CN111440884A - 源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途，属于生物医药领域。所述菌群包括Oscillibacter和Eubacterium_brachy_group。通过肠道菌群标志物的检测，可以评估受试者患肌少症的风险，为疾病的诊断和治疗提供辅助参考。

Description

源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及源于肠道的诊断肌少症的菌群及其用途。

背景技术

肌肉衰减综合症(Sarcopenia)，简称肌少症，最早由Evans WJ和Rosenberg IR于1991年提出，它是一种以骨骼肌减少为主要特征，同时还涉及到线粒体功能障碍、骨骼肌炎症、激素紊乱等原因引起的的一系列症状(Lang T,Streeper工Cawthon P,Baldwin K,Taaffe DR,Harris TB.Sarcopenia:etiology,clinical consequences,intervention,and assessment[J].Osteoporos Int,2010,21(4):543-559.)。由于人口老龄化的问题日益严峻，肌少症作为一种常见的老年疾病，是公共健康的重大威胁。从25岁开始，人体的骨骼肌纤维数量每年减少，到70岁为止，人体肌肉体积缩小40％，肌肉力量减低30％，脂肪比重增加15％(Rogers Evans WJ.Changes in skeletal muscle with aging:effects ofexercise training[J].Exerc Sport Sci Rev,1993,21:65-102)。随着年龄的增长，肌少症的发病率呈现出明显的上升趋势。

肌少症的临床表现主要包括肌肉力量下降和肌肉质量的下降。研究表明，肌少症患者在身体各个部位都出现了不同程度的肌肉力量下降，尤其是腿部力量的减少是老年人跌倒摔伤甚至残疾的重要原因。同时研究人员通过双能X线骨密度仪测量瘦体组织，发现肌肉减少症患者的瘦体组织量明显降低，利用三维成像技术的检查结果也表明患者的肌肉横截面积明显减少。

肌少症的发病机理尚未完全阐明，但是研究人员已经发现了以下可能导致肌少症的原因:1)蛋白质代谢平衡被破坏；2)激素水平的下降；3)代谢过程中的氧化损伤；4)疾病的影响；5)骨骼肌的内在变化；6)肠道微生态改变。

肠道微生态的改变影响着疾病的发生、发展，越来越多的临床报告和动物实验证明，肠道菌群是影响疾病和免疫系统响应的重要因素，并且肠道菌群的组成也成为诊断和治疗的生物指标，在一定程度上，通过检测病人粪便中肠道菌群的构成可以判断疾病的发生发展以及治愈程度。目前对肌少症肠道菌群的研究较少，筛选与肌少症相关的肠道菌群，探究其在肌少症发生发展过程中的作用，对于加深肌少症的认知以及实现肌少症的无创诊断具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供与肌少症发生发展相关的肠道菌群及其在诊断和治疗肌少症中的应用，以克服现有肌少症诊断不能做到早期预警、不能实现无创性诊断等确定，能够帮助疾病诊断以及指导药物研究、精准用药等。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种肌少症微生物标志物，所述微生物标志物包括菌属Oscillibacter和/或Eubacterium_brachy_group。

本发明的第二方面提供了一种检测本发明第一方面所述的肌少症微生物标志物的试剂。

本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述的肌少症微生物标志物或本发明第二方面所述的试剂的用途，所述用途包括：

1)用于构建预测肌少症风险的计算模型；

2)制备肌少症疾病诊断的试剂；或

3)制备肌少症诊断试剂盒。

进一步，所述计算模型的输入变量为本发明第一方面所述的肌少症微生物标志物的含量。

进一步，所述肌少症微生物标志物丰度的测定方法包括宏基因组测序、16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或多种。本发明将菌群丰度或含量作为预测指标，因此，不管是用宏基因组测序定量，还是16S测序定量，甚至是qPCR定量，皆可作为测量手段，多样化的定量手段，打破了特定实验设和实验技能的限制，使某些不具备特定实验设备的实验室也可实验本发明的数据测量和预测。

