CN112011604B - 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用 - Google Patents

一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112011604B
CN112011604B CN202010966791.9A CN202010966791A CN112011604B CN 112011604 B CN112011604 B CN 112011604B CN 202010966791 A CN202010966791 A CN 202010966791A CN 112011604 B CN112011604 B CN 112011604B
Authority
CN
China
Prior art keywords
myasthenia gravis
prevotella
mortiferum
abundance
copri
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010966791.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112011604A (zh
Inventor
乞国艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shijiazhuang People's Hospital Shijiazhuang First Hospital Shijiazhuang Tumor Hospital Hebei Myasthenia Gravis Hospital Shijiazhuang Cardiovascular Disease Hospital
Original Assignee
Shijiazhuang People's Hospital Shijiazhuang First Hospital Shijiazhuang Tumor Hospital Hebei Myasthenia Gravis Hospital Shijiazhuang Cardiovascular Disease Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shijiazhuang People's Hospital Shijiazhuang First Hospital Shijiazhuang Tumor Hospital Hebei Myasthenia Gravis Hospital Shijiazhuang Cardiovascular Disease Hospital filed Critical Shijiazhuang People's Hospital Shijiazhuang First Hospital Shijiazhuang Tumor Hospital Hebei Myasthenia Gravis Hospital Shijiazhuang Cardiovascular Disease Hospital
Priority to CN202010966791.9A priority Critical patent/CN112011604B/zh
Publication of CN112011604A publication Critical patent/CN112011604A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112011604B publication Critical patent/CN112011604B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用，所述微生物标志物为Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的一种或几种。本发明通过测序首次发现了Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis在重症肌无力患者中丰度增加，且Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis作为检测变量具有较高的AUC值，基于此，可根据Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的丰度判断受试者是否患有重症肌无力和/或患重症肌无力的风险。

Description

一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用。
背景技术
人类远端胃肠道中定植着约100万亿微生物(The gut microbiota and obesity:from correlation to causality[J).Nature reviews.Microbioloev.2013.11(9):639-647.)，数量巨大的微生物构成了庞大的微生物生态系统。经过10亿年的共同进化，肠道微生物与人体形成了相互依赖的共生体，肠道微生物在人体生长发育、生理病理过程中均扮演着重要的角色，其可以促进宿主免疫系统的成熟和分化、抑制病原体过度生长、影响宿主细胞增殖和血管形成、调节肠内分泌功能、神经信号传导、提供能量来源、合成维生素及神经递质、代谢胆汁盐、分解或转化特定药物、消除外源性毒素等(Falony G,VandeputteD.Caenepeel C.et al.The human microbiome in health and disease:hype or hope[J].Acts clinics Belgica,2019,74(2):53-G4.)。肠道微生物群的失衡(包括组成和功能失衡)将导致全身多系统疾病，这些疾病涵盖了从局部胃肠道疾病到神经系统疾病、呼吸系统疾病、代谢疾病、肝脏疾病和心血管疾病的多系统疾病(罗晓雅，杨志宏.肠道菌群与心血管疾病相关性的研究进展[J].中国药理学通报，2018,34(8):1037-1041.)。
