TWI493040B

TWI493040B - 大腸直腸癌之基因標記、使用其檢測大腸直腸癌之方法及含其之套組

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Publication number: TWI493040B
Application number: TW102104274A
Authority: TW
Inventors: Chi Ming Chu
Original assignee: Nat Defense Medical Ct
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2013-02-04
Publication date: 2015-07-21
Also published as: TW201432051A

Description

大腸直腸癌之基因標記、使用其檢測大腸直腸癌之方法及含其之套組

本發明關於一種大腸直腸癌相關的基因標記，特別是關於一種週邊血液內的基因標記，而可用於篩檢大腸直腸癌、或評估大腸直腸癌預後狀況。

大腸直腸癌(colorectal cancer,CRC)在全世界常見的癌症，在美國，預估其於2009年新增146,970個大腸直腸癌患者，且有49,920人死於該癌症。CRC的篩檢可降低癌症發生率，且可提供較好的預後及存活率的評估。傳統的CRC篩檢方式包含糞便潛血試驗、乙狀結腸鏡、鋇劑灌腸檢查或大腸鏡等等，雖然以上篩檢方式普遍常用，但皆有其侷限性，如高變性靈敏度(由37%至80%)或和飲食的交互作用導致篩檢結果的誤差，此外，對於上述一些高侵入性的檢驗，也造成篩檢意願降低，而使大腸直腸癌早期診斷率偏低。

腫瘤的惡性細胞由原發性腫瘤散佈或移轉是癌症惡化關鍵原因。在許多臨床案例中，甚至在原發癌症被診斷前，癌症細胞就已經轉移，而這些在人體循環系統內的癌症細胞可能是癌症轉移可最早被檢測到的形式。因此，已有報導利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase-chain reaction,PCR)為基礎的分析，可檢測CRC患者週邊血液樣品中角質蛋白、腫瘤胚胎抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、表皮生長因子受器(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的mRNA作為分子標記，進行早期的腫瘤分子篩檢。然而，這些習知的基因亦有低靈敏性及低特異性的缺點，因此無法適當地檢測大腸直腸癌(Sergeant G,Penninckx F,Topal B：Quantitative RT-PCR detection of colorectal tumor cells in peripheral blood--a systematic review.J Surg Res 2008,150：144-152)，而最近發現的分子標記ProtM，亦存在敏感度不佳的問題(Schuster R,Max N,Mann B,Heufelder K,Thilo F, Grone J,Rokos F,Buhr HJ,Thiel E,Keilholz U：Quantitative real-time RT-PCR for detection of disseminated tumor cells in peripheral blood of patients with colorectal cancer using different mRNA markers.Int J Cancer 2004,108：219-227)。

因此，目前仍有必要尋找更具有高靈敏性及高特異性的大腸直腸癌基因標記。

本發明在於提供一種用於檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之基因標記，該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1。

根據本發明之基因標記，其係於大腸直腸癌細胞中有上升表現量。於一較佳實施例中，該大腸直腸癌細胞係存在於個體的週邊血液內。

本發明另一方面係提供一種用於檢測個體是否患大腸直腸癌之方法，其步驟包含：(a)由一個體取得一包含核酸之檢測樣本；(b)量測該樣本內的基因標記表現量，其中該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1；(c)以該個體的管家基因(housekeeping gene)表現量對該基因標記表現量標準化；及(d)將該標準化後的基因標記表現量與一健康控制組的基因標記表現量相比，若該基因標記表現量增加，代表該個體具大腸直腸癌風險。

本發明又一方係提供一種監測及/評估一大腸直腸癌患者對於治療的預後反應之方法，其步驟包含：(a)由該患者接受治療前，自該患者取得一包含核酸之治療前樣本；(b)於該患者接受治療後，自該患者取得一包含核酸之治療後樣本；(c)量測該治療前樣本和治療後樣本的基因標記表現量，其中該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1；(d)將該治療前樣本與治療後樣本的基因標記表現量相比，若該治療後基因標記表現量增加，代表該個體預後不良。