本发明的第四方面提供了一种肌少症诊断试剂盒，所述试剂盒包括检测本发明第一方面所述的肌少症微生物标志物含量的试剂。

进一步，所述试剂包括聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂。

进一步，所述的肌少症微生物标志物含量是通过扩增受试者样本中的肌少症微生物标志物的每一种的片段来确定的。

进一步，所述片段是16S核糖体核酸基因的片段。

进一步，所述扩增是通过聚合酶链式反应实现的。

进一步，所述扩增利用可检测到的被标记的引物。

进一步，利用电泳实现检测。

进一步，利用

PCR检测系统实现检测。

进一步，所述样本是粪便样本。

本发明的第五方面提供了一种利用本发明第一方面所述的微生物标志物诊断或预测肌少症的系统，所述系统包括核酸样本分离装置、测序装置、比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连。

进一步，所述比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。

本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的微生物标志物在制备治疗或预防肌少症的药物或功能性食品中的应用，针对Oscillibacter设计的治疗或预防肌少症的药物或功能性食品能够降低Oscillibacter的含量；针对Eubacterium_brachy_group设计的治疗或预防肌少症的药物或功能性食品能够降低Eubacterium_brachy_group的含量。

本发明的有益效果和优点：

本发明提供一种肌少症微生物标志物，可用于肌少症的预测与辅助诊断，检测特异性好，灵敏度高，指示肠道微生物菌群的状况，指导肠道微生态的调整，降低肌少症的患病率。

本发明的预测肌少症风险模型灵敏度好，精确度高，只用特定的种属细菌丰度作为输入指标，不局限于测量手段，只要能获取细菌丰度值的实验手段均支持本模型方法，有利于本发明的模型实现和推广。

附图说明

图1是Rank-Abundance曲线图。

图2是Oscillibacter和Eubacterium_brachy_group的差异情况图，其中图A是Oscillibacter，图B是Eubacterium_brachy_group。

图3是以Oscillibacter和Eubacterium_brachy_group作为检测变量的ROC曲线图，其中图A是Oscillibacter，图B是Eubacterium_brachy_group。

具体实施方式

本发明的微生物标志物通过运用高通量测序，批量分析健康人群和肌少症患者的粪便样本。基于高通量测序数据，对健康人群与肌少症患者群进行比对，从而确定与肌少症患者群相关的特异性核酸序列。

简言之，其步骤如下：

样品的收集与处理：收集健康人群与肌少症患者群的粪便样本，使用试剂盒进行DNA提取，得到核酸样本；

文库构建和测序：DNA文库构建和测序是利用高通量测序进行，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；

通过生物信息学的分析方法，确定与肌少症患者相关的特异性肠道微生物核酸序列。首先，将测序序列(reads)与参照基因集(也称为参考基因集，可以为新构建的基因集或任何已知序列的数据库，例如，采用已知的人肠道微生物群落非冗余基因集)进行比对。接下来，基于比对结果，分别确定来自健康人群和肌少症患者群粪便样品的核酸样本中各基因的相对丰度。通过将测序序列与参照基因集进行比对，可以将测序序列与参照基因集中的基因建立对应关系，从而针对核酸样本中的特定基因，与其相对应的测序序列的数目可以有效地反映该基因的相对丰度。由此，可以通过比对结果，按照常规的统计分析，确定在核酸样本中基因的相对丰度。最后，在确定核酸样本中各基因的相对丰度后，对来自健康人群和肌少症患者群粪便的核酸样本中各基因的相对丰度进行统计检验，由此，可以判断在健康人群和肌少症患者人群中是否存在相对丰度有显著差异的基因，如果存在基因是显著差异的，则该基因被当作是异常状态的生物标志物，即核酸标志物。

另外，对于已知或新构建的参照基因集，其通常包含基因物种信息和功能注释，由此，在确定基因相对丰度的基础上，可以进一步通过将基因的物种信息和功能注释进行分类，从而确定肠道菌群中各微生物的物种相对丰度，也就可以进一步确定异常状态的物种标志物和功能标志物。