重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是一种自身免疫性疾病，由于突触后膜的自身抗体产生、细胞免疫依赖、补体参与导致神经肌肉接头处的神经递质传递紊乱引起肌肉收缩无力。其表现为晨轻暮重、活动或劳累后加重，造成了症状的波动性，上睑提肌及眼外肌通常最易累及，故该病首发症状通常表现为眼睑下垂和复视，20％的患者症状可仅限于眼外肌的无力且呈不对称性。此外症状可逐渐累及延髓、四肢，而肢体无力通常是对称的，近端比远端症状重，尽管极少累及呼吸肌，但症状极为严重，造成呼吸衰竭而危及生命。患者临床症状可分为局灶性的或者全身性的，发病形式可以是急性、亚急性或慢性的，病程可分为进展、缓解和复发。由于早期肌无力的症状不具有特异性，往往容易误诊为动眼神经麻痹、垂直注视麻痹或运动神经元疾病，从而引起治疗的延误(Querol L,Illa I.MyastheniaGravis and the Neuromuscular Junction.[J]Curr Opin Neurol.2013:5:459-65；Liewluck T.Immune-Mediated Rippling Muscle Disease:Another InflammatoryMyopathy in Myasthenia Gravis.[J]Arch Neurol.2010；7:896-7,897.)。
重症肌无力的发病机制十分复杂，肠道菌群在其中起着重要作用。目前缺少关于重症肌无力患者的肠道菌群与重症肌无力的相关性报道，本申请的目的在于探讨重症肌无力患者中，肠道菌群与重症肌无力的关系，以期发现微生物标志物应用于重症肌无力的诊断、预防和治疗。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供用于指示受试者患有重症肌无力或存在患重症肌无力的风险的微生物标志物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种用于重症肌无力的微生物标志物，包括Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的一种或几种。
进一步，所述微生物标志物为Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的任意一种。
进一步，所述微生物标志物为Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的任意两种。
进一步，所述微生物标志物为Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的任意三种。
进一步，所述微生物标志物为Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis的组合。
本发明的第二方面提供了检测本发明第一方面所述的微生物标志物的试剂在制备诊断重症肌无力的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括与来自所述的微生物标志物的靶核苷酸序列特异性杂交的引物或探针；或与来自所述的微生物标志物的靶蛋白特异性结合的抗体或配体。
进一步，所述靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。
进一步，所述靶蛋白是菌种特异性基因区域编码的蛋白。
进一步，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。
本发明的第三方面提供了一种诊断重症肌无力的产品，所述产品包括检测本发明第一方面所述的微生物标志物的试剂。
进一步，所述产品通过16SrDNA测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列和PCR-ELISA、免疫检测的方法检测微生物标志物的丰度。
本发明的第四方面提供了本发明第一方面所述的微生物标志物在构建预测重症肌无力的计算模型中的应用。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的微生物标志物在制备治疗或预防重症肌无力的药物中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis与重症肌无力相关，其丰度在重症肌无力患者和健康人群中呈现显著性差异，ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的准确性、特异性和敏感性，可以将Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri和/或Megamonas_funiformis作为检测靶标应用于重症肌无力患者的诊断。
附图说明
图1是α多样性和β多样性分布的小提琴图；其中，A-C是基于shannon指数的α多样性在门(A)、属(B)和种(C)水平上的分布图；D-F是基于Bray-Curtis距离的β多样性在门(D)、属(E)和种(F)水平上的分布图。
图2是所有参与者在不同分类水平的相对丰度的PcoA，其中图A-F分别是在门、纲、目、科、属、种分类水平的相对丰度的PcoA，红点和蓝色三角形分别代表MG和HC。
图3是根据候选生物标志物的相对丰度构建的MG分类图，其中图A是MG随机森林分类中的五次10折交叉验证错误率的分布图，灰线表示五次交叉验证错误率，黑线表示灰线的平均值，红线表示最优集合中的物种数量；图B是发现队列中MG的概率图；图C是分类模型预测发现队列MG的ROC曲线图。
图4是分类模型在验证队列的验证情况图，其中图A验证样本的分类及其预测MG的概率图；图B是验证队列中的MG概率图；图C是分类模型预测验证队列MG的ROC曲线图。
具体实施方式
为了评估肠道菌群组成能否作为重症肌无力的预测因子，本发明通过收集重症肌无力患者和健康人的样本，进行全基因组测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测重症肌无力患者。本发明通过全基因组测序，首次发现了Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis在重症肌无力患者和健康人中呈现显著性差异，说明Fusobacterium_mortiferum、Prevotella_stercorea、Prevotella_copri或Megamonas_funiformis可作为重症肌无力的预测因子。