根據本發明之方法，其中該檢測樣本為體液，而一較佳實施例中，該體液為週邊血液。又根據本發明之方法，其中步驟(b)之基因表現量係mRNA或蛋白質。

本發明再一方面係提供一種檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之套組，該套組包含：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因之專一性引子對。

本發明之又一方面係提供一種檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之套組，該套組包含：抗CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因蛋白質之專一性抗體。

定義

術語「一」或「一種」當與「包含」連用於申請專利範圍或說明書中，可能代表有一個，但也符合「一或多個」或「至少一個」。

術語「過度表現」或「上升表現量」意指在細胞或生物體中的基因表現量高於正常細胞或生物體之表現量。

術語「治療」意指利用任何手段(如開刀、化學治療或藥物控制)來降低大腸直腸癌病人經歷之症狀之頻率、程度、嚴重性及/或持續時間。

術語「緩和」、「減輕」或「改善」意指減少一或多個疾病、失調或病狀之症狀。

術語「基因標記(gene marker)」意指一種在個體內的DNA因特定疾病而發生表現量的改變(上升或下降)，而可作為用於指引特定疾病存在與否或異常風險之增加，「基因標記」或「分子標記(molecule marker)」等用語可交替地使用。

術語「預後」係指預測疾病可能的發展及結果，特別是復原的可能性。

術語「復發」係指個體經治療後，疾病又回到治療前狀態者，如癌症細胞的重新出現。

本文中，「個體」係指一哺乳類，其包含但不限於人類、靈長類、鼠類、貓類、狗類、牛類等。

本文中術語「樣本」係指一種生物樣本，例如由個體中所分離出之組織或液體(包含但不限於血漿、血清、腦脊液、淋巴液、眼淚、唾液或組織切片)或在體外細胞培養組成物。

本發明之大腸直腸癌基因標記

本發明提供一種用於檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之基因標記，該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1(以下簡稱為本發明之7基因標記)。

於一較佳實施例中，本發明係利用週邊血液樣本，使用即時聚合酶鏈鎖反應技術檢測大腸直腸癌的基因標記。詳言之，將收集的血液樣本抽取出總RNA後，進行反轉錄產生cDNA，並利用預先選定之專一性引子對進行即時聚合酶鏈鎖反應，比較正常個體與大腸直腸癌患者之有差異的基因表現，從中選出基因標記，並利用邏輯迴歸統計方式評估基因標記預測模型，並由公開的網路資訊中獲得12組微陣列數據集，分別為GSE 4107、4183、8671、9438、10961、13067、13294、13471、14333、15960、17538及18105，包含了519例腺癌及88例正常黏膜控制組，將此12個公開的微陣列資料作為外部驗證，用以檢測候選基因作為癌症分子標記之可行性。根據EP201987A2揭示的5基因模型與先前技術已公開的Marshall等人的7基因模型(Marshall KW,et al.：A blood-based biomarker panel for stratifying current risk for colorectal cancer.Int J Cancer 2010,126：1177-1186)及Han等人的5基因模型(Han M,et al.：Novel blood-basea,five-gene biomarker set for the detection of colorectal cancer.Clin Cancer Res 2008,14：455-460)，使用匯集的12個公開微陣列數據集為外部驗證，執行多變數邏輯迴歸分析，得到具有更佳的準確性、敏感性及特異性的本發明之7基因標記：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1，而可用於作為CRC之篩檢、於治療前或進行後，預測特定療程的反應，或用以評估病患後續的療程方法。

邏輯迴歸係藉由擬合資料於邏輯曲線，用於預測一事件的發生機率。邏輯迴歸模型得出發生的反應作為自變量指數函數之機率。該模型以機率(P)表示，其範圍由0到1。邏輯迴歸以邏輯方程式表示：

輸入值為Y而輸出值為f(Y)，即是P。輸出值限於0到1之間。變數Y代表曝露於某些風險因子，而f(Y)代表由該些風險因子所得出之特定結果的機率。該變數Y是模型中所使用的所有風險因子的總體衡量，也被稱為對數優劣比(logit)。

