或液體(包含但不限於血漿、血清、腦脊液、淋巴液、眼淚、唾液或組織切片)或在體外細胞培養組成物。於一較佳具體實施例中,該樣本為一血液。而術語「血液」一詞可為一全血、一血漿或一血清。在一更佳具體實施例中,所述血液為一血漿。
本文中「控制組」包含但不限於健康組,即健康的個體群。於一較佳具體實施例中,該控制組係指非罹癌組,即非罹癌的個體群。
本文中所述之”該樣本的該至少兩個基因標記之表現量與一控制組的相對應的至少兩個基因標記之表現量相比”意指若當從該樣本偵測FN1及TXNIP基因的表現量時,則與該控制組的相對應的FN1及TXNIP基因的表現量進行相比,其餘情況依此類推。
術語「基因標記(gene marker)」意指一種在個體內的基因,因特定疾病而發生表現量的改變(上升或下降),而可作為用於指引特定疾病存在與否或異常風險之增加。「基因標記」或「分子標記(molecule marker)」等用語可交替地使用。
本發明的乳癌罹患風險之評估方法會依據所偵測的基因導致判斷的方式有所改變,例如FN1基因屬於雙酚A與乳癌間的上調基因,因此評估時,該樣本的該FN1基因之表現量需為該控制組的表現量的兩倍以上時,則判定為高風險;而TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36屬於雙酚A與乳癌間的下調基因,因此評估時,則是看該樣本的該些基因(包含TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36)之表現量為該控制組的表現量的0.5倍以下時,則判定為高風險。
因此本發明的評估方法會視所偵測的基因,其風險評估的基因表現量的判斷方向會有所不同。舉例來說,當FN1與TXNIP基因搭配偵測時,則需FN1基因需高於控制組的表現量兩倍以上且TXNIP基因低於控制組的表現量0.5倍以下時,來判定該個體具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險,其餘基因標記搭配組合的情況以此類推。
本發明的評估方法是從6個基因(FN1、TXNIP、TGFBR3、
ADCK3、FHL1及CD36)中任選2、3、4、5個或全選來評估該個體是否具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險。於一具體實施例中,該評估方法以FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記進行評估/判斷。於一較佳具體實施例中,該評估方法以5個基因標記進行判斷,該5個基因標記為:(1)TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36;(2)FN1、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36;(3)FN1、TXNIP、ADCK3、FHL1及CD36;(4)FN1、TXNIP、TGFBR3、FHL1及CD36;(5)FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3及CD36;或(6)FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3及FHL1。
於一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因。
於另一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP及TGFBR3基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP及TGFBR3基因。
於一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1及TXNIP基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1及TXNIP基因。
上述皆具有預測或評斷該個體是否具有易受雙酚A影響而罹患乳癌之風險,且其預測結果相當精確。本發明所使用的基因標記的檢測效果之特異度(或稱特異性)的範圍為90至100%,較佳為94至100%;
而敏感度的範圍為90至100%,較佳為95至100%。
本文所使用之「基因」或「基因標記」一詞不僅包括DNA,亦包括其之mRNA、cDNA及RNA。本文所用的「基因標記之該表現量」一詞並不限於DNA、mRNA、cDNA、RNA或蛋白質之表現量;更進一步來說,FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因的DNA、mRNA、cDNA、RNA、蛋白質及/或其組合之表現量(即DNA及RNA表現量均用來檢測),亦可做為上述方法中預測罹患乳癌風險的指標。於一較佳具體實施例中,該基因標記之該表現量係一mRNA或一蛋白質之表現量。於一更佳具體實施例中,該基因標記之該表現量係一mRNA之表現量。
前述FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記的表現量可為mRNA之表現量,故本發明的基因標記在癌症檢體樣本與非癌症的檢體樣本中(或同一病患在治療前後所取得的檢體樣本)之mRNA表現量的改變測定。任何熟習此技藝者可輕易地使用任何習知方法,包括但不限於北方墨點法(northern blotting)、反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction;RT-PCR)或即時聚合酶定量反轉錄鏈式反應(real time quantitative PCR;qRT-PCR)等習知相關mRNA分析技術測定而得。於一較佳具體實施例中,該mRNA之表現量係利用北方墨點法、反轉錄聚合酶鏈式反應或即時聚合酶定量反轉錄鏈式反應量測。
