CN110358849A - 源于肠道的诊断胰腺炎的生物标志物、筛选方法及其用途 - Google Patents

源于肠道的诊断胰腺炎的生物标志物、筛选方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及源于肠道的诊断胰腺炎的生物标志物、筛选方法及其用途，所述生物标志物由uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus、unclassified_g__Eubacterium_hallii_group组成，所述生物标志物在肠道菌群中富集。通过检测所述生物标志物的丰度可有效识别出患有该病的患者，可简化胰腺炎检测和诊断步骤，极大的提高胰腺炎的诊治效率。

Description

源于肠道的诊断胰腺炎的生物标志物、筛选方法及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术、疾病诊断和生物医药领域，具体涉及源于肠道的诊断胰腺炎的生物标志物、筛选方法及其用途。
背景技术
急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是引起急性腹痛的常见疾病之一，它是由多种病因导致胰腺内的胰酶被激活，引起胰腺组织自身消化、水肿、出血，胰腺局部发生炎症反应为主要特征的疾病，病情严重者可发生全身炎性反应综征(Systemicinflammatoryresponse syndrome，SIRS)，并伴有器官功能障碍(Organ dsfunction,OD)。急性胰腺炎的临床表现多种多样，特异性低，对于不良预后的预测敏感性低于40％(SteinbergWM.Predictors of severity of acute pancreatitis[J].GastroenterolC1inN Am,1990,19(4):849-61.)，且AP发生全身炎性反应综合征的病理学基础尚未明确。由于AP病因多样、发病机制复杂、死亡率较高，急性胰腺炎的总体病死率达5％～10％，重度急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)患者病死率高达36％～50％(LankischPG,Apte M,Banks PA.Acute pancreatitis[J].Lancet,2015,386(9988):85-96)，因此尽早判断急性胰腺炎患者的严重程度，鉴别病情变化，及时对患者进行密切监测和积极治疗，对提高患者生存率和减轻经济压力等至关重要。
肠道微生物是存在于人体肠道中的微生物群落，是人体的“第二基因组”。人肠道菌群和宿主构成一个相互关联的整体，具有重要作用，包括形成微生物屏障防止病原菌定植、执行免疫调节及代谢功能。肠道微生物数量、结构及稳定性的改变，尤其是菌群的失衡会改变机体的免疫状态。研究表明肠道菌群失衡与某些疾病的发生发展息息相关，包括糖尿病、帕金森症等，然而有时肠道菌群失衡并不直接导致疾病的表达，而作为疾病标记。随着人体基因组测序完成及高通量测序技术的高速发展，基因筛查成为诊断的方向。因此通过对肠道菌群的研究筛选出与疾病相关性高的生物标志物有重要意义。一方面，利用疾病有关的生物标记物可以提供诊断疾病的方法。另一方面，通过将获得的生物标志物中的某些保护性微生物进行分离、纯化、培养和加上制成益生菌，可以用于改善并恢复肠道微生物平衡，对于疾病治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种诊断胰腺炎的生物标志物。
本发明的目的之二在于提供一种检测所述生物标志物的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种用于治疗胰腺炎的药物。
本发明的目的之四在于提供一种生产或筛选上述药物的方法。
本发明的目的之五在于提供一种能够准确有效诊断胰腺炎的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种诊断胰腺炎的生物标志物，所述生物标志物选自以下物种中的至少一个：uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus、unclassified_g__Eubacterium_hallii_group。以上物种均是在分类学上种水平的分类。
本发明提供的胰腺炎微生物标志物是发明人通过对大量胰腺炎个体和大量健康对照个体的粪便样本中的微生物的丰度的差异比较分析、以及验证，而确定下来的，明确了肠道微生物中胰腺炎相关的微生物标志物。利用所称的胰腺炎标志物，能够确定个体处于患有胰腺炎状态的概率或者处于健康状态的概率，能够用于非侵入性的早期发现或辅助检测胰腺炎。
本发明还提供了一种用于诊断胰腺炎的试剂盒，该试剂盒含有对前面所述的生物标志物进行检测的试剂。
具体地，所述试剂盒包括提取微生物基因组DNA等核酸物质的试剂，或检测所提取的DNA等核酸的试剂。
作为可选择的，所述试剂盒包括提取微生物的蛋白、菌体成分、代谢产物的试剂，或检测这些蛋白、菌体成分、代谢产物的试剂。
优选地，检测这些蛋白、菌体成分、代谢产物的试剂包括抗原、抗体、化学标记、显色或发光试剂。
利用上述试剂盒，可以确定前面所述的生物标志物在肠道菌群中的相对丰度，因此可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较。从而确定对象个体为胰腺炎个体或者为健康个体的概率，以及用于监控胰腺炎患者的治疗效果的效率。
本发明还提供了前面所述的生物标志物在制备预防或治疗胰腺炎的药物和/或在制备功能性食品中的用途。
本发明还提供了一种用于预防或治疗胰腺炎的药物或功能性食品。
本发明还提供生产或筛选上述药物或功能性食品的方法，所述方法包括筛选促使所述生物标志物的相对丰度或绝对丰度降低或升高的物质作为所述药物或功能性食品的步骤。
具体的，针对uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物能够增加uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group的丰度或含量。针对unclassified_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物能够增加unclassified_g__Eubacterium_hallii_group的丰度或含量。针对Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus设计的功能性食品或药物能够减少Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus的丰度或含量。
