CN111440871A - 基因标记物在肺癌预后判断中的应用 - Google Patents

基因标记物在肺癌预后判断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及选自用于检测如下基因的表达量的检测剂在制备用于肺癌的复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用：CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3。依据基因表达量的变化，用于准确评估肺癌患者预后，避免了复杂繁琐的统计学分析。本发明基因群检测结果可以为临床医生和患者提供准确的疗效评估，同时还能检测出对常规治疗方案不敏感的患者，帮助医生选择新的有效临床治疗方案，从而真正实现“个性化治疗”。

Description

基因标记物在肺癌预后判断中的应用
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及一种基因标记物在肺癌预后判断中的应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。全球范围内，肺癌的发病率、死亡率都极高且呈上升趋势。2019年全球统计数据显示，男性肺癌发病率及死亡率均占恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。另外，如环境污染、被动吸烟和职业危害等也是引起肺癌的重要因素。
临床将肺癌分为两大类型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。这种区分是相当重要的，因为对这两种类型的肺癌的治疗方案是截然不同的。小细胞肺癌约占肺癌总发生率的15％，患者多为男性，与吸烟密切相关，是肺癌中恶性度最高的一种，小细胞肺癌增值快、早期广泛转移，手术切除疗效差，对于初始的化疗或放疗非常敏感。小细胞肺癌划分为局限期和广泛期，局限期强调开始化疗后尽早联合治疗；广泛期多在化疗结束后部分患者可以进行胸部放疗。非小细胞肺癌是相对于小细胞肺癌而言的，约占肺癌总发生率的85％，实际是一大类疾病的总称，主要分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌。其中鳞状细胞癌最为常见，约占50％，患者大多数为中老年男性，多有吸烟史。肿瘤生长速度比较缓慢、转移晚、手术机会多。腺癌女性相对多见，一般生长较慢，通过血液转移发生早，易累及胸膜引起胸腔积液。大细胞癌多发生在周边肺实质，常见大片出血性坏死。癌细胞恶性较高，但转移较小细胞癌晚，手术切除机会大。
而肿瘤免疫治疗现已发展的如火如荼，其中免疫检查点抑制剂(抗PD-1/PD-L1抑制剂)更是近年肿瘤治疗领域的明星药物，已进入非小细胞肺癌一线治疗。生物标志物(biomarker)作为最直接快速有效的检测手段，为了让患者能受到准确有效的治疗，biomarker就担起了筛选患者、分类患者的重担，准确找出有药物响应的患者，让他们尽早接受最好的治疗，所以如何精准筛选受益人成为临床医生急需解决的问题。
PD-L1,MSI(微卫星不稳定，microsatellite instability)，以及TMB(肿瘤突变负荷，tumor mutational burden)是获得FDA认可或者NCCN指南推荐的免疫治疗生物标志物(biomarker)，但这三个标志物各有优缺点。PD-L1表达是通过使用免疫组化的方法，使用特异的抗体检测肿瘤组织中肿瘤细胞的PD-L1表达情况。一般而言PD-L1表达量越高，患者则更有可能从免疫治疗中获益。但是，多个临床试验结果显示PD-L1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分PD-L1阴性患者依然能从免疫治疗获益，且持续缓解时间并不逊于PD-L1阳性患者；MSI是由于在遗传物质复制过程中，各种错误的累积所致。MSI最大的问题是应用很少，而且对样本要求很高，临床推广有一定局限性。TMB是肿瘤组织每兆碱基中突变的数据，原理和MSI非常相似。只是TMB检测昂贵，而且不同公司或实验室检验对于TMB计算，难以建立共识，年龄也是一个很大的影响因素。最重要的一点就是现有研究(纳入11348例实体瘤)发现，PD-L1阳性、TMB高表达以及MSI-H三者重叠率仅为0.6％，提示任一biomarker单用都会遗漏很多潜在免疫治疗获益人群。所以需要进一步探索免疫治疗biomarker。
综上所述，用于肺癌治疗方案选择和预后评估分子筛查用基因群以及相关的检测试剂盒仍是本领域技术人员研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肺癌预后预测的评估基因群，所述基因群包括以下基因：CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3、CEACAM3。
具体的，本发明涉及选自用于检测如下基因的表达量的检测剂在制备用于肺癌的复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用：
CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3。
发明的有益效果：
本发明通过对多个基因表达方式的鉴定，方法简便、准确性强，且成本较低，易于被广大患者接收。本发明公开的基因群，对7个基因中的三个或三个以上进行检测，依据基因表达量的变化，用于准确评估肺癌患者预后，避免了复杂繁琐的统计学分析。本发明基因群检测结果可以为临床医生和患者提供准确的疗效评估，同时还能检测出对常规治疗方案不敏感的患者，帮助医生选择新的有效临床治疗方案，从而真正实现“个性化治疗”。