此外,前述FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記的表現量亦可為蛋白質表現量,而本發明之FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記在癌症檢體樣本與非癌症的檢
體樣本中(或同一病患在治療前後所取得的檢體樣本)蛋白質表現的改變,任何熟習此技藝者,可輕易的使用任何習知方法,包括但不限於酵素連結免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay;ELISA)、免疫螢光染色(immunofluorescence)、免疫組織化學法(immunohistochemistry)、酵素免疫分析法(enzyme immunoassay;EIA)、放射免疫分析(radioimmunoassay;RIA)或西方墨點法(western blotting)等習知相關蛋白質分析技術測定而得。
於另一具體實施例中,該基因標記之該表現量係指一基因標記之表現量的平均值。本文中「兩倍以上」一詞包含兩倍的情況,而「0.5倍以下」包含0.5倍的情況。
再者,上述檢測雙酚A所誘發乳癌之方法,亦可進一步利用管家基因(housekeeping gene)(如GAPDH)作為內參基因,用以將該樣本的該基因標記之該表現量標準化,以避免在量測該樣本之基因標記的表現量時所產生的誤差。詳細地說,當以上述方法檢測乳癌時,除了須量測該樣本的基因標記(如FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因)的該表現量外,亦須量測該樣本之一內參基因的表現量。接著,進行標準化,即進一步取得該基因標記之該表現量與該內參基因之該表現量之一比值,如此便可透過該比值篩檢該乳癌。舉例而言,當某一樣本於取樣時遭受污染或是破壞時,該樣本的內參基因的表現量很可能將因此產生改變(例如變成無法測得),故而該樣本的上述比值亦將因此變得異常。是以操作者便可透過上述異常之比值,推測可能無法透過該樣本獲得正確
之乳癌篩檢資訊。當然,內參基因的表現量亦可單純作為上述乳癌檢測方法的一指標(如判斷是否超過一預定值),而非必然需與該基因標記的表現量形成比值後方得作為判斷依據。此外,上述方法亦可透過進一步提供已知的乳癌的基因標記與內參基因之參考表現量比值或比值範圍,以作為該樣本的上述比值的比較依據。故於一具體實施例中,該方法進一步包含一(b’)步驟,介於(b)及(c)步驟之間,以該個體的一管家基因(housekeeping gene)表現量對該至少兩個基因標記之表現量進行標準化,其中該(c)步驟中的該至少兩個基因標記之表現量為標準化後的該至少兩個基因標記之表現量。
故本發明另提供一種乳癌罹患風險之評估方法,其步驟包含:(a)取得一個體之一樣本;(b)量測該樣本的至少兩個基因標記之表現量,其中該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組;(c)以該個體的一管家基因(housekeeping gene)的表現量對該樣本的該至少兩個基因標記之表現量標準化;及(d)將該標準化後的該樣本的該至少兩個基因標記之表現量與一控制組的相對應的該至少兩個基因標記之表現量相比,若該標準化後的該樣本的該至少兩個基因標記之表現量為該控制組的相對應的該至少兩個基因標記之表現量為兩倍以上及/或0.5倍以下時,藉此判定該個體具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險,其中用於該基因標記之該表現量相比為兩倍以上的基因標記為FN1,用於該基因標記之表現量相比為0.5倍以下的基因標記為TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36。
於一具體實施例中,該樣本為一血液。在一較佳具體實施例中,所述血液為一血漿。
該評估方法是從6個基因(FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36)中任選2、3、4、5個或全選來評估該個體是否具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險。於一具體實施例中,該評估方法以FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記進行判斷。於一較佳具體實施例中,該評估方法以5個基因標記進行判斷,該5個基因標記為:(1)TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36;(2)FN1、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36;(3)FN1、TXNIP、ADCK3、FHL1及CD36;(4)FN1、TXNIP、TGFBR3、FHL1及CD36;(5)FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3及CD36;或(6)FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3及FHL1。
