CN111996248A - 检测微生物的试剂及其在重症肌无力诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测微生物的试剂及其在重症肌无力诊断中的应用，所述试剂能够检测微生物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的丰度。本发明同时公开了一种包括检测微生物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的丰度的诊断重症肌无力的产品。

Description

检测微生物的试剂及其在重症肌无力诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及检测微生物的试剂及其在重症肌无力诊断中的应用。
背景技术
重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是典型的神经肌肉接头自身免疫性疾病，其生物学标志物为具有致病性和高度特异性的自身抗体。在细胞免疫和补体的参与下，自身抗体导致乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)的破坏、神经肌肉之间的信号传导障碍(Barber C.Diagnosis and management of myasthenia gravis[J].NursStand.2017；31(43):42-7.)。主要临床表现为波动性骨骼肌收缩无力，极易疲劳，肌肉持续收缩后症状加重，休息后或应用乙酰胆碱酯酶抑制剂后症状明显减轻，有“晨轻暮重”现象，严重者呼吸肌可受累，甚至危及生命。MG在各个年龄阶段均可发病，年平均发病率为(8.0～20.0)/10万人(中华医学会神经病学分会神经免疫学组.中国重症肌无力诊断和治疗指南2015[J].中华神经科杂志.2015；11(48).)。MG病因及发病机制，特别是引起MG免疫应答的始动环节目前尚不清楚，有学者认为病因与遗传因素和环境因素有关。重症肌无力患者临床症状可分为局灶性的或者全身性的，发病形式可以是急性、亚急性或慢性的，病程可分为进展、缓解和复发。由于早期肌无力的症状不具有特异性，往往容易误诊为动眼神经麻痹、垂直注视麻痹或运动神经元疾病，从而引起治疗的延误(Querol L,Illa I.MyastheniaGravis and the Neuromuscular Junction.Curr Opin Neurol.2013；5:459-65；LiewluckT.Immune-Mediated Rippling Muscle Disease:Another Inflammatory Myopathy inMyasthenia Gravis.Arch Neurol.2010；7:896-7,897.)。
既往研究表明，定植于人体的数目巨大、结构组成极其复杂的微生物群落在与人类共同进化的过程中形成了互惠互利的共生关系，与人类的健康和疾病密切相关。随着生物技术的发展，下一代高通量测序(NGS，又称第二代高通量测序)技术的迅速发展和广泛应用，突破了传统微生物鉴别方法的局限性，为微生物组的研究提供了一个新的契机，使得快速、全面、深入地研究微生物组成为可能[39]。本研究使用测序平台对重症肌无力患者的肠道菌群进行宏基因组测序分析，以研究重症肌无力患者菌群的结构组成及其多样性，比较分析重症肌无力患者与健康对照之间的菌群的差异，探讨菌群失衡与重症肌无力的关系。以期为重症肌无力患者在诊断、预防和治疗上带来更多的可能性。
发明内容
本发明的目的在于开发可利用分子检测微生物以实现重症肌无力的诊断的产品。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测微生物标志物的试剂在制备诊断重症肌无力的产品中的应用，所述微生物标志物选自Prevotella_copri、Prevotella_bivia、Sutterella_parvirubra的一种或几种。
进一步，所述微生物标志物为Prevotella_bivia和Sutterella_parvirubra的组合。
进一步，所述试剂是对所述微生物标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
进一步，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。
本发明提供了一种诊断重症肌无力的产品，所述产品包括检测微生物标志物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的试剂。
进一步，所述产品通过选自以下的方法对样品中的微生物标志物进行检测：16SrDNA测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列和PCR-ELISA，优选通过定量聚合酶链反应进行检测。
进一步，所述产品还包括提取样品中微生物标志物的核酸分子的试剂。