變數Y通常定義為Y=β₀+β₁x₁+β₂x₂+...+β_kx_k，β₀即稱為截距(intercept)，β₁、β₂、β₃等分別稱為x₁、x₂、x₃之迴歸係數(regression coefficients)。當所有風險因子為0時(即在某個不具任何風險因子之個體的z值)，Y值即等於截距。各個迴歸係數描述了該風險因子之貢獻度大小。一個正迴歸係數表示該風險因子增加了結果的機率，而一個負迴歸係數表示該風險因子降低了結果的機率；一個較大的迴歸係數表示該風險因子大幅影響了結果的機率；而一個接近0的迴歸係數表示該風險因子只會微幅影響結果的機率。

因此，基因標記表現量的統計分析可用於預測個體具有大腸直腸癌的風險。而勝算比(Odds Ratio，OR)可估算大腸直腸癌的相對風險。勝算比(OR)是一種效應值的量測，說明關聯性的強度或兩個二元資料值之間的非獨立性(non-independence)，用以作為一種描述性統計以及在邏輯迴歸中扮演一重要角色。勝算比(OR)之定義為，一個事件發生在一群體中相對於發生於另一群體中的成功率。統計學上，成功率是發生某一事件的機率除以不發生該事件的機率。勝算比是一種對於兩群體，比較某一特定事件發生機率是否相同的方法。勝算比等於1時，顯示該事件發生於二個群體中的傾向相同。勝算比大於1時，顯示該事件較傾向於發生於第一群體中。勝算比小於1時，顯示該事件較不傾向於發生於第一群體中。若某事件在各個群體中發生之機率分別為p₁(第一群體)及p₂(第二群體)，則其勝算比係為：

根據本發明之7基因標記，其中CPEB4結合細胞質多聚腺苷酸化蛋白(cytoplasmic polyadenylation element，CPE)的標靶mRNAs並於成長發育時控制細胞質的多聚腺苷酸化及活化轉譯(Huang YS,Kan MC,Lin CL,Richter JD：CPEB3 and CPEB4 in neurons：analysis of RNA-binding specificity and translational control of AMPA receptor GluR2 mRNA.EMBO J 2006,25：4865-4876)；EIF2S3是真核細胞轉錄起始因子2(eukaryotic translation initiation factor 2,EIF2)的最大次單元，可能透過N-myc途徑下游調節基因1而間接參與抑制前列腺癌轉移(Tu LC,Yan X,Hood L,Lin B：Proteomics analysis of the interactome of N-myc downstream regulated gene 1 and its interactions with the androgen response program in prostate cancer cells.Mol Cell Proteomics 2007,6：575-588)。本發明第一個發現此7個基因於大腸直腸癌中的相關性，並合併用於作為大腸直腸癌的基因標記。該等基因標記具有準確性為96.8%、敏感性為99.4%及96.6%的特異性，可用於作為CRC之篩檢、於治療前或進行後，預測特定療程的反應，或用以評估病患後續的療程方法。

本發明之監測及/評估一大腸直腸癌之方法

根據本發明之方法，其中該檢測樣本為體液，而一較佳實施例中，該體液為週邊血液。

前述CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因標記的表現量可為mRNA表現量，本發明的基因標記在癌症檢體樣本與非癌症的檢體樣本中(或同一病患在治療前後所取得的檢體樣本)mRNA表現量的改變，任何熟習此技藝者可輕易地使用任何習知方法，包括但不限於北方墨點法(northern blotting)、反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)或即時聚合酶連鎖反應(real time quantitative PCR，Q-RT-PCR)等習知相關mRNA分析技術測定而得。

此外，前述CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因標記的表現量亦可為蛋白質表現量，而本發明之CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因標記在癌症檢體樣本與非癌症的檢體樣本中(或同一病患在治療前後所取得的檢體樣本)蛋白質表現的改變，任何熟習此技藝者，可輕易的使用任何習知方法，包括但不限於酵素連結免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫螢光染色(immunofluorescence)、免疫組織化學法(immunohistochemistry)、酵素免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)或西方墨點法(Western blotting)等習知相關蛋白質分析技術測定而得。