於一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因。
於另一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP及TGFBR3基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP及TGFBR3基因。
於一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1及TXNIP基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1及TXNIP基因。
於一具體實施例中,該控制組的相對應的該至少兩個基因標記之表現量為一標準化後的該控制組的相對應的該至少兩個基因標記之表現量。所謂的”該標準化後的該控制組的相對應的至少兩個基因標記之表現量”係指該控制組的基因標記之表現量用該控制組的管家基因之表現量進行標準化。
此外,本發明亦提供一種預測受雙酚A影響而導致罹患乳癌之基因標記群組,其中該基因標記群組包含至少兩個基因標記,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組。
該基因標記群組是從6個基因(FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36)中任選2、3、4、5個或全選來預測/評估該個體是否具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險。於一具體實施例中,該基因標記群組以FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記進行預測/判斷。於一較佳具體實施例中,該基因標記群組以5個基因標記進行預測/判斷,該5個基因標記為:(1)TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36;(2)FN1、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36;(3)FN1、TXNIP、ADCK3、FHL1及CD36;(4)FN1、TXNIP、TGFBR3、FHL1及CD36;(5)FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3及CD36;或(6)FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3及FHL1。
於一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,
該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因。
於另一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP及TGFBR3基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP及TGFBR3基因。
於一具體實施例中,該至少兩個基因標記係選自於由FN1及TXNIP基因所組成的群組。於一較佳具體實施例中,該至少兩個基因標記為FN1及TXNIP基因。
本發明的基因標記可用於建立用於評估受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險之生物晶片(biochip),例如感測型晶片、微處理型晶片、或微陣列型晶片(microarray biochip)等。舉例言之,可依據本發明基因標記以設計一種DNA探針(DNA probe),並將其配置於一生物晶片中,僅須將受測者經亞硫酸鹽處理後之檢體置於該生物晶片中與該探針進行雜合(hybridization),即可立即獲知該受測者是否會因暴露雙酚A的環境下而易提高罹患乳癌之風險等相關資訊,藉此提升預測/診斷的效率。
本發明提供一用於評估受雙酚A影響而導致罹患乳癌風險之生物晶片,其包含一基因標記群組及一基材,其中該基因標記群組固定於該基材上,其中該基因標記群組包含至少兩個基因標記,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組。
本發明一種檢測受雙酚A影響所導致的乳癌之易感性基因
之套組,其包含至少兩個引子對,其中該至少兩個引子對係選自由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因之引子對所組成的群組。
本文中所述之「易感性基因」係指與疾病發生相關的基因。而該易感性基因,因為個體的差異會有不同的型別,經流行病學研究顯示,某種特定的基因型較易產生疾病(或稱疾病易感性),其發生率比一般人高,稱為易感性基因型。「疾病易感性」是指由遺傳決定的易於患某種或某類疾病的傾向性。
本文中術語「引子」係指用於PCR反應中,作為特定基因一端複製起始點中之DNA的一股,而該特定基因另一端複製起始點之DNA的另一股合稱為引子對,其可夾出所欲擴增之特定基因。
利用本發明之套組內的引子對,可偵測前述FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因標記的表現量,而可使用反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction;RT-PCR)或即時聚合酶定量反轉錄鏈式反應(real time quantitative PCR;qRT-PCR)等習知相關mRNA分析技術測定,得到個體是否易受雙酚A影響而罹患乳癌。