当生物标志物在个体中指示异常进程、疾病或其他病症或作为异常进程、疾病或其他病症的标志时，该生物标志物与在个体中指示正常进程、无疾病或其他病症或作为正常进程、无疾病或其他病症的标志的生物标志物的水平或值相比较，通常被描述为含量高的或含量低的。“增加的”、“升高的”和其任何变化形式互换地用来指大于在健康或正常个体中通常检测到的生物标志物的值或水平(或值或水平的范围)的生物样品中的生物标志物的值或水平。
“减少的”、“降低的”和其任何变化形式互换地用来指小于在健康或正常个体中通常检测到的生物标志物的值或水平(或值或水平的范围)的生物样品中的生物标志物的值或水平。
此外，与在个体中指示正常进程或无疾病或其他病症或作为正常进程或无疾病或其他病症的标记的生物标志物的“正常”水平或值相比较，升高的或降低的生物标志物还可称作“差异的”或称作具有“差异水平”或“差异值”。因此，生物标志物的“差异丰度”还可称作生物标志物的“正常”水平的变化形式。
术语“差异生物标志物”用来指相对于其在正常对象中的表达，或相对于其在对特定治疗不同地应答的或具有不同的预后的患者中的表达，其表达在患有特定疾病的对象中被激活为较高或较低水平的生物标志物。
术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经修饰的DNA或者RNA，也可以为未经修饰的DNA或者RNA。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。
本发明可以采用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测微生物标志物的水平。
在本发明中，检测出微生物或测定微生物水平的制剂可以是引物，利用引物的序列扩增的方法可以是例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、降落PCR、热启动PCR、巢式PCR、增效PCR、实时PCR、差示PCR、cDNA末端快速扩增、反向聚合酶链式反应、载体介导PCR、热不对称交错PCR、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制、目标碱基序列的选择性扩增反应。
在本发明中，术语“引物”是能够形成与模板链互补的碱基对，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。
在本发明中，检测出微生物或测定微生物水平的制剂可以是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应微生物或测定微生物水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA，enzyme linked immunosorbentasay)、放射免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation assay)、补体结合分析法(ComplementFixation Assay)、荧光活化细胞分选器(FACS，Fluorescence activated cell sorter)、蛋白芯片(protein chip)等，上述方法只是对抗体-抗原免疫反应的说明，本发明不限于上述方法。
“抗体”在本文中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及自抗体片段形成的多特异性抗体。
本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的重症肌无力。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1筛选与重症肌无力相关的肠道菌群
1、研究对象和样本收集
研究在河北省石家庄市第一医院重症肌无力治疗中心收集的55例儿童重症肌无力患者和36例相应年龄、性别的健康对照(HC)。样本信息如表1所示。
诊断标准：(1)临床表现:眼睑下垂、复视、斜视；(2)新斯的明试验阳性：(3)乙酰胆碱受体抗体抗体阳性：(4)肌电图：面神经低频衰减，高频无递增。符合(1)+(2)或(3)或(4)其中一项者可以明确诊断。
分型：参照2000年美国重症肌无力协会(MGFA)提出新的临床分型与定量重症肌无力评分(QMG)标准型。
纳入标准：患者明确诊断为重症肌无力眼肌型，符合以上诊断标准。
排除标准：(1)年龄<2岁10个月或无年龄信息；(2)3个月内使用β-内酰胺类除外的抗生素；(3)服用其他治疗疾病的药物/激素；(4)使用抗炎药物或未知的中草药。
表1样本临床特征
Figure BDA0002682624020000071
2、DNA抽提和测序
使用DNA提取试剂盒自样本中提取DNA，操作步骤按说明书进行。采用荧光计或微量平板读取器(如Qubit Fluorometer,Invitrogen)检测DNA的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳法(琼脂糖凝胶浓度：1％V，电压：150V，电泳时间：40min)检测样品的完整性和纯度。使用Covaris随机打断基因组DNA，用磁珠筛选出平均大小为200-400bp的片段化的基因组DNA。将得到的DNA片段进行末端修复，将3’端进行腺苷酸化，并将接头连接到3’端腺苷酸化的片段的末端，然后进行PCR扩增。使用磁珠对PCR产物进行纯化。双链PCR产物进行热变形，并用夹板寡核苷酸序列进行环化，将单链环状DNA(SsCir DNA)格式化构建最终文库，并对文库质量进行质控。用phi29对文库进行扩增，得到一个分子拷贝数超过300个的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内(固定在阵列化的硅芯片上)，通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)和多重置换扩增的双末端测序法(MDA-PE)得到读长为100bp/150bp的双末端序列。
3、质量控制
对测得的数据进行质控处理，最终得到优质的数据进行后续的分析，质控步骤如下：1)过滤低质量的reads；2)去除人类基因组序列的污染，使用FastP(REF21)及其默认参数筛选出低质量的reads和序列适配序列，用Bowtie2(REF22)将reads与人类基因组(Hg38)比对，并使用Samtools筛选出不能与人类基因组比对的成对reads，作为后续分析中使用的clean reads。
4、分类注释和功能注释
