CN112048552B - 诊断重症肌无力的肠道菌群及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了诊断重症肌无力的肠道菌群及其应用，所述肠道菌群为Dialister_succinatiphilus。本发明通过全基因组测序首次发现了Dialister_succinatiphilus在重症肌无力中呈现显著性上调，进一步发现了使用Dialister_succinatiphilus或Dialister_succinatiphilus与Sutterella_parvirubra联合作为检测变量区分重症肌无力和健康群体具有较高的特异性和敏感性，基于此，可以将Dialister_succinatiphilus或Dialister_succinatiphilus与Sutterella_parvirubra的组合应用于重症肌无力的无创诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及诊断重症肌无力的肠道菌群及其应用。
背景技术
重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)作为一种由自身抗体介导的、细胞免疫依赖性、补体参与的自身免疫性疾病(De Baets M,Stassen MH.The role of antibodies inmyasthenia gravis[J].JNeurol Sci,2002,202(1-2):5-11.)。其发病可能与整个神经肌肉接头处信息传递障碍有关。1958年Osserman首次提出MG临床分型：I型(眼肌型)是指病变仅在眼外肌：II型(全身型)分IIa型(轻度全身型)表现四肢肌轻度受累常伴眼外肌受累：IIb型(中度全身型)表现全身无力伴有咀嚼、吞咽、构音困难；III型(急性重症型)是指急性起病，出现球麻痹及呼吸肌麻痹；IV型(迟发重症型)是指隐性起病，进展较慢，常由I或II型在2年内发展到球麻痹和呼吸肌麻痹；V型(肌萎缩型)是指出现肌萎缩(Osserman KE,Genkins G Studies in myasthenia gravis:review of a twenty year experience inover 1200patients[J].Mt Sinai J Med,1971,38(6):497-537.)。
目前已知的微生物数目远超过人类细胞数目，人体内的大部分微生物都寄居在肠道，这些肠道微生物通过介导各种各样的宿主反应起着肠道屏障、免疫和内分泌功能(Bindels LB,Delzenne NM.Muscle wasting:the gut microbiota as a newtherapeutic target？[J]Int J Biochem Cell Biol,2013,45(10):2186-2190.)。肠道微生态的组成随着年龄的不同而有所改变(Odamaki T,Kato K,Sugahara H,et al.Age-related changes in gut microbiota composition from newborn to centenarian:acrosssectional study[J].BMC Microbiol,2016,16:90.)。多项研究发现，肠道微生态与人类的健康息息相关。重症肌无力严重影响了人们的生活质量，而且增加了社会负担，研究与重症肌无力相关的肠道菌群，探究其在重症肌无力发生发展过程中的作用，对于加深重症肌无力的认知以及实现重症肌无力的诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供与重症肌无力发生发展相关的肠道菌群及其在诊断和治疗重症肌无力中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了用于检测肠道菌群丰度的一种或多种试剂在制备用于预测重症肌无力的产品中的用途，所述肠道菌群至少包括肠道菌种Dialister_succinatiphilus。
进一步，所述肠道菌群还包括Sutterella_parvirubra。
进一步，所述试剂包括与来自Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra的靶核苷酸序列能够特异性杂交的一种或多种寡核苷酸。
进一步，所述产品还包括从样本中分离核酸的试剂。
进一步，所述寡核苷酸被可检测地标记。
进一步，Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra的靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。
本发明提供了一种预测重症肌无力的试剂盒，所述试剂盒包括检测肠道菌群Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra丰度的试剂。
进一步，所述试剂包括与来自Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra的靶核苷酸序列能够特异性杂交的一种或多种寡核苷酸。
进一步，所述寡核苷酸包括特异性识别Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra的靶核苷酸序列的探针或特异性扩增Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra的靶核苷酸序列的引物。
进一步，所述扩增是PCR或RT-PCR，优选的，所述扩增利用可检测的被标记的引物。
本发明提供了一种组合物及其在制备治疗重症肌无力的药物中的应用，所述组合物包括降低Dialister_succinatiphilus和/或Sutterella_parvirubra丰度的试剂。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
附图说明
图1是α多样性和β多样性分布的小提琴图；其中，A-C是基于shannon指数的α多样性在门(A)、属(B)和种(C)水平上的分布图；D-F是基于Bray-Curtis距离的β多样性在门(D)、属(E)和种(F)水平上的分布图。
图2是所有参与者在不同分类水平的相对丰度的PcoA，其中图A-F分别是在门、纲、目、科、属、种分类水平的相对丰度的PcoA，红点和蓝色三角形分别代表MG和HC。
图3是肠道菌群标志物Dialister_succinatiphilus作为检测变量的ROC曲线。
具体实施方式
为了评估肠道共生菌群组成能否作为重症肌无力的预测因子，本发明通过收集重症肌无力患者和健康人的样本，进行全基因组测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测重症肌无力患者。本发明通过全基因组测序，首次发现了Dialister_succinatiphilus或Sutterella_parvirubra在重症肌无力患者和健康人中呈现显著性差异，并通过差异菌群的联合诊断分析，发现Dialister_succinatiphilus或Sutterella_parvirubra联合应用于重症肌无力的诊断具有较高的效能。
在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断重症肌无力：在来自个体的核酸样本中，检测与重症肌无力的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于Dialister_succinatiphilus或Sutterella_parvirubra的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术，这些技术是公知的。
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的重症肌无力。
本文中使用的术语“片段”表示长度至少为约15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、1000个核苷酸或更多核苷酸的多核苷酸。
本文中使用的术语“核酸”泛指：染色体的段；DNA、cDNA和/或RNA的段或部分。核酸可以自最初与任何源分离的核酸样本(例如，与样本DNA或RNA分离、从样本DNA或RNA纯化、扩增、克隆或逆转录)获取或获得。
本文中使用的术语“寡核苷酸”表示由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其任意组合构成的短聚合物。寡核苷酸的长度通常在大10个核苷酸和大约100个核苷酸之间。寡核苷酸优选地长度为15个核苷酸到70个核苷酸，最通常的是20个核苷酸到26个核苷酸。寡核苷酸可以用作引物或探针。
当寡核苷酸和核酸对齐时，如果该寡核苷酸与该核酸的一部分具有至少50％的序列同源性，则该寡核苷酸对该核酸为“特异”的。对一核酸特异的寡核苷酸是这样的寡核苷酸：在合适的杂交条件或洗涤条件下，其能够与所关注的目标杂交且基本上不与未关注的核酸杂交。较高程度的序列同源性是优选的且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同源性。
本文中使用的术语“杂交”或“特异性杂交”指的是两个互补的核酸链在适当严格的条件下彼此退火结合。通常利用探针长度的核酸分子来进行杂交。核酸杂交技术在现有技术中是公知的。本领域的技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格度，使得具有至少所需程度的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列将不能稳定地杂交。
本文中使用的术语“扩增”表示现有技术已知的用于复制目标核酸且由此增大所选择的核酸序列的拷贝的数量的一种或多种方法。扩增可以是以指数的或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。以此方式扩增的序列形成“扩增子”。尽管下文描述的示例性方法涉及利用聚合酶链反应(“PCR”)进行扩增，但在现有技术中已知用于扩增核酸的很多其他方法(例如，等温法、滚环法等)。本领域的技术人员将理解，这些其他的方法可以替代PCR方法使用或者可以与PCR方法一起使用。
本文中使用的术语“目标核酸”或“靶核苷酸”指的是针对其设计探针或引物的染色体的片段、具有或者不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的片段或部分或者核酸序列。目标核酸可以包括：野生型序列；含突变、删除或复制的核酸序列；串联重复；所关注的基因；所关注的基因的区域或者其任何上游区域或下游区域。目标核酸可以表示特定基因的替代序列或等位基因。目标核酸可以从基因组DNA、cDNA或RNA获得。本文中使用的目标核酸可以是天然DNA或经PCR扩增的产物。在一个实施方式中，目标核酸是来自细菌种群的16S核糖体RNA基因的片段。
本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。
本发明的方法和组合物可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。
用于检测测定的起始材料通常为怀疑包括Dialister_succinatiphilus或Sutterella_parvirubra的临床样本。临床样本的示例为粪便。接着，可以将核酸与原始样本中存在的蛋白质和糖类分离。在本发明的背景下可以使用本领域中已知的任何提纯方法。样本中的核酸序列可以利用体外扩增而成功地扩增，比如PCR。通常，可以将抑制聚合酶的任何化合物从该核酸中移除。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1筛选与重症肌无力相关的肠道菌群
1、研究对象和样本收集
研究在河北省石家庄市第一医院重症肌无力治疗中心收集的55例儿童重症肌无力患者和36例相应年龄、性别的健康对照(HC)。样本信息如表1所示。
诊断标准：(1)临床表现：眼睑下垂、复视、斜视；(2)新斯的明试验阳性；(3)乙酰胆碱受体抗体抗体阳性；(4)肌电图：面神经低频衰减，高频无递增。符合(1)+(2)或(3)或(4)其中一项者可以明确诊断。
分型：参照2000年美国重症肌无力协会(MGFA)提出新的临床分型与定量重症肌无力评分(QMG)标准型。
纳入标准：患者明确诊断为重症肌无力眼肌型，符合以上诊断标准。
排除标准：(1)年龄<2岁10个月或无年龄信息；(2)3个月内使用β-内酰胺类除外的抗生素；(3)服用其他治疗疾病的药物/激素；(4)使用抗炎药物或未知的中草药。
表1样本临床特征
2、DNA抽提和测序
使用DNA提取试剂盒自样本中提取DNA，操作步骤按说明书进行。采用荧光计或微量平板读取器(如Qubit Fluorometer,Invitrogen)检测DNA的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳法(琼脂糖凝胶浓度：1％V，电压：150V，电泳时间：40min)检测样品的完整性和纯度。使用Covaris随机打断基因组DNA，用磁珠筛选出平均大小为200-400bp的片段化的基因组DNA。将得到的DNA片段进行末端修复，将3’端进行腺苷酸化，并将接头连接到3’端腺苷酸化的片段的末端，然后进行PCR扩增。使用磁珠对PCR产物进行纯化。双链PCR产物进行热变形，并用夹板寡核苷酸序列进行环化，将单链环状DNA(SsCir DNA)格式化构建最终文库，并对文库质量进行质控。用phi29对文库进行扩增，得到一个分子拷贝数超过300个的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内(固定在阵列化的硅芯片上)，通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)和多重置换扩增的双末端测序法(MDA-PE)得到读长为100bp/150bp的双末端序列。