本發明提供一種檢測受雙酚A影響所導致的乳癌之易感性基因之套組,其包含至少兩個探針,其中該至少兩個探針係選自由:FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因之探針所組成的群組。該套組進一步包含一使用手冊,該使用手冊包含該至少兩個探針的使用資訊。
本文所用「探針」一詞為附著有習知可檢測標記或報導分子
(例如放射性同位素、配位體、化學發光劑或酶)之經分離核酸。該探針與靶核酸鏈互補,在本發明之狀況下,可與FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及/或CD36基因之DNA鏈互補。本發明之探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸,而且包括特異性結合靶DNA序列且可用於檢測靶DNA序列存在之聚醯胺及其他探針物質。
另外,本發明亦提供一種檢測受雙酚A影響所導致的乳癌之易感性基因之易感性基因之套組,該套組包含至少兩個抗體,其中該至少兩個抗體係選自由抗FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因蛋白質之抗體所組成的群組。該套組進一步包含一使用手冊,該使用手冊包含該至少兩個抗體的使用資訊。
該抗體可進一步帶有化學探針、螢光蛋白、放射性物質或酵素等,使該套組可直接進一步進行ELISA、免疫螢光染色、免疫組織化學法、酵素免疫分析法或放射免疫分析,或得基因標記之表現量。
是以,由於目前人們都易暴露於環境賀爾蒙中,而環境賀爾蒙(如雙酚A)有導致人們罹癌的可能環境賀爾蒙,因此本發明中提出之六個嶄新基因(即FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因),可作為檢測環境荷爾蒙誘發乳癌易感性之基因標記,即代表本發明的評估方法可診斷出一個體相較於其他個體於曝露於同樣的雙酚A的環境下,是否有較高的風險因雙酚A的影響而罹患乳癌。此外,現有之檢測乳癌之基因標誌須使用高達數十個甚至數百個基因進行檢測,故所需檢測之基因之時間與成本相當高,但本發明所需檢測基因新穎且數量較少,且由
訓練模式及驗證模式中發現在不同檢測生物晶片平台都擁有良好精確度,可作為檢測環境荷爾蒙導致乳癌易感性之基因標記,亦可大幅降低分析檢體之時間與成本,將可提供成本較低且預測結果精準之嶄新檢測方法。故本發明提供的檢測方法及檢測基因可快速且有效的評估病患是否具有因雙酚A之影響而罹患乳癌的易感性。
本發明可能以不同的形式來實施,並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本創作不同態樣及特點中的代表。所述實施例不限制在申請權利範圍中所描述的本發明的範圍。
(1)材料與方法
(a)基因晶片數據集(Microarray datasets)
來自相同陣列(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays,平台:GPL570)所選定之數據集,包含:(i)一個數據集用於以雙酚A(BPA)的處理過的細胞株(MCF-10F),MCF-10F細胞株(正常乳房上皮細胞),其被選為用於正常狀況的微環境變換的觀察,其暴露於10μM和1μM的雙酚A(BPA)兩週,並以獲得GSE32158之陣列中進行監測;及(ii)與微陣列表現資訊(microarray expression profiles)相關的兩個乳房組織為GDS4114和GDS3853。GDS4114包含6個周圍間質浸潤性
乳腺癌腫瘤之樣本及6個正常腫瘤的匹配樣本。腫瘤進展和轉移與宿主組織間質及腫瘤細胞之相互作用是密切相關的,而GDS3853包含14個導管原位癌(ductal carcinoma in situ;DCIS)樣本和5個健康組織樣本。
(b)生物信息學和統計方法
以Affymetrix公司的微陣列套件5.0版本(Microarray Suite Version 5.0;MAS5.0)所描述的進行標準化。利用基於R程式語言之Bioconductor的軟體套件中的BRB陣列工具(BRB-ArrayTools4.3.0 Beta 2)(http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)。該陣列工具程式係從癌症基因體解剖計劃(Cancer Genome Anatomy Project,http://cgap.nci.nih.gov/Pathways)獲得的策展Biocarta公司的路徑。為了分析基因組,本發明採用了LS/KS排列檢驗(LS/KS permutation test)、Efron-Tibshirani's基因集分析最大均值檢驗(Efron-Tibshirani's GSA maxmean)及1000排列的統計富集法(1000-permutation statistics enrichment method)以找到顯著的基因組。決定顯著基因組的閾值為0.05。
本發明連續進行兩次以雙樣本T檢定(two-sample t-test)的類別比較和基因組表達比較分析,以找到個別的候選基因。於管理的方法(supervised method)下,對暴露於BPA與控制組(兩類別的差異)、腫瘤與正常組織、雌激素接受體陽性與陰性、及高等(階段3和4)與低等(階段0、1和2)的倍率變化(fold change)分別進行評估。本發明的選擇標準是兩個類別間之倍率變化(FC)的臨界值≧2(表示上調)或≦-2(或0.5;表示下調),而此倍率變化於p值<0.01時被認定為顯著差異。
(c)生物路徑分析軟體
在基因組分析中,候選基因源自顯著Biocarta路徑資料庫,以及從雙酚A處理的細胞之乳癌數據集之比較中各個候選基因的重疊。本發明進一步匯集與雙酚A(BPA)相關顯著基因組的探針以呈現乳癌中的細胞途徑。故本發明使用生物路徑分析(Ingenuity Pathways Analysis;IPA)軟體(http://www.ingenuity.com)以確認顯著的標準路徑。根據基因匹配於IPA知識資料庫(IPA knowledge database)之策劃途徑的數量比率以及費雪精確性檢定(Fisher's exact test)所評估的P值以測定並排行該路徑。當連接到生物相互作用時,該分子網路可指出彼此相關的關係。該網路的分數是具有幾何分佈之費雪精確性檢定下之右尾的負對數(negative logarithm)。
(d)檢體萃取RNA
為檢驗這些候選基因之表現量,抽取血液檢體或組織,加入RNA萃取試劑(TRIzol® Reagent),抽血管離心取出白膜(buffy coat)層,加入淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque PLUS)中再離心,取出中間白色霧狀物加入磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline;PBS buffer)再離心,移去上清液加入磷酸鹽緩衝生理鹽水移至微小離心管後再離心,移去上清液加入RNA萃取試劑(TRIzol® Reagent),之後實驗步驟加入1-溴-3-氯丙烷(1-Bromo-3-chloropropane;BCP),混和均勻後再離心,將透明上清液移至新的微小離心管後加入肝糖(glycogen),混合均勻置放於-80℃冰箱三十分鐘後再加入異丙醇(isopropanol),靜置室溫十分鐘後離心,除去上清液加入70%酒精後再離心兩次,放置抽風櫃中風乾檢體,加水回溶即
得組織及血液中RNA檢體。
(e)即時聚合酶定量反轉錄鏈式反應(qRT-PCR)
將mRNA反轉錄為互補DNA(cDNA),並用以專一性化學物質(Taqman probe)放大FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因序列進行定量分析。以glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)當作管家基因(housekeeping gene)進行分析。
(2)結果
(a)找尋與比對候選基因
以雙酚A刺激乳房上皮細胞株(MCF-10F)之生物晶片與乳癌生物晶片資料基因表現量互相比對,且生物晶片皆使用GPL570平台,統計分析其倍率變化(Fold change)>2倍或<1/2倍,以及p<0.05,達顯著差異者納入候選基因群。於GPL570平台上,暴露於雙酚A之細胞株(GSE32158)(包含3017個基因)與習知的乳癌資料庫GDS4114(包含264個基因)和GDS3853(包含624個基因)交叉比對後,則可得到67個預測乳癌與雙酚A相關之易感性之嶄新基因群(如表一所示)。本發明進一步刪除已揭露於美國專利申請號:12/812215的專利中的7個基因,以剩下60個候選基因進行進一步篩檢。
表一、暴露於雙酚A之乳癌細胞株(GSE32158)與兩個乳癌資料庫間有重疊的67個候選基因
將上述60個基因進一步以GPL570平台分析之生物晶片所
交集之顯著嶄新基因,加以計算敏感度、特異度及接收者操作特徵曲線(receiver operating characteristic curve;ROC)之曲線下面積(area under curve;AUC),作為評估預測之準確性。本發明首先以敏感度及特異度皆達85%以上,且AUC大於90%之嶄新候選基因,作為挑選出檢測嶄新基因之標準(如表二),共有19個基因。
(b)篩選與評估雙酚A之基因或基因套組
以GPL570平台分析之生物晶片資料建立訓練模式,功能性基因分析則利用BRB陣列工具(BRB-ArrayTools)軟體、生物路徑分析(Ingenuity Pathway Analysis;IPA)軟體、Biocarta路徑資料庫、以及計算
敏感度、特異度及接收者操作特徵曲線(ROC)之曲線下面積(AUC)來評估準確率,其中AUC值愈大,表示準確率愈高。
(c)利用不同生物晶片平台進行驗證
由於不同生物晶片平台,常有穩定度不足的問題,因此本發明透過其他生物晶片平台之樣本(GPL571和GPL96;Affymetrix Human Genome platform)(樣本共有97例)建立驗證模式(參照Martin Koch的文獻(Microarrays 2012,1(2),84-94)),找出在不同生物晶片平台下雙酚A誘發基因表現量皆達顯著改變者,可能增加罹患乳癌風險。首先利用T分數(T-SCORE)將不同生物晶片基因表現量進行標準化,使各基因有相同的平均值與標準差,挑選出在GPL570與其他生物晶片平台(GPL571和GPL96)選出敏感度及特異度皆達75%以上,且AUC大於80%之嶄新候選基因。最後共發現有六個基因FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36,其中FN1基因屬於上調基因其應用於其他生物晶片平台下亦有良好之預測正確性,其中FN1基因屬於上調基因,其表現倍率要大於2倍,而TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因屬於下調基因,其表現倍率要小於0.5倍,故本發明的六個基因之基因表現量判斷方向會有所不同。