熟習此技藝者，可經由鑑定CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因標記的表現是否被促進或抑制，進而篩選出治療大腸直腸癌症的藥物。舉例而言，可利用CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因標記的啟動子區域連接一段綠螢光蛋白基因，再由細胞中觀察所測試之藥物處理後的螢光強度。

本發明之檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之套組

本文中術語「引子」係指用於PCR反應中，作為特定基因一端複製起始點中之DNA的一股，而該特定基因另一端複製起始點之DNA的另一股合稱為引子對，其可夾出所欲擴增之特定基因。

利用本發明之套組內的引子對，可偵測前述CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因標記的表現量，而可使用反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)或即時聚合酶連鎖反應(real time quantitative PCR，Q-RT-PCR)等習知相關mRNA分析技術測定，得到個體是否罹患大腸直腸癌及/或評估其預後是否良好。

該專一性抗體可進一步帶有化學探針、螢光蛋白、放射性物質或酵素等，使該套組可直接進一步進行ELISA、免疫螢光染色、免疫組織化學法、酵素免疫分析法或放射免疫分析，或得基因標記之表現量。

實施例

下文中，將進一步以詳細說明與實施例描述本發明。然而，應理解這些實施例僅用於幫助可更加好理解本發明，而非用於限制本發明之範圍。

實施例1

將EP2019871A2揭示的5基因模型(模型1)與先前技術所揭示的7基因模型(模型2，詳見Marshall KW,et al.：A blood-based biomarker panel for stratifying current risk for colorectal cancer.Int J Cancer 2010,126：1177-1186，以下簡稱Marshall等之7基因模型)及5基因模型(模型3，詳見Han M,et al.：Novel blood-based,five-gene biomarker set for the detection of colorectal cancer.Clin Cancer Res 2008,14：455-460，以下簡稱Han等之5基因模型)，使用匯集的12個公開微陣列數據集為外部驗證，執行多變數邏輯迴歸分析。結果如下表1所示。

模型1：EP2019871A2之5個選擇性基因；模型2：Marshall等人之7個選擇性基因；模型3：Han等人之5個選擇性基因；模型4：由逐步排除法於模型1、2及3中所選出7個選擇性基因；B：邏輯迴歸係數β；S.E.：B之標準差；p：統計顯著性之p值；H-L：哈氏-蘭氏檢定之p值；R²：擬判準R平方(Nagelkerke R Square)；AUC：ROC曲線下面積。

由上表1中，可見模型2的Marshall等之7基因模型H-L檢定結果為顯著(p值為0.044)，代表了模型資料不擬合，適合度不良。而適合度良好者則為模型1、3及4。該模型4係由模型1、2及3中，利用配對比較法(pairwise)選擇的結果而得到的7基因模型，而該模型4相較於模型1、2及3，展現了最佳的邏輯迴歸分析結果(H-L p=1.000，R²=0.951，AUC=0.999，準確性=0.968，特異性=0.966且敏感性=0.994)，符合優異的診斷檢測標準。

綜上實施例之結果，由於任何種類的癌症之癌症細胞皆有可能由腫瘤組織中散佈，穿透並侵襲血管，而於週邊血液中在人體循環，因此，這些循環的癌症細胞可被用來預測癌症病人臨床的結果(Cristofanilli M,Budd GT,Ellis MJ,Stopeck A,Matera J,Miller MC,Reuben JM,Doyle GV,Allard WJ,Terstappen LW,Hayes DF：Circulating tumor cells,disease progression,and survival in metastatic breast cancer.N Engl J Med 2004,351：781-791)，其在健康控制組與CRC病患中的表現量有差異，進一步將EP2019871A2之5基因模型與先前技術中的Marshall等之7基因模型及Han等之5基因模型共17個基因，利用匯集的12個公開微陣列數據集作為外部驗證，執行多變數邏輯迴歸分析，找到了一組7基因模型(CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1)，該組7基因模型具有極佳的準確性、敏感性及特異性，因此也可用於大腸直腸癌的早期偵測、診斷，或可用於治療前或進行後，預測特定療程的反應，或用以評估病患後續的療程方法。