具体地，针对uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物包含uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group。针对unclassified_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物包含unclassified_g__Eubacterium_hallii_group。
促使uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group或unclassified_g__Eubacterium_hallii_group相对丰度或绝对丰度升高的物质作为所述药物或功能性食品。
促使Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus相对丰度或绝对丰度降低的物质作为所述药物或功能性食品。
本发明还提供了一种确定对象异常状态的方法。根据本发明的实施例，该方法包括步骤：(1)确定所述个体的粪便样本中的前面所述的生物标志物的丰度；(2)分别将步骤(1)中确定的生物标志物的丰度与其在对照组中的丰度进行比较，依据获得的比较结果确定所述个体的状态，所述对照组由一组或多组相同状态的个体的粪便样本组成，所述状态包括患有胰腺炎状态和健康状态。
本发明提出了一种利用所述生物标志物诊断胰腺炎状态或预测胰腺炎患者个体治疗疗效的系统。所述系统包括：核酸样本分离单元，所述核酸样本分离单元适于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本：测序单元，所述测序单元与所述核酸样本分离单元相连，并且适于对所分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果：以及比对装置，所述比对装置与所述测序单元相连，并且适于以这样的方式将所述测序结果与参照基因组进行比对，以便确定所述测序结果中是否存在上述生物标志物。所述比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。其中，数据处理单元用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述生物标志物的临界值；结果判定单元用于将数据处理单元得到的生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。
利用该系统，可以确定本发明的生物标志物在肠道菌群中的相对丰度。因此，可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象个体为胰腺炎个体或者为健康个体的概率，以及用于监控胰腺炎患者的治疗效果的效率。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗胰腺炎的疫苗，所述疫苗采用前面所述的生物标志物中的一种或多种制备或由所述生物标志物的蛋白、菌体成分、代谢产物的一种或多种制备，或采用现有疫苗与所述生物标志物中的一种或多种联合制备或与所述生物标志物的蛋白、菌体成分、代谢产物的一种或多种联合制备。
本发明的优势和有益效果：
本发明能够准确、有效地检测与胰腺炎相关的微生物(肠道菌群)，可以有效地预测胰腺炎以及监控胰腺炎患者的治疗效果，具有较好的临床应用前景。合理有效地应用本发明，能够更精准地为病人提供个体化治疗方案。
附图说明
图1显示利用肠道微生物诊断胰腺炎的AUC值统计图。
具体实施方式
术语解释
如本文所述的术语“丰度差异”是指与健康对照体内水平相比，在患有胰腺炎的患者体内得到更高或更低水平的微生物。
如本文所用术语“微生物”可指细菌、古细菌、真核生物(例如原生动物、真菌、酵母)和病毒，包括细菌病毒(即噬菌体)。
如本文所用术语“生物标志物”应做广义理解。其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物、属标志物)以及功能标志物((KO标志物)。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经修饰的DNA或者RNA，也可以为未经修饰的DNA从或者RNA。在本文中基因标志物有时也可以称为特征片段。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。
如本文所用的术语“诊断”是指确认病理状态的存在或者特征，而本发明的目的不仅在于确认胰腺炎的发病与否，还包括判断受试者将来患有胰腺炎的风险，以及经过胰腺炎的治疗后，对应个体是否发生复发、转移、药物反应性、耐药性等。
如本文所用的术语“诊断胰腺炎”包括诊断区分胰腺炎患者与健康人。
如本文所用的术语“治疗”可指用于获得有益的或期望的结果的方法，该结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处可意指正在被治疗的潜在疾病的根除或改善。另外，治疗性益处也能如下实现：根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理学症状，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍受到该潜在病症的折磨。预防性效果包括延缓、防止或消除疾病或病状的出现，延缓或消除疾病或病状的症状发作，减慢、终止或逆转疾病或病状的进展，或其任意组合。对于预防性益处，具有发展成特定疾病的风险的受试者或报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者可接受治疗，即使可能尚未作出该疾病的诊断。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除另外定义，本文所用的所有科技术语一般具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。一般地，本文所用的命名和实验方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术进行的所有操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求以及本文中提供的参考资料进行的。需要注意的是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的目的和由此带来的有利方面对于本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1筛选与胰腺炎相关的肠道微生物菌群