(d)挑選最佳之預測基因組合
本發明進一步利用敏感度、特異度及AUC值的大小排序分析中所得到上述重要基因集群,以挑選最佳之預測基因組合。以AUC值的大小排序之嶄新基因分別為FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36,本發明分別挑選出最佳兩個基因組合為:FN1及TXNIP,最佳三個
基因組合為:FN1、TXNIP及TGFBR3,最佳4個基因組合為FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3,以及任五個基因組合及六個最佳基因的組合,所計算出之敏感度、特異度及AUC值皆列於表三中。
如表三所述,本發現證實利用GPL570平台下以31位樣本進行分析,可得到之敏感度、特異度及AUC值皆達100%。
為了增加此結果之穩定度及外推性,本發明增加了其他生物晶片平台(GPL571及GPL96)以及樣本增加至97位(如表四所示)。
表四、各種平台上之乳癌的預測基因組合(6、5、4、3、2之基因組合)之敏感度、特異度與曲線下的面積
N:數量
從表四之結果證實最佳兩個基因:FN1及TXNIP的組合,敏感度為96.1%、特異度為95.2%及AUC值達98.7%;而最佳三個基因:FN1、TXNIP及TGFBR3的基因組合,其AUC值達99.4%;此外,最佳4個基因組合:FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3的組合,其AUC值達100%。而任五個基因組合及六個最佳基因的組合的AUC值達98.3至100.0%。顯示利用不同生物晶片平台進行檢測,該些基因組合都具有良好的檢測/評估能力。
因此本發明篩選出六個與環境荷爾蒙所誘發乳癌之易感性基因,甚至只要兩個基因組合,皆可用於篩檢病患是否具有易受雙酚A之影響,而有較高的風險罹患乳癌,其具有良好穩定度及正確性。是以,本發明找出六個與雙酚A與乳癌相關聯之易感性基因,可提醒/預防該些基因表現量高的患者避免暴露於雙酚A的環境下,而導致乳癌的發生。
Claims (10)
- 一種乳癌罹患風險之評估方法,其步驟包含:(a)取得一個體之樣本;(b)量測該樣本的至少兩個基因標記之表現量,其中該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組;及(c)將該樣本的該至少兩個基因標記之表現量與一控制組的相對應的至少兩個基因標記之表現量相比,若該樣本的該至少兩個基因標記之表現量為該控制組的相對應的該至少兩個基因標記之表現量為兩倍以上及/或0.5倍以下時,藉此判定該個體具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險,其中用於該基因標記之表現量相比為兩倍以上的基因標記為FN1,用於該基因標記之表現量相比為0.5倍以下的基因標記為TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中該樣本為一血液樣本。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP及TGFBR3基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中該至少兩個基因標記為 FN1及TXNIP基因。
- 一種乳癌罹患風險之評估方法,其步驟包含:(a)取得一個體之樣本;(b)量測該樣本的至少兩個基因標記之表現量,其中該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組;(c)以該個體的一管家基因(housekeeping gene)的表現量對該至少兩個基因標記之表現量標準化;及(d)將該標準化後的該樣本的該至少兩個基因標記之表現量與一控制組的相對應的至少兩個基因標記之表現量相比,若該標準化後的該樣本的該至少兩個基因標記之表現量為該控制組的相對應的該至少兩個基因標記之表現量為兩倍以上及/或0.5倍以下時,藉此判定該個體具有受雙酚A影響而導致罹患乳癌的風險,其中用於該基因標記之該表現量相比為兩倍以上的基因標記為FN1,用於該基因標記之表現量相比為0.5倍以下的基因標記為TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36。
- 如申請專利範圍第6項所述之評估方法,其中該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP、TGFBR3及ADCK3基因。
- 如申請專利範圍第6項所述之評估方法,其中該至少兩個基因標記為FN1、TXNIP及TGFBR3基因。
- 如申請專利範圍第6項所述之評估方法,其中該至少兩個基因標記為 FN1及TXNIP基因。
- 一種預測受雙酚A影響而導致罹患乳癌之基因標記群組,其中該基因標記群組包含至少兩個基因標記,該至少兩個基因標記係選自於由FN1、TXNIP、TGFBR3、ADCK3、FHL1及CD36基因所組成的群組。
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