本發明7基因模型又可以依照成本，調整檢測基因數量，其檢測順序為(1)僅檢測MGC20553；(2)檢測(1)外，增加EIF2S3；(3)檢測(2)外，增加TNFAIP6；(4)檢測(3)外，增加CPEB4；(5)檢測(4)外，增加ANXA3；(6)檢測(5)外，增加MS4A1；或(7)檢測(6)外，增加IL2RB。檢測準確率與計算參數如下表2所示。

實施例2

進一步地，根據由公開的網路資訊中獲得12組微陣列數據集，再分析得5基因組CA7、SPIB、GUCA2B、IL6R及SPP1配合本發明7基因模型MGC20553、EIF2S3、TNFAIP6、CPEB4、ANXA3、MS4A1及IL2RB，可以依照成本調整檢測基因數量，其檢測順序為(1)僅檢測CA7、(2)檢測(1)外，增加IL6R；(3)檢測(2)外，增加IL2RB；(4)檢測(3)外，增加TNFAIP6；或(5)檢測(4)外，增加CPEB4。其準確率與計算參數如下表3所示。

雖然本文中揭示了實施例，但應理解其包含其他變化的可能性，這些變化並不視為背離本發明之實施例的精神及範圍，且對技藝人士而言，所有這些明顯的修飾仍視為下方申請專利範圍之範疇內。

Claims

一種用於檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之基因標記，該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1。
如請求項1之基因標記，其中該大腸直腸癌細胞係存在於個體的週邊血液內。
一種用於檢測個體是否患大腸直腸癌之方法，其步驟包含：(a)由一個體取得一包含核酸之檢測樣本；(b)量測該樣本內的基因標記表現量，其中該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1；(c)以該個體的管家基因(housekeeping gene)表現量對該基因標記表現量標準化；及(d)將該標準化後的基因標記表現量與一健康控制組的基因標記表現量相比，若該基因標記表現量增加，代表該個體具大腸直腸癌風險。
一種監測及/評估一大腸直腸癌患者對於治療的預後反應之方法，其步驟包含：(a)由該患者接受治療前，自該患者取得一包含核酸之治療前樣本；(b)於該患者接受治療後，自該患者取得一包含核酸之治療後樣本；(c)量測該治療前樣本和治療後樣本的基因標記表現量，其中該基因標記係包含下列基因：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1； (d)將該治療前樣本與治療後樣本的基因標記表現量相比，若該治療後基因標記表現量增加，代表該個體預後不良。
如請求項3或4之方法，其中該樣本為體液。
如請求項5之方法，其中該體液為週邊血液。
如請求項3或4之方法，其中量測該基因表現量可依需求，使檢測順序為：(1)檢測MGC20553及EIF2S3；(2)檢測(1)外，增加TNFAIP6；(3)檢測(2)外，增加CPEB4；(4)檢測(3)外，增加ANXA3；(5)檢測(4)外，增加MS4A1；或(6)檢測(5)外，增加IL2RB。
如請求項3或4之方法，其中該基因表現量係mRNA或蛋白質。
如請求項8之方法，其中該mRNA係利用北方墨點法、反轉錄聚合酶鏈鎖反應、即時聚合酶鏈鎖反應量測。
如請求項8之方法，其中該蛋白質係利用免疫螢光染色、酵素連結免疫吸附法、酵素免疫分析法、放射免疫分析法或西方墨點法量測。
一種檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之套組，該套組包含：CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因之專一性引子對。
一種檢測大腸直腸癌及/或評估其預後之套組，該套組包含：抗CPEB4、EIF2S3、ANXA3、TNFAIP6、IL2RB、MGC20553及MS4A1基因蛋白質之專一性抗體。