本发明提供的用于肺癌预后预测的评估基因群，相比根据在肺癌肿瘤中发现具有高表达量的基因集合综合而选取的某些基因组合来关联肺癌患者的预后，本发明提供的评估基因群能更可靠的应用到临床实践中，特别是，本发明提供的评估基因群，对于中国肺癌患者的肺癌预后预测的评估准确性较高，能高度可靠地应用于中国肺癌患者的肺癌预后预测中；另外，本发明提供的评估基因群含有多个基因，所以相比以单个基因的表达量关联预后的方法，大大减小了收集的样本对于生存分析结果的稳健性的限制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中涉及的确定方法的步骤流程图；
图2为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图3为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图4为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图5为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图6为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图7为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图8为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因的生存分析结果示意图；
图9为本发明一个实施例中涉及的来自临床病例验证的评估基因群的生存分析结果示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及选自用于检测如下基因的表达量的检测剂在制备用于肺癌的复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用：
CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3。
检测剂可用于检测上述基因中的至少4个、5个、6个或7个。
本发明中，术语“预后”具有本领域技术人员知悉的含义。在本发明的一个实施方案中，预后是指生存概率(PFS)。其中，如果对象是一个群体(2个或2个以上患者)，预后可以是指中位生存概率或平均生存概率。
如本文所用的，“肺组织”和“肺癌”分别指肺本身的组织或癌症，以及邻近肺和/或在肺下层内的组织和支撑结构如胸膜、肋间肌、肋骨和呼吸系统的其它元件。呼吸系统本身在本上下文中被视为代表鼻腔、鼻窦、咽、喉、气管、支气管、肺、肺叶、肺泡、肺泡管、肺泡囊、肺泡毛细血管、细支气管、呼吸道细支气管、内脏胸膜、胸腔胸膜、胸膜腔、横隔膜、会厌、类腺、扁桃腺、口和舌等。组织或癌症可以是来自哺乳动物并且是优选地来自人，虽然猴、猿、猫、狗、牛、马和兔也在本发明的范围内。
CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3可作为标志物以应用于肺癌诊断与治疗，特别是预后评估。对它们进行检测的目的是确定这些基因的表达量，可以从和mRNA或蛋白水平进行。
本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。如本领域技术人员显而易见的，mRNA的检测不应当解释为限于上述基因直接转录得到的特定mRNA序列，例如，作为替代性的mRNA变体、短链或前-mRNA处理的结果。变体的核苷酸序列与对应的标志物序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性；短链则只要能代表全长mRNA本身的特异性序列都可胜任。显然地，mRNA水平的检测也可通过检测cDNA以进行。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白或mRNA可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，mRNA、蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
在一些实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
罹患所述肺癌的受试者可以是哺乳动物。优选地，受试者是人。
在一些实施方式中，罹患所述肺癌的受试者为华裔患者。
华裔患者通常指其遗传学背景指示其具有至少50％的华裔血统，或者至少75％的华裔血统，这样的患者可以于任何地方出生，其不限于任何国籍，但优选为中国。
在一些实施方式中，所述肺癌的临床分期为III期或IV期。
在一些实施方式中，所述复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗针对免疫疗法进行。
在一些实施方式中，所述免疫疗法为免疫检查点抑制剂疗法。
如本文所用，术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。
本发明所述免疫检查点包括但不限于程序性死亡受体1(PD1)、PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)；也包括一些新发现的免疫检查点例如淋巴细胞活化基因3(LAG3)、CD160、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)等等。
优选的免疫检查点抑制剂为PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
所述PD1抑制剂进一步可以选择为Nivolumab(OPDIVO；BMS-936558)、Pembrolizumab(MK-3475)、Jembrolizumab、lambrolizumab、Pidilizumab(CT-011)特瑞普利单抗(JS001)以及Ipilimumab中的一种或多种。
所述PD-L1抑制剂进一步可以选择为Atezolizumab(MPDL3280A)、JS003、Durvalumab、Avelumab、BMS-936559、MEDI4736以及MSB0010718C中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述检测于转录水平或翻译水平进行检测。
在一些实施方式中，所述检测剂为用于执行以下任一种方法的试剂：
聚合酶链反应、核酸杂交法、免疫学检测法和生物质谱法。
聚合酶链反应可以进一步选自荧光定量PCR(可以结合TaqMan探针进行检测)，数字PCR等；
核酸杂交法可以进一步选自原位杂交、转录组芯片等；
免疫学检测法可以进一步选自WB、IP、IHC、抗体芯片等。
在一些实施方式中，所述检测剂为用于检测所述基因表达的蛋白的特异性抗体。
“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体及抗体片段，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。
在一些实施方式中，所述检测剂为用于检测所述基因表达的mRNA的特异性探针和/或引物。
如本文中所使用的，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。
本领域技术人员公知，引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性探针和/或引物”是指探针或引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。此类引物或探针的设计是本领域技术人员公知的，参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishingAssociates(1992)。
通常，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有大体上的同一性，从而能够特异性扩增目的基因。例如，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。
在一些实施方式中，所述检测剂还连接有可检测的标记物。
在一些实施方式中，所述标记物选自放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质和酶。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，发光物质可以是荧光蛋白和荧光素酶。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有用于指示所述基因参考表达量的参考标准品。
参考标准品可以为健康人的生物样品，也可以是已知的预后较佳或预后较差的患者的生物样品。
参考标准品还可以理解为进一步包括蛋白质测量标准化所需的样本和/或试剂。例如，蛋白或RNA测量可通过一种或多种“持家”蛋白或mRNA作为标准化的基准，这对于本领域技术人员是熟悉的。
本发明还涉及一种肺癌的复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的方法，所述方法包括：
a)评价多种基因的表达，包括确定来自从受试者获得的生物样品的CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3的基因的表达水平；b)依据基因表达量，对受试者进行评估。
CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3中一种或多种表达量的升高提示肺癌的复发风险高。
升高通常是显著性的，确定受试者和健康群体对照组/受试者的初始状态(baseline)相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
其中，生物样品可以是从受试者获得的任何样品，例如，组织、细胞、体液。优选地，生物样品是组织、血、血浆、血清、全血、尿、唾液、生殖器分泌物、脑脊液、汗液、排泄物或支气管肺泡灌洗液。更优选地，所述组织是肺组织，进一步可以是肺癌组织。
其中，评估的步骤可以在计算机系统上进行。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本实施例中，我们收集了中国非小细胞肺癌(NSCLC)患者的37例FFPE肿瘤样本。
这些样本主要集中在临床分期III期和IV期的样本。收集其疾病的总生存期，是否死亡和其他临床信息如性别，年龄，病理类型，PD-L1等信息。
采用本发明的用于肺癌预后预测的试剂盒提取这37个肺癌患者相应的肺癌FFPE肿瘤样本中的RNA，对于这些样本对应的RNA进行转录组测序，再对测序结果进行处理以得到肺癌预后预测的评估基因群。