本发明提供了微生物标志物在构建预测重症肌无力的计算模型中的应用，所述微生物标志物选自Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra。
本发明提供了一种诊断重症肌无力的系统，所述系统包括：
样品处理单元，接收来自受试者群体的样品的聚合集；
数据分析单元，将样品聚合集的内容处理生成所述受试者微生物组成数据集和微生物功能多样性数据集；
疾病分析单元，提取数据分析单元的微生物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的丰度作为特征转化成重症肌无力的表征模型，判断受试者患重症肌无力的风险。
本发明提供了微生物标志物在制备预防或治疗重症肌无力的药物中的应用，所述微生物标志物选自Prevotella_copri、Prevotella_bivia、Sutterella_parvirubra的一种或几种。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过测序首次发现了Prevotella_copri、Prevotella_bivia和Sutterella_parvirubra与重症肌无力相关，其丰度在重症肌无力患者和健康人群中呈现显著性差异，ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性，因此，可以将Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra作为检测标志物应用于重症肌无力患者的诊断。以Prevotella_copri、Prevotella_bivia或Sutterella_parvirubra作为检测标志物，完全无创，具有较高的准确性、特异性、敏感性。
附图说明
图1是α多样性和β多样性分布的小提琴图；其中，A-C是基于shannon指数的α多样性在门(A)、属(B)和种(C)水平上的分布图；D-F是基于Bray-Curtis距离的β多样性在门(D)、属(E)和种(F)水平上的分布图。
图2是所有参与者在不同分类水平的相对丰度的PcoA，其中图A-F分别是在门、纲、目、科、属、种分类水平的相对丰度的PcoA，红点和蓝色三角形分别代表MG和HC。
具体实施方式
为了评估肠道共生菌群组成能否作为重症肌无力的预测因子，本发明通过收集重症肌无力患者和健康人的样本，进行全基因组测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群。本发明通过全基因组测序，首次发现了Prevotella_copri、Prevotella_bivia或Sutterella_parvirubra在重症肌无力患者和健康人中呈现显著性差异，说明Prevotella_copri、Prevotella_bivia或Sutterella_parvirubra可作为重症肌无力的预测因子。
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
在本发明中，微生物的类型没有特别限制，并且其例如包括细菌、病毒、真菌、微小的藻类和原生动物及其组合。本发明的具体实施方式中，所述微生物包括菌种Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra。
术语“核酸分子”指具有确定序列的多核苷酸分子。其包括DNA分子、RNA分子、核苷酸类似物分子及其组合和衍生物，如掺入核苷酸类似物的DNA分子或RNA分子或者cDNA。
术语“二代测序”或“高通量测序”指高通量测序技术，其将测序过程并行，一次产生数千条或数百万条序列。实例包括大规模平行信号测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polonysequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序、通过杂交进行的测序、扩增子测序、GnuBio。
在本发明的背景下，“样品”是包含来自细菌微生物的至少一种核酸分子的样品。样品的实例是：细胞、组织、体液、活检标本、血液、尿液、粪便、唾液、痰、血浆、血清、细胞培养上清液、拭子样品等。根据某些实施方案，样品是粪便。根据本发明的实施例，可以运用高通量测序，批量分析健康人群和重症肌无力患者的粪便样本。基于高通量测序数据，对健康人群与重症肌无力患者进行比对，从而确定与重症肌无力患者相关的特异性核酸序列。
通过测序获得的数据可以是任何形式，并且其随后可用于通过已知的下述方法来鉴定待鉴定的微生物如Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra物种的核酸，从而鉴定基因：例如指纹分析法、比较基因组和/或与目标微生物的一个或多个物种的至少一个或多种基因组，即参考基因组进行比对等，形成Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra物种的比对基因的第三数据集-排除来自其它来源(例如脊椎动物)的其它数据。参考基因组未具体限定，并且可以取自数个数据库。可将不同的参考基因组或多于一个的参考基因组用于比对，这取决于微生物。利用参考基因组-以及来自其它物种(例如，Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra物种)的基因组的数据-可以获得各个物种以及不同物种(例如，Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra)的整批样品的丰度情况。
本申请所用的术语“丰度”是指生物样品中目标微生物的数量的量度。“丰度”也被称为“负载”。一般通过分子方法，典型地通过例如荧光原位杂交(FISH)、定量聚合酶链反应(qPCR)或PCR/焦磷酸测序测定所述目标微生物的16S rRNA基因拷贝数，进行细菌定量。生物样品内目标核酸序列丰度的定量可能是绝对的或相对的。“相对定量”通常是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16S rRNA基因，比如使用通用引物并且将目标核酸序列的丰度表达为总细菌16S rRNA基因拷贝的百分比或通过大肠杆菌16S rRNA基因拷贝归一化而测定的细菌。“绝对定量”通过与DNA标准进行比较或通过DNA浓度归一化来给出目标分子的确切数目。
本申请所用的术语“曲线下面积”或“AUC”是指本技术领域中所众所周知的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve；ROC)的下面积。曲线下面积(AUC)测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。具有更大的曲线下面积(AUC)的分类器具有更大的能力以在两个感兴趣的组(例如，重症肌无力样本及正常或对照样本)之间准确分类未知物。在于区别两个群体(例如，具有重症肌无力的组与对照组)方面上，受试者工作特征曲线(ROC)有用于以图表形式来表现特定的特征(例如，本发明中所描述的生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目)的性能。通常，基于单一特征值，经由整个群体(例如，患者组及对照组)的上述特征数据被升序排列。然后，针对上述特征的每个值，计算对于数据的真阳性率及假阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的病例数之后，除以总病例数来测定上述真阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的对照组数之后，除以总对照组数来测定上述假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况，但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况(在这种情况下，可计算出低于上述特性的值的样本的数)。受试者工作特征曲线(ROC)可以针对其他单一计算，还可针对单一特性生成，为了提供单一和值，例如，可数学性地组合两个以上的特性(例如，加、减等)，该单一和值可由受试者工作特征曲线(ROC)来表示。附加地，能够以受试者工作特征曲线(ROC)来画出可导出单一计算值的多重特性的组合。这些特性组合可构成测试。上述受试者工作特征曲线(ROC)为表示相对于测试的假阳性率(1-特异性)的测试的真阳性率(灵敏度)的图表。
本发明提供了一种诊断重症肌无力的系统，所述系统包括：
样品处理单元，接收来自受试者群体的样品的聚合集；
数据分析单元，将样品聚合集的内容处理生成所述受试者微生物组成数据集和微生物功能多样性数据集；
疾病分析单元，提取数据分析单元的微生物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的丰度作为特征转化成重症肌无力的表征模型，判断受试者患重症肌无力的风险。
作为一种优选的实施方式，所述样品聚合集的内容包括用所述样品的聚合集进行片段化操作、使用引物组的多重扩增操作、测序操作和比对操作。
微生物组成和功能方面，包括与微生物跨越界、门、纲、目、科、属、种、亚种、株、种下分类单元(例如，如以每个群的总丰度、每个群的相对丰度、代表的群的总数等等测量的)和/或任何其他合适的分类单元的不同群的分布相关的参数。组成和功能方面也可以根据操作分类单位呈现。组成和功能方面可以另外地或可选地包括在遗传水平的组成方面(例如，通过多位点序列分型确定的区域、16S序列、18S序列、ITS序列、其他遗传标志物、其他系统发育标志物等等)。组成和功能方面可以包括与特定功能(例如，酶活性、转运功能、免疫活性等等)相关的基因的存在或不存在或量。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1筛选与重症肌无力相关的肠道菌群
1、研究对象和样本收集