简言之，确定物种标志物和功能标志物的方法进一步包括：将健康人群和肌少症患者群的测序序列与参照基因集进行比对；基于比对结果，分别确定健康人群和肌少症患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度；对来自健康人群和肌少症患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度进行统计学。

最后，确定了在健康人群和肌少症患者群的粪便样品之间相对丰度存在显著差异的生物学标志物，由此，通过检测上述微生物至少一种是否存在，来有效地确定对象是否患有或者易感肌少症，并且可以用于监控肌少症患者的治疗效果。在本发明中，既可以定性分析样本中是否含有相应的目标物，也可以对样本中的目标物进行定量分析，并且还可以进一步将所得到的定量分析结果与参照(例如通过对具有已知状态的样本进行平行试验所得到的定量分析结果)进行统计学分析或者任何已知数学运算所得到的结果。本领域技术人员可以根据需要和试验条件进行容易的选择。根据本发明的实施例，还可以通过确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，从而确定对象是否患有或者易感肌少症，以及用于监控肌少症患者的治疗效果。

可以通过检测对象肠道菌群中是否存在微生物标志物中的至少一种，也可以是检测对象肠道菌群中是否存在两种或者多种，即是否存在生物标志物组合，从而来有效地确定对象是否患有或者易感肌少症，并且可以用于监控肌少症患者的治疗效果。在本发明中，术语“生物标志物组合”是指一组生物标记物(即两个或更多个生物标志物的组合)。

对于物种标志物和功能标志物本领域技术人员还可以通过常规的菌种鉴别手段和生物活性检验手段来确定在肠道菌群中是否存在所述物种和功能。例如，菌种鉴别可以通过进行16s rRNA、宏基因组进行。

在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断肌少症：在来自个体的核酸样本中，检测与肌少症的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于Oscillibacter或Eubacterium_brachy_group的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术，这些技术是公知的。

作为一种可选择的实施方式，检测微生物标志物的方法是测序的方法，所述测序方法是包括但不限于第二代测序方法或第三代测序方法。进行测序的手段并不受特别限制，通过二代或者三代测序的方法进行测序，可以实现快速高效的测序。作为具体的实施方式，所述测序方法是通过选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行的。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。

本发明提供了利用微生物标志物Oscillibacter或Eubacterium_brachy_group诊断或预测肌少症的系统，所述系统包括核酸样本分离装置、测序装置、比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连。比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。

作为一种可选择的实施方式，测序装置与样本分离装置相连，基于所获得的的核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果。比对装置与测序装置相连，并且基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。

作为一种可选择的实施方式，测序装置并不受特别限制。优选地，所述装置利用第二代测序方法或第三代测序方法进行。优选地，所述测序装置为选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。

本领域技术人员知晓，当进一步扩大样本量时，利用本领域公知的样本检测和计算方法，可以得出每种生物标志物在样本中的正常含量值区间(绝对数值)。可以将检测得到的生物标志物含量的绝对值与正常含量值进行比较，任选地，还可以结合统计学方法，以得出肌少症患病风险评价、诊断以及用于监控肌少症患者的治疗效果的效率等。

不希望受任何理论的限制，发明人指出这些生物标志物是存在于人体中的肠道菌群。通过本发明所述的方法对受试者肠道菌群进行关联分析，得到肌少症症群体的所述生物标志物在菌群检测中表现出一定的含量范围值。同时，需要说明的是，本发明针对肌少症的生物标志物具有较佳的特异性。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1筛选与肌少症相关的肠道菌群

1、研究对象和样本收集

收集11例肌少症以及60例健康人的粪便样本。患者资料统计如表1所示。

表1患者资料

2、16S rRNA测序

2.1DNA的提取

使用基因组DNA提取试剂盒自样本中提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

2.2DNA样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

2.3PCR扩增及产物纯化

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNAPolymerase；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。