1、样本收集
采集医院确诊的胰腺炎患者和正常人的新鲜的，中后段粪便样本，立即冻存于-80℃冰箱，样本信息如表1所示。
表1样本信息
2、DNA抽提
步骤：粪便样本DNA根据MOBIODNA Isolation Kit 12888-100说明书进行操作提取。
DNA提取信息如表2所示。完成基因组DNA抽提后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。
表2 DNA提取信息
3、PCR扩增
按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。
为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1)尽可能使用低循环数扩增；2)保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。
PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；
PCR仪：ABI9700型；
全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。
4、光定量
参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
5、Miseq文库构建
1)通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；
2)使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；
3)Tris-HCl缓冲液洗脱，2％琼脂糖电泳检测；
4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。
试剂：TruSeqTM DNA Sample Prep Kit
6、Miseq测序
1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
2)以DNA片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成目标待测DNA片段；
3)变性、退火后，芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
4)PCR扩增，产生DNA簇；
5)DNA扩增子线性化成为单链。
6)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；
7)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
8)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；
9)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。
7、原始数据处理
Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。MiSeq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。
数据去杂方法和参数：
1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；
2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；
使用软件：FLASH、Trimmomatic；
8、物种注释与评估
OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，属，种、分组等)设置的统一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行聚类(cluster)。通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常对在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。
软件平台：Usearch(vsesion 7.0http://drive5.com/uparse/)
分析步骤如下：
对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)；
去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；
按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。
为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：
domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。
比对数据库如下:
16S细菌和古菌核糖体数据库：
Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)；
功能基因：
FGR，RDP整理来源于GeneBank的(Release7.3 http://fungene.cme.msu.edu/)的功能基因数据库。
软件及算法：Qiime平台(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)，RDP Classifier(version 2.2http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)，置信度阈值为0.7。
根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样本在各分类水平上的分类学比对情况。在结果中，包含了两个信息：
1)样本中含有何种微生物；
2)样本中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。
物种差异分析根据得到的群落丰度数据，运用相关的分析方法进行分析，检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析模块的内容包括：组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。本项目使用组间差异显著性检验进行差异物种的筛选。