使用Metlan2将高质量的reads映射到mpa_v20标记基因数据库，得到每个样本不同分类水平的分类丰度图谱。使用merge_metlan_tables.py组合所有样本的结果，并使用内部脚本获得不同物种级别的组合丰度谱表。另一方面，使用humann2将高质量的reads映射到uniref90和chocophlan，以获得基因丰度和通路丰度图谱。然后，分别使用Humann2_Join_Tables、humann2_renorm_table和humann2_Split_Strayfied_table合并所有样品的丰度，并对丰度进行标准化和进行分层分类注释。此外，使用humann2_regroup_table和humann2进行KEGG和GO富集分析。
5、统计分析
根据样本的分组情况，使用R中的Wilcox.test Two.Side函数对所有丰度结果进行差异分析。每次结果中的P值将根据BH方法进行校正，以获得q值(FDR)，用于筛选明显呈现显著性差异的物种和通路。使用Shannon指数计算每个样本的α多样性。在相同的输入下，使用参数为‘method＝dist_method’的R中Vegan包来计算β多样性。同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。
对分类图谱进行主成分分析(PCA)，使用R的Ade4软件包计算PCA的eig结果，dudi.pca函数得到不同PC的特征向量，li结果得到每个样本在PC轴上的坐标，cl得到每个PC在总方差中的贡献百分比。
为了将差异性物种与样本的临床表型联系起来，按照参数‘method＝Spearman，use＝pairwise，adjust＝BH’，采用R包中的corr.tes方法来计算特征与临床表型之间的Spearman相关性。
6、随机森林
选择在MG和健康人呈现显著性差异的菌群，被指定为候选生物标志物。根据随机森林模型(RandomForest 4.6-14软件包)，分别利用每个分类水平的候选生物标志物的相对丰度，构建分类器来区分健康对照和MG患者。采用五次十折交叉验证法对预测模型进行评价。计算平均交叉验证误差曲线和平均曲线中的最小误差，再加上该点的标准差作为滤波预测模型的截止点。选择包含所有组中的最小数目的候选生物标志物并且具有低于临界值的误差的候选生物标志物集合作为最终的构建诊断分类器的生物标志物。然后基于该最优集合计算MG的概率，并且使用PROC包绘制发现队列(实施例1收集的55个MG和36个HC样本)和验证队列(实施例2收集的19个MG和13个HC样本)的接收者动作特征(ROC)。
7、结果
基于Shannon指数的不同分类水平的α多样性和β多样性在患者和健康人群之间没有显著差异(图1)。
PCA和PcoA结果显示，患者和健康人没有显著的聚集分布(图2)。
物种差异性结果分析显示，呈现显著性差异的物种有20个，其中ROC检测AUC值>0.7的有11个，具体情况如表2所示。对20个差异菌群的联合诊断分析，结果如表3所示。
使用随机森林构建分类器，选出四个肠道菌群作为微生物标志物构建分类模型，四个菌群的具体情况如表4所示，上述四种微生物标志物在所有样本中进行诊断效能验证，其AUC值为0.94(图3)，说明使用上述四个肠道菌群单独或者联合作为微生物标志物用于重症肌无力的诊断具有较高的区分效能。
表2差异菌群及AUC值
Figure BDA0002682624020000091
Figure BDA0002682624020000101
表3联合诊断AUC值
Figure BDA0002682624020000102
Figure BDA0002682624020000111
Figure BDA0002682624020000121
Figure BDA0002682624020000131
Figure BDA0002682624020000141
表4生物标志物的含量及诊断效能
Figure BDA0002682624020000142
实施例2验证基因组测序的准确性
按照实施例1的方式收集重症肌无力的样本19例以及健康人的样本13例作为验证队列，患者信息如表5所示。
表5样本临床特征
Figure BDA0002682624020000151
随机选择差异菌群Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi进行测序验证，计算其应用于重症肌无力的诊断效能。
同时以上述样本作为验证集，使用随机森林构建的分类模型进行诊断效能的验证，评估分类模型的准确性。
结果显示，Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi的AUC值分别为0.736842105、0.672064777、0.821862348、0.615384615，与前述检测的结果相当，说明宏基因组的测序数据准确。
使用随机森林构建的预测模型进行诊断效能的验证结果如图4所示，该模型在验证队列的AUC值为0.8036，能够有效的区分MG和HC。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测肠道菌群丰度的试剂在制备诊断重症肌无力的产品中的应用，其特征在于，所述肠道菌群包括Fusobacterium_mortiferum和Prevotella_copri。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括与来自所述的肠道菌群的靶核苷酸序列特异性杂交的引物或探针；或与来自所述的肠道菌群的靶蛋白特异性结合的抗体或配体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白是菌种特异性基因区域编码的蛋白。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过16SrDNA测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列和PCR-ELISA、免疫检测的方法检测肠道菌群的丰度。
CN202010966791.9A 2020-09-15 2020-09-15 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用 Active CN112011604B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010966791.9A CN112011604B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010966791.9A CN112011604B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112011604A CN112011604A (zh) 2020-12-01
CN112011604B true CN112011604B (zh) 2023-04-28

Family

ID=73522322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010966791.9A Active CN112011604B (zh) 2020-09-15 2020-09-15 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112011604B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943636A (zh) * 2019-04-11 2019-06-28 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种结直肠癌微生物标志物及其应用
CN111440884A (zh) * 2020-04-22 2020-07-24 中国医学科学院北京协和医院 源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943636A (zh) * 2019-04-11 2019-06-28 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种结直肠癌微生物标志物及其应用
CN111440884A (zh) * 2020-04-22 2020-07-24 中国医学科学院北京协和医院 源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Perturbed Microbial Ecology in Myasthenia Gravis: Evidence from the Gut Microbiome and Fecal Metabolome;Zheng P等;《Adv Sci》;20190918;第6卷(第18期);第4页左栏第2段，图2 *
人类肠道宏基因组SNP模式与疾病的关联研究;陈垚文;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 医药卫生科技辑》;20171115(第11期);第3.3-3.4节，附录III *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112011604A (zh) 2020-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230184760A1 (en) Marker combinations for diagnosing infections and methods of use thereof
US10626471B2 (en) Gene signatures of inflammatory disorders that relate to the liver
EP2362942B1 (en) Biomarkers
US20180106817A1 (en) Protein biomarkers and therapeutic targets for renal disorders
US20130316921A1 (en) Methods for diagnosis of kawasaki disease
EP3710831A1 (en) Markers for the diagnosis and treatment of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and advanced liver fibrosis
US10793911B2 (en) Host DNA as a biomarker of Crohn&#39;s disease
CN112063709B (zh) 一种以微生物作为诊断标志物的重症肌无力的诊断试剂盒及应用
CN112011604B (zh) 一种用于评估重症肌无力风险的微生物标志物及其应用
WO2018043715A1 (ja) 好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法および検査キット
CN112011605B (zh) 微生物菌群在疾病诊断中的应用
CN112011606B (zh) 肠道菌群在重症肌无力中的应用
CN112226501B (zh) 一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用
CN112029880B (zh) 用于重症肌无力的检测的微生物及应用
CN111996248B (zh) 检测微生物的试剂及其在重症肌无力诊断中的应用
CN116287207B (zh) 生物标志物在诊断心血管相关疾病中的应用
CN112048565B (zh) 源于肠道的诊断重症肌无力的菌群及其用途
CN116042806B (zh) 生物标志物在Cronkhite-Canada综合征诊断中的应用
US20230400473A1 (en) Methods and compositions for the treatment of crohn&#39;s disease
Herrero-Rodríguez et al. PRTN3/FCER1A Transcriptomic Ratio Predicts Hospitalization in Primary Care Attenders With Respiratory Infection
Ke et al. Identification of pattern recognition receptor genes in peripheral blood mononuclear cells and monocytes as biomarkers for the diagnosis of lupus nephritis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant