CN113151512A

CN113151512A - 利用肠道细菌检测早期肺癌

Info

Publication number: CN113151512A
Application number: CN202010075225.9A
Authority: CN
Inventors: 陈剑峰; 季红斌; 郑雅娟; 方兆元; 张箭
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: CN113151512B

Abstract

本发明提供通过检测消化道样品中的细菌来诊断肺癌的试剂、方法及其用途。

Description

利用肠道细菌检测早期肺癌

技术领域

本发明涉及利用肠道菌群预测早期肺癌的领域。

背景技术

肺癌是指肺的恶性上皮性肿瘤，起源于支气管上皮、支气管腺体、细支气管上皮和肺泡上皮。因为正常呼吸道上皮细胞类型多，在肿瘤的发生发展过程中，多能干细胞可以向不同方向分化，导致肺癌在组织学上的异质性，所以肺癌组织形态较复杂。目前国内外将肺癌分为两大类-小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。其中，临床诊断出的绝大部分肺癌属于NSCLC，而NSCLC按照组织分类可分为腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)以及大细胞癌(LCC)。

肺癌是当今世界发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤。近几十年来，其发病率随着工业发展、环境污染，以及人类生活方式改变等因素一直保持上升的趋势。虽然肺癌的诊疗技术随着科技发展已经有了显著进步，但由于缺乏早期诊断方法和敏感、特异的筛查指标，肺癌的死亡率仍然很高。早期肺癌患者手术后5年生存率可达70％以上，而中晚期肺癌患者的5年生存率仅为20％左右。因此肺癌的早期诊断及治疗是改善其预后的关键，开发早期诊断方法和敏感、无创的筛查指标是亟待解决的问题。针对肺癌诊断的方法，目前应用较多的是胸部X射线检测、低剂量螺旋CT(LDSCT)检测、支气管镜检查、血清中肿瘤标志物检测和正在兴期的分子生物标志物检测。胸部X光片是诊断肺部疾病的重要手段，通过胸片可以看到全部的胸部结构，但是由于组织之间出现互相重叠的现象致使某些区域的病变并不能清晰的显示出来，而且胸片分辨率相对较低，使得其对小病灶或是隐蔽区的病灶不够敏感，而LDSCT相对于胸部X光片有更高的分辨率，能检测出胸片无法检出的肺部小结节和早期肺癌(≤30mm)，但作为肺癌诊断的一种手段，LDSCT的成本较高，而且可能出现过度诊断的问题。统计学调查表明，CT检测出来的结节有很大一部分为良性结节，且部分患者在接收LDSCT检测之后进行了后续的有创检查而没有发现肺癌。近几年发展迅速的支气管镜技术可以提高中央及周围型肺癌的早期诊断率，但是这一技术操作复杂、花费较大，目前仍处于实验阶段，还未广泛应用于临床。

研究人员目前已发现数十种与肺癌相关的肿瘤标志物，例如标志物CEA(癌胚抗原)、CA199(糖类抗原19-9)、CA125(糖类抗原125)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、CTFRA21-1(细胞角蛋白19片段)等，但是尚未发现一种灵敏度及特异性均高的肿瘤标志物。研究人员发现只有联合使用多种标志物才可以将肺癌检测的敏感性和准确度提高到82％和91％。因此，肿瘤标记物的单项检测对肺癌的早期诊断具有一定的局限性。随着基因检测技术的发展，FHIT基因的缺失、p16基因甲基化、miRNAs表达及端粒酶等分子生物标志物的研究正在逐步被深入研究和应用，可能将肺癌的早期诊断提高到一个新的水平，但还需要在组织样本与大规模人群中验证。血清肿瘤标志物和分子生物标记物的大规模研究应用提示我们操作简单、无创是近年来肺癌早期诊断研究的热点。

大量的微生物栖息在人体肠道内，微生物种类超过1000种，其细胞数量高达10¹⁴，为机体细胞总数的10倍，共包含100多万个基因，被称为“人体的第二基因组”。肠道菌群主要包括拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)两个优势菌门。在属(Genus)水平上，拟杆菌(Bacteroid)、柔嫩梭菌(Clostridiumtende)、乳酸菌(Lactobacillus)以及双歧杆菌(Bifidobacterium)是四类与人体健康密切相关的优势菌。各类细菌在肠道内保持共生或拮抗关系，共同形成一个动态平衡的微生态系统，参与调控机体生理功能。各类细菌在肠道内保持共生或拮抗关系，共同形成一个动态平衡的微生态系统，参与调控机体生理功能。肠道菌群的主要作用包括：(1)维持肠粘膜屏障；(2)参与免疫系统的建立及免疫调节；(3)合成重要维生素；(4)通过竞争性摄取营养物质或分泌细菌素，阻止潜在致病菌在肠道定植；(5)利用低聚糖等消化碳水化合物发酵产生短链脂肪酸(short-chain fattyacids，SCFAs)，为肠粘膜细胞提供能量，并起到抗炎症、抗肿瘤等作用。近年来研究发现，肠道菌群通过其代谢产物能够直接介入宿主的代谢及重要化学物质转化过程。Bischoff于2014年提出“肠道健康(gut health)”的概念：肠道健康的人没有肠胃症状主诉，没有发生肠道疾病的危险因素以及胃肠疾病的发生。肠道健康主要包括两个重要内容，即肠道菌群健康和肠粘膜屏障健康。如果肠道菌群在丰度、多样性、稳定性等方面发生改变，称为肠道紊乱(microbial dysbiosis)。目前许多研究结果表明，多种肠内疾病(如炎症性肠病、结肠癌、伪膜性肠炎等)，肠外疾病(如皮疹、哮喘、肥胖、糖尿病、自身免疫性疾病、乳腺癌、子宫内膜癌等)均与肠道菌群紊乱相关。

人体的呼吸道与外界相通，是微生物的重要栖息地。Hilty等研究人员于2010年发现肺部存在着多种微生物群落。随后研究发现，肺囊性纤维化和哮喘患者的呼吸道特异微生物发生显著改变，表明呼吸道菌群改变可以引起肺部疾病，但是肠道菌群与肺部疾病甚至肺癌的研究还鲜有报道。

发明内容

本研究通过收集上海肺科医院96例经病理初次确诊的肺癌患者新鲜粪便，作为肺癌组；筛选年龄、性别、BMI等因素相匹配的101例健康人，收集其新鲜粪便，作为对照组。其中54例肺癌患者和71例健康人样本作为训练集(Discovery cohort)，通过16sRNA多样性测序方法分析两组之间肠道菌群的差异，从中找出特异微生物用于诊断肺癌，剩余样本作为验证集(Validation cohort)检测标志物对肺癌的预测效果。本研究从微生态学角度分析肺癌的发病因素及可能的发病机制，通过筛选特异改变的菌群集合来预测肺癌发生的几率，为肺癌的诊断、预防和治疗提供新策略。

因此，本文第一方面提供一种肺癌诊断方法，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下目中一目或多目的细菌的存在量的步骤：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。在某些实施方案中，检测来自消化道的样品中选自以下目中至少1目、至少2目、至少3目、至少4目或全部5目的细菌的存在量：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales目细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales和Lactobacillales目细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales和Bacteroidales目细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales和Clostridiales目细菌的存在量。在某些实施方案中，检测Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales目细菌的存在量。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下科中一科或多科的细菌的存在量的步骤：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales。在某些实施方案中，检测来自消化道的样品中选自以下科中至少1科、至少2科、至少3科、至少4科、至少5科、至少6科、至少7科、至少8科、至少9科或全部10科的细菌的存在量：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae和Streptococcaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae和Rikenellaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae和Ruminococcaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Bacteroidaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae和Bifidobacteriaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae和Clostridiaceae科细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae和[Odoribacteraceae]科细菌的存在量。在某些实施方案中，检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales科细菌的存在量。在某些实施方案中，所述方法还包括检测unclassified_o__Clostridiales科细菌的存在量。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下属中一属或多属的细菌的存在量的步骤：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus。在某些实施方案中，检测来自消化道的样品中选自以下科中至少1属、至少2属、至少3属、至少4属、至少5属、至少6属、至少7属、至少8属、至少9属或全部10属的细菌的存在量：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus和Faecalibacterium属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium和Bacteroides属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides和Bifidobacterium属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium和Clostridium属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium和Blautia属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia和Odoribacter属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter和Roseburia属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia和Klebsiella属细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus属细菌的存在量。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下种中一种或多种的细菌的存在量的步骤：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacteriumlongum、Blautia obeum、Roseburia faecis、Ruminococcus bromii和Bacteroidesovatus。在某些实施方案，检测来自消化道的样品中选自以下种中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种的细菌的存在量：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Blautia obeum、Roseburia faecis、Ruminococcus bromii和Bacteroides ovatus。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii和Bifidobacteriumlongum的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum和Roseburia faecis的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Roseburia faecis和Ruminococcus bromii的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacteriumprausnitzii、Bifidobacterium longum、Roseburia faecis、Ruminococcus bromii的存在量。在某些实施方案中，所述方法还包括检测Blautia obeum和Bacteroides ovatus种细菌的存在量。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下OTU中一个OTU或多个OTU的细菌的存在量的步骤：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094。在一个或多个实施方案中，检测来自消化道的样品中选自以下OTU中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25、至少26个或全部27个OTU的细菌的存在量：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094。在某些实施方案中，至少检测OTU890的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890和OTU1181的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181和OTU513的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513和OTU1175的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175和OTU952的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952和OTU163的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163和OTU1160的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160和OTU1222的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222和