研究在河北省石家庄市第一医院重症肌无力治疗中心收集的55例儿童重症肌无力患者和36例相应年龄、性别的健康对照(HC)。样本信息如表1所示。
诊断标准：(1)临床表现:眼睑下垂、复视、斜视；(2)新斯的明试验阳性：(3)乙酰胆碱受体抗体抗体阳性：(4)肌电图：面神经低频衰减，高频无递增。符合(1)+(2)或(3)或(4)其中一项者可以明确诊断。
分型：参照2000年美国重症肌无力协会(MGFA)提出新的临床分型与定量重症肌无力评分(QMG)标准型。
纳入标准：患者明确诊断为重症肌无力眼肌型，符合以上诊断标准。
排除标准：(1)年龄<2岁10个月或无年龄信息；(2)3个月内使用β-内酰胺类除外的抗生素；(3)服用其他治疗疾病的药物/激素；(4)使用抗炎药物或未知的中草药。
表1样本临床特征
Figure BDA0002683149370000071
2、DNA抽提和测序
使用DNA提取试剂盒自样本中提取DNA，操作步骤按说明书进行。采用荧光计或微量平板读取器(如Qubit Fluorometer,Invitrogen)检测DNA的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳法(琼脂糖凝胶浓度：1％V，电压：150V，电泳时间：40min)检测样品的完整性和纯度。使用Covaris随机打断基因组DNA，用磁珠筛选出平均大小为200-400bp的片段化的基因组DNA。将得到的DNA片段进行末端修复，将3’端进行腺苷酸化，并将接头连接到3’端腺苷酸化的片段的末端，然后进行PCR扩增。使用磁珠对PCR产物进行纯化。双链PCR产物进行热变形，并用夹板寡核苷酸序列进行环化，将单链环状DNA(SsCir DNA)格式化构建最终文库，并对文库质量进行质控。用phi29对文库进行扩增，得到一个分子拷贝数超过300个的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内(固定在阵列化的硅芯片上)，通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)和多重置换扩增的双末端测序法(MDA-PE)得到读长为100bp/150bp的双末端序列。
3、质量控制
对测得的数据进行质控处理，最终得到优质的数据进行后续的分析，质控步骤如下：1)过滤低质量的reads；2)去除人类基因组序列的污染，使用FastP(REF21)及其默认参数筛选出低质量的reads和序列适配序列，用Bowtie2(REF22)将reads与人类基因组(Hg38)比对，并使用Samtools筛选出不能与人类基因组比对的成对reads，作为后续分析中使用的clean reads。
4、分类注释和功能注释
使用Metlan2将高质量的reads映射到mpa_v20标记基因数据库，得到每个样本不同分类水平的分类丰度图谱。使用merge_metlan_tables.py组合所有样本的结果，并使用内部脚本获得不同物种级别的组合丰度谱表。另一方面，使用humann2将高质量的reads映射到uniref90和chocophlan，以获得基因丰度和通路丰度图谱。然后，分别使用Humann2_Join_Tables、humann2_renorm_table和humann2_Split_Strayfied_table合并所有样品的丰度，并对丰度进行标准化和进行分层分类注释。此外，使用humann2_regroup_table和humann2进行KEGG和GO富集分析。
5、统计分析
根据样本的分组情况，使用R中的Wilcox.test Two.Side函数对所有丰度结果进行差异分析。每次结果中的P值将根据BH方法进行校正，以获得q值(FDR)，用于筛选明显呈现显著性差异的物种和通路。使用Shannon指数计算每个样本的α多样性。在相同的输入下，使用参数为‘method＝dist_method’的R中Vegan包来计算β多样性。同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。
对分类图谱进行主成分分析(PCA)，使用R的Ade4软件包计算PCA的eig结果，dudi.pca函数得到不同PC的特征向量，li结果得到每个样本在PC轴上的坐标，cl得到每个PC在总方差中的贡献百分比。
为了将差异性物种与样本的临床表型联系起来，按照参数‘method＝Spearman，use＝pairwise，adjust＝BH’，采用R包中的corr.tes方法来计算特征与临床表型之间的Spearman相关性。
6、结果
基于Shannon指数的不同分类水平的α多样性和β多样性在患者和健康人群之间没有显著差异(图1)。
PCA和PcoA结果显示，患者和健康人没有显著的聚集分布(图2)。