组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异的显著性。分析可选择域、界、门、纲、目、科、属、种、OTU等不同分类水平。
1)Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)，也叫曼-惠特尼U检验(Mann–Whitney U test)，是两组独立样本非参数检验的一种方法。其原假设为两组独立样本来自的两总体分布无显著差异，通过对两组样本平均秩的研究来实现判断两总体的分布是否存在差异，该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析，并对P值进行多种方法的校正。
2)多重检验校正，即对P值进行多重检验校正方法为"fdr"。
3)双尾检验，用于指定所求置信区间的类型，选择双尾检验(求置信区间)。
4)CI计算方法，即计算置信区间的方法，方法为DP：Welch’s confidenceinverted。置信度选择：0.95。
运用DP的方法计算影响大小(effect size)，即mean1–mean2；运用Welch T检验的方法计算置信区间。软件：R的stats包和python的scipy包。
结果：
筛选标准P<0.05。中重度胰腺炎(MSAP)和正常人(NOR)的肠道微生物在种水平上存在几百个显著差异物种。其中，
uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、
Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus、
unclassified_g__Eubacterium_hallii_group的丰度情况如表3所示。
表3肠道微生物菌群丰度百分比
实施例2肠道微生物菌群的临床诊断价值
9、模型预测分析
随机森林(Random Forest)属于机器学习算法，是一个包含多棵决策树的分类器，它的分类结果根据检测样本的各个维度上的属性，在不同的决策树上进行判定，综合考虑所有判定结果后给出最终分类，对于分类问题结果取概率最大值，回归分析则取概率均值，它可以高效快速挑选出对样本分类最为重要的物种类别(biomarker)。软件：R(randomForest package)，使用随机森林，设置500个决策树，分类水平为种，进行重要性排序。对排序好的物种从重要性由大到小每次增加一个构建分类模型，计算AUC。
AUC计算结果如图1所示。由图1可知，当物种为3时，分类效果最好。这3个物种分别是uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus、unclassified_g__Eubacterium_hallii_group。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (10)

1.一种诊断胰腺炎的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自以下物种中的至少一个：uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group、Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus、unclassified_g__Eubacterium_hallii_group。
2.权利要求1所述的生物标志物在制备诊断胰腺炎的试剂盒中的应用。
3.一种诊断胰腺炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有对权利要求1所述的生物标志物进行检测的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括提取微生物基因组DNA等核酸物质的试剂，或检测所提取的DNA等核酸物质的试剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括提取微生物蛋白、菌体成分、代谢产物的试剂，或检测所述微生物蛋白、菌体成分、代谢产物的试剂。
6.一种预防或治疗胰腺炎的药物或功能性食品，其特征在于，针对uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物能够增加uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group的丰度或含量；针对unclassified_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物能够增加unclassified_g__Eubacterium_hallii_group的丰度或含量；针对Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus设计的功能性食品或药物能够减少Anaerococcus_prevotii_g__Anaerococcus的丰度或含量；
优选地，针对uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物包含uncultured_bacterium_g__Eubacterium_hallii_group；针对unclassified_g__Eubacterium_hallii_group设计的功能性食品或药物包含unclassified_g__Eubacterium_hallii_group。
7.一种利用权利要求1所述的生物标志物诊断胰腺炎状态或预测胰腺炎患者个体治疗疗效的系统，其特征在于，所述核酸样本分离装置、测序装置、比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连；优选地，所述比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。
8.权利要求1所述的生物标志物在制备权利要求6所述的药物或功能性食品中的应用。
9.一种生产或筛选预防或治疗胰腺炎的药物或功能性食品的方法，所述方法包括筛选促使所述生物标志物的相对丰度或绝对丰度降低或升高的物质作为所述药物或功能性食品的步骤。
10.一种用于预防或治疗胰腺炎的疫苗，其特征在于，所述疫苗采用权利要求1所述的生物标志物制备或由所述生物标志物的蛋白、菌体成分、代谢产物的一种或多种制备。
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