3、质量控制
对测得的数据进行质控处理，最终得到优质的数据进行后续的分析，质控步骤如下：1)过滤低质量的reads；2)去除人类基因组序列的污染，使用FastP(REF21)及其默认参数筛选出低质量的reads和序列适配序列，用Bowtie2(REF22)将reads与人类基因组(Hg38)比对，并使用Samtools筛选出不能与人类基因组比对的成对reads，作为后续分析中使用的clean reads。
4、分类注释和功能注释
使用Metlan2将高质量的reads映射到mpa_v20标记基因数据库，得到每个样本不同分类水平的分类丰度图谱。使用merge_metlan_tables.py组合所有样本的结果，并使用内部脚本获得不同物种级别的组合丰度谱表。另一方面，使用humann2将高质量的reads映射到uniref90和chocophlan，以获得基因丰度和通路丰度图谱。然后，分别使用Humann2_Join_Tables、humann2_renorm_table和humann2_Split_Strayfied_table合并所有样品的丰度，并对丰度进行标准化和进行分层分类注释。此外，使用humann2_regroup_table和humann2进行KEGG和GO富集分析。
5、统计分析
根据样本的分组情况，使用R中的Wilcox.test Two.Side函数对所有丰度结果进行差异分析。每次结果中的P值将根据BH方法进行校正，以获得q值(FDR)，用于筛选明显呈现显著性差异的物种和通路。使用Shannon指数计算每个样本的α多样性。在相同的输入下，使用参数为‘method＝dist_method’的R中Vegan包来计算β多样性。同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。
对分类图谱进行主成分分析(PCA)，使用R的Ade4软件包计算PCA的eig结果，dudi.pca函数得到不同PC的特征向量，li结果得到每个样本在PC轴上的坐标，cl得到每个PC在总方差中的贡献百分比。
为了将差异性物种与样本的临床表型联系起来，按照参数‘method＝Spearman，use＝pairwise，adjust＝BH’，采用R包中的corr.tes方法来计算特征与临床表型之间的Spearman相关性。
6、结果
基于Shannon指数的不同分类水平的α多样性和β多样性在患者和健康人群之间没有显著差异(图1)。
PCA和PcoA结果显示，患者和健康人没有显著的聚集分布(图2)。
物种差异性结果分析显示，呈现显著性差异的物种有20个，其中ROC检测AUC值>0.7的有11个，具体情况如表2所示。对20个差异菌群的联合诊断分析，结果如表3所示。其中，相比于健康对照(平均丰度为0.000749)Dialister_succinatiphilus在MG患者中显著增加(平均丰度为0.0139)，其AUC值为0.710，诊断阈值为0.000075，在最佳临界点的特异性为0.806，敏感性为0.618(图3)，分析Dialister_succinatiphilus与Sutterella_parvirubra的联合诊断效能，发现Dialister_succinatiphilus与Sutterella_parvirubra联合具有较高的诊断效能(AUC值为0.84)，说明将上述菌群单独或者联合作为检测指标能有效的区分重症肌无力患者和健康人。
表2差异菌群及AUC值
表3联合诊断AUC值
实施例2验证基因组测序的准确性
按照实施例1的方式收集重症肌无力的样本19例以及健康人的样本13例，患者信息如表4所示。
表4样本临床特征
随机选择差异菌群Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi进行测序验证，计算其应用于重症肌无力的诊断效能。
结果显示，Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi的AUC值分别为0.736842105、0.672064777、0.821862348、0.615384615，与前述检测的结果相当，说明宏基因组的测序数据准确。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.用于检测肠道菌群丰度的一种或多种试剂在制备用于预测重症肌无力的产品中的用途，其特征在于，所述肠道菌群至少包括肠道菌种Dialister succinatiphilus和Sutterella parvirubra。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包括与来自Dialister succinatiphilus和Sutterella parvirubra的菌种的靶核苷酸序列能够特异性杂交的一种或多种寡核苷酸，其中，靶核苷酸序列是菌种特异性基因区域的片段。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品还包括从样本中分离核酸的试剂。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述寡核苷酸被可检测地标记。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述寡核苷酸包括特异性识别Dialister succinatiphilus和Sutterella parvirubra的靶核苷酸序列的探针或特异性扩增Dialister succinatiphilus和Sutterella parvirubra的靶核苷酸序列的引物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述扩增是PCR或RT-PCR。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述扩增利用可检测的被标记的引物。
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| Identification of the microbial diversity after fecal microbiota transplantation therapy for chronic intractable constipation using 16s rRNA amplicon sequencing;Tadashi Ohara;《PLoS One》;20190319;第14卷(第3期);全文 * |
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