使用上述试剂盒提取RNA的具体过程如下：
1.用干净的手术刀将FFPE样本刮入到1.5ml的离心管中，关盖后微离心收集所有蜡屑至管底；
2.向离心管中加入320μl Deparaffinization Solution，涡旋混匀10s，短暂离心；
3.56℃孵育3min，然后冷却至室温；
4.向离心管中加入240μl Buffer PKD，涡旋混匀，10000rpm离心1min；向离心管中加入10μl proteinase K，注意要加入下层澄清相；使用移液器吹打混匀；
5.56℃孵育15min，然后转到80℃孵育15min；完毕后，将金属浴调节到37℃(为了更有效地将RNA从FFPE样本中释放，提高产量，可以增加样本孵育消化的时间，由15min提高到过夜)；
6.缓慢转移下层澄清相到一个新的1.5ml离心管中；
7.在冰上静置3min，然后13500rpm离心15min；
8.缓慢转移上清到一个新的1.5ml离心管中，注意不要吸入沉淀；
9.向离心管中加入25μl DNase Booster Buffer和15μl DNase I stocksolution，缓慢颠倒混匀后，短暂离心收集液体至管底；
10.37℃孵育20分钟；
11.向离心管内加入500μl buffer RBC，充分混匀后短暂离心；用移液枪确定管内溶液体积，平均分一半到另一个新的1.5ml离心管中；
12.向两管中各加入875μl无水乙醇，用移液器吹打混匀；
13.转移两管中所有的裂解产物至RNeasy MinElute离心柱中，每次转移不超过700μl；10000rpm离心15s，倒掉废液；
14.小心打开离心柱管盖，加入500μl Buffer RPE，10000rpm离心15s，倒掉废液；
15.小心打开离心柱管盖，再次加入500μl Buffer RPE，10000rpm离心2min，将离心柱放入一个新的2ml收集管，丢弃旧的收集管；
16.最高转速(14000rpm)离心5min，丢弃收集管；
17.把RNeasy MinElute离心柱转移至新的1.5ml离心管中，使用100μl移液枪向膜中心加入22μl RNase-free water，盖上管盖，室温孵育4min；最高转速(14000rpm)离心1min，转移洗脱溶液至离心柱膜中心，室温孵育4min，并最高转速(14000rpm)离心1min，丢弃离心柱；(在洗脱RNA前，提前预热洗脱剂，把温度从37℃提高到50℃，结合时间从2min提高到4min，收集更多的RNA产物)
样本质检：
取1μl RNA溶液用Qubit荧光定量仪检测浓度，记录检测结果。
提示：如测量值过高，Qubit仪器显示“out of range"，重新取lμl RNA溶液稀释5倍再次检测；如仍过高，Qubit仪器显示“out of range"，则再取lμlRNA溶液稀释10倍再次检测，以此类推，直到Qubit仪器显示读数。
对每个肺癌临床样本通过采用上述试剂盒并通过上述过程提取得到的相应RNA进行转录组测序，具体过程如下：
每例肺癌临床RNA样本用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入FragmentationBuffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina NextSeq 500进行测序。
之后，对得到的测序结果进行处理。在本实施例的测序结果处理中，对测序结果的原始数据进行去除接头和低质量的碱基(仅保留质量q)l5的碱基)。降低测序仪测序错误的影响。
对原始数据比对到基因组上，采用软件hisat2(hisat2[options]*-x<hisat2-idx>{-1<m1>-2<m2>|-U<r>}[-S<hit>]，提供index的位置，PE数据或者是SE数据存放位置)。
对于对比结果，采用IGV(Integrative Genomics Viewer)游览器对bam文件进行可视化游览。
采用ASprofile软件对Cufflinks(Trapnell et al.)预测出的基因模型对每个肺癌样品的可变剪切事件分别进行分类和表达量统计。
采用HTseq软件对肺癌样本进行基因表达水平分析，分别统计不同表达水平下基因的数量以及单个基因的表达水平，FPKM数值0.1或者1作为判断基因是否表达的阈值。
采用R语言进行Pearson相关系数的计算，肺癌样本的相关性反应了肺癌样本的相似程度，肺癌样本的基因表达水平相关性是检验实验可靠性和肺癌样本选择是否合理的重要指标，相关系数越接近1，表明肺癌样本之间表达模式的相似度越高。
采用DEseq(Anders at，2010)进行差异表达基因分析，筛选阈值为pvalue＜0.005&|log2FoldChange|&gt1；对于差异基因，基因的log2FoldChange&gt0，则认为该差异基因是上调，反之，基因的log2FoldChange&It0，认为差异基因是下调。
接着，对所有预后良好样本做cox生存分析得到一个结果，为便于表述，这里该结果用low表示；并对所有的预后不好样本做cox生存分析得到一个结果，为便于表述，改结果用high表示。将结果low和high之间做生存差异显著性分析，当得到的结果为显著时，确定对应的待选评估基因群为待评估基因群(如图2-图9中所示，用low和high表示)。
从采用上述试剂盒提取处理后测序得到的测序结果中，找出37个肺癌临床样本的评估评估基因群，并根据实施例1中的预定限定方法确定出这37个肺癌癌临床样本中的预后良好样本和预后不好样本(这些样本均主要采用免疫检查点抑制剂疗法进行治疗)，然后对预后良好样本和预后不好样本做生存分析。结果见图2到图8。
图2-图8为本发明的实施例1中涉及确定为待定评估基因对应的来自肺癌临床样本验证样本群的生存分析结果示意图。
图2中，表示相应的临所有预后良好样本(low样本)和所有预后不好样本(high样本)的总体生存期的差异。图中km—plot(KM生存曲线)中黄色线段为肺癌low样本，绿色线段为肺癌high样本。图中上方的纵坐标代表生存概率(PFS)，横轴为生存时间(Time，单位为月份)。图中曲线上显示“X”代表数据为截止到最后随访的截尾数据(censored data)。图中下方的数据代表每种类型不同生存时间的存活人数，其中，肺癌high样本存活人数对应的为上栏的数，肺癌low样本存活人数对应的为下栏的数据。
根据图2-图8的结果，在备选目标基因集合中筛选得到一个由7个基因组成的基因集合作为待评估基因群，各个基因的功能以及介绍见表1。
Figure BDA0002467577140000131
Figure BDA0002467577140000141
实施例2
验证确定待定评估基因群是否为评估基因群。
为了做预后验证分析，选择与实施例1的肺癌训练样本，这里，同样地，根据与实施例1同样的预定限定方法，将37个肺癌临床训练样本确定为预后良好样本(best_response＝1)或预后不好样本(best_response＝0)。
接着，同样地，对所有预后良好样本做cox生存分析得到一个结果A，并对所有的预后不好样本做cox生存分析得到一个结果且将结果A和B之间做生存差异显著性分析，当得到的结果为显著时，确定实施例1得到的待定评估基因群为能够用于肺癌预后的评估的评估基因群。结果如图9。
图9为本发明的实施例1中涉及确定为待定评估基因群对应的来自肺癌临床样本验证样本群的生存分析结果示意图。
同样地，图9中，表示相应的数据库所有预后良好样本(best_response＝1)和所有预后不好样本(best_response＝0)的总体生存期的差异。图中km—plot(KM生存曲线)中蓝色线段为best_response＝1样本，红色线段为best_response＝0样本。图中上方的纵坐标代表生存概率(Probability of Survial)，横轴为生存时间(Time，单位为月份)。图中曲线上显示“X”代表数据为截止到最后随访的截尾数据(censored data)。
从图9中可以看出，两组数据中，每组中预后良好样本的预后生存时间，好于每组中预后不好样本的预后生存时间，且统计学上显著。由此，确定待定评估基因群为能够用于肺癌预后的评估的评估基因。
本发明所提供的用于肺癌预后预测的评估基因群，从验证结果中可以看出，由于采用的评估基因群是基于调控肺癌信号通路中包括的基因筛选得到的，这样该评估基因群中就包括了调控肺癌信号通路相关的基因，所以相比于根据在肺癌肿瘤中发现具有较高表达量的基因集合综合而选取的某些基因组合来关联肺癌患者的预后，本发明所提供的评估基因群能更可靠的应用到临床实践中，特别是，本实施例的评估基因群，对中国肺癌患者的肺癌预后预测的评估准确性高，能可靠地应用于中国肺癌患者的肺癌预后预测中；另外，由于本发明提供的评估基因群含有多个基因，所以相比以单个基因的表达量关联预后的方法，大大减少了收集样本的对生存分析结果的稳健性的限制。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.选自用于检测如下基因的表达量的检测剂在制备用于肺癌的复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用：
CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、MR1、AQP3和CEACAM3。
2.根据权利要求1所述的应用，所述肺癌为非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，罹患所述肺癌的受试者为华裔患者。
4.根据权利要求1或2所述的应用，所述肺癌的临床分期为III期或IV期。
5.根据权利要求1所述的应用，所述复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗针对免疫疗法进行。
6.根据权利要求5所述的应用，所述免疫疗法为免疫检查点抑制剂疗法。
7.根据权利要求6所述的应用，所述免疫检查点抑制剂为PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
8.根据权利要求1所述的应用，所述检测于转录水平或翻译水平进行检测。
9.根据权利要求8所述的应用，所述检测剂为用于执行以下任一种方法的试剂：
聚合酶链反应、核酸杂交法、免疫学检测法和生物质谱法。
10.根据权利要求8所述的应用，所述检测剂为用于检测所述基因表达的蛋白的特异性抗体。
11.根据权利要求8所述的应用，所述检测剂为用于检测所述基因表达的mRNA的探针和/或引物。
12.根据权利要求10或11所述的应用，所述检测剂还连接有可检测的标记物。
13.根据权利要求12所述的应用，所述标记物选自放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质和酶。
14.根据权利要求1、2、5、6、7、8、9、11、13任一项所述的应用，所述试剂盒中还含有用于指示所述基因参考表达量的参考标准品。
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