物种差异性结果分析显示，呈现显著性差异的物种有20个，其中ROC检测AUC值>0.7的有11个，具体情况如表2所示。对20个差异菌群的联合诊断分析，结果如表3所示。其中，相比于健康对照(平均丰度为4.977)，Prevotella_copri在MG患者中(平均丰度为13.344)显著增加，其AUC值为0.805，诊断阈值为0.112，最佳临界点的特异性为0.889，敏感性为0.691；相比于健康对照(平均丰度为0.00133)，Prevotella_bivia在MG患者中(平均丰度为0.0582)显著增加，其AUC值为0.697，诊断阈值为0.000035，在最佳临界点的特异性为0.778，相比于健康对照(平均丰度为0.02713)，Sutterella_parvirubra在MG患者中显著增加(平均丰度为0.14908)，其AUC值为0.681(阈值为0.001，特异性为0.944)，说明使用上述3个菌诊断重症肌无力具有较高的准确性和特异性。分析上述菌群的联合诊断效能，发现Prevotella_copri与Prevotella_bivia、Prevotella_bivia与Sutterella_parvirubra联合具有较高的诊断效能(AUC值分别为0.812和0.825)，说明将上述菌群单独或者联合作为检测指标能有效的区分重症肌无力患者和健康人。
表2差异菌群及AUC值
Figure BDA0002683149370000091
Figure BDA0002683149370000101
表3联合诊断AUC值
Figure BDA0002683149370000102
Figure BDA0002683149370000111
Figure BDA0002683149370000121
Figure BDA0002683149370000131
Figure BDA0002683149370000141
实施例2验证基因组测序的准确性
按照实施例1的方式收集重症肌无力的样本19例以及健康人的样本13例，患者信息如表4所示。
表4样本临床特征
Figure BDA0002683149370000151
随机选择差异菌群Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi进行测序验证，计算其应用于重症肌无力的诊断效能。
结果显示，Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi的AUC值分别为0.736842105、0.672064777、0.821862348、0.615384615，与前述检测的结果相当，说明宏基因组的测序数据准确。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测微生物标志物的试剂在制备诊断重症肌无力的产品中的应用，其特征在于，所述微生物标志物选自Prevotella_copri、Prevotella_bivia、Sutterella_parvirubra的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物标志物为Prevotella_bivia和Sutterella_parvirubra的组合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂是对所述微生物标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。
5.一种诊断重症肌无力的产品，其特征在于，所述产品包括检测微生物标志物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的试剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品通过选自以下的方法对样品中的微生物标志物进行检测：16SrDNA测序、全基因组测序、定量聚合酶链反应、PCR-焦磷酸测序、荧光原位杂交、微阵列和PCR-ELISA，优选通过定量聚合酶链反应进行检测。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品还包括提取样品中微生物标志物的核酸分子的试剂。
8.微生物标志物在构建预测重症肌无力的计算模型中的应用，其特征在于，所述微生物标志物选自Prevotella_copri、Prevotella_bivia或Sutterella_parvirubra。
9.一种诊断重症肌无力的系统，其特征在于，所述系统包括：
样品处理单元，接收来自受试者群体的样品的聚合集；
数据分析单元，将样品聚合集的内容处理生成所述受试者微生物组成数据集和微生物功能多样性数据集；
疾病分析单元，提取数据分析单元的微生物Prevotella_copri、Prevotella_bivia和/或Sutterella_parvirubra的丰度作为特征转化成重症肌无力的表征模型，判断受试者患重症肌无力的风险。
10.微生物标志物在制备预防或治疗重症肌无力的药物中的应用，其特征在于，所述微生物标志物选自Prevotella_copri、Prevotella_bivia、Sutterella_parvirubra的一种或几种。
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