2.4Miseq文库构建

连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.5Miseq测序

将DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”，PCR扩增，产生DNA簇，将DNA扩增子线性化成为单链，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

3、数据分析

3.1数据预处理

Miseq测序得到的是Pair-End(PE)双端序列数据，对测得的Fastq数据进行质控处理，最终得到优质的Fasta数据。

使用FLASH、Trimmomatic等软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用Vearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多OUT，采用RDP classifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，并使用Silva数据库进行比对。

3.2肠道菌群物种差异分析

使用mothur软件的Metastats分析组间显著性差异，找出两组中具有显著差异的微生物类型，使用R及其qvalue包的Kruskal-Wallis秩和检验计算多组独立数据均值之间的差异，使用R及其stats包的Wilcoxon检验比较两个配对组之间的差异并分析这些差异，同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。

4、结果

测序数据及OUT信息如表2所示，Case代表肌少症患者，CON代表健康对照。

物种多样性分析结果如图1所示，在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状(平滑程度)反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。

物种差异性分析结果显示，与健康人相比，肌少症患者中的Oscillibacter和Eubacterium_brachy_group丰度水平显著增加，差异具有统计学意义，(Oscillibacter：P＝0.000767；Eubacterium_brachy_group：P＝0.033407)，差异情况如图2所示。

表2测序数据以及OUT数目统计

实施例2验证微生物标志物与肌少症之间的相关性

1、研究对象和样本收集

按照实施例1的方式收集肌少症的样本11例以及健康人的样本72例。患者资料统计如表3所示。

表3患者信息

2、16S rRNA测序及数据分析同实施例1。

3、结果

检测结果显示，Oscillibacter和Eubacterium_brachy_group丰度水平显著增加差异具有统计学意义，(Oscillibacter：P＝0.01458；Eubacterium_brachy_group：P＝0.014354)。ROC曲线结果显示，Oscillibacter作为检测变量的AUC值为0.821，最佳临界值的特异性为0.861，敏感性为0.727(图3A)；Eubacterium_brachy_group检测变量的AUC值为0.732，最佳临界值的特异性为0.875，敏感性为0.636(图3B)，提示将Oscillibacter和Eubacterium_brachy_group应用于肌少症的诊断具有较高的诊断效能。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种肌少症微生物标志物，其特征在于，所述微生物标志物包括菌属Oscillibacter和/或Eubacterium_brachy_group。

2.一种检测权利要求1所述的肌少症微生物标志物的试剂。

3.一种如权利要求1所述的肌少症微生物标志物或权利要求2所述的试剂的用途，其特征在于，所述用途包括：

1)用于构建预测肌少症风险的计算模型；

2)制备肌少症疾病诊断的试剂；或

3)制备肌少症诊断试剂盒。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述计算模型的输入变量为权利要求1所述的肌少症微生物标志物的含量。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肌少症微生物标志物丰度的测定方法包括宏基因组测序、16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或多种。

6.一种肌少症诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测权利要求1所述的肌少症微生物标志物含量的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述的肌少症微生物标志物含量是通过扩增受试者样本中的肌少症微生物标志物的每一种的片段来确定的；优选的，所述片段是16S核糖体核酸基因的片段；优选的，所述扩增是通过聚合酶链式反应实现的；优选的，所述扩增利用可检测到的被标记的引物；优选的，利用电泳实现检测；优选的，利用

PCR检测系统实现检测；优选的，所述样本是粪便样本。

9.一种利用权利要求1所述的微生物标志物诊断或预测肌少症的系统，其特征在于，所述系统包括核酸样本分离装置、测序装置、比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连；优选地，所述比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。

10.权利要求1所述的微生物标志物在制备治疗或预防肌少症的药物或功能性食品中的应用，其特征在于，针对Oscillibacter设计的治疗或预防肌少症的药物或功能性食品能够降低Oscillibacter的含量；针对Eubacterium_brachy_group设计的治疗或预防肌少症的药物或功能性食品能够降低Eubacterium_brachy_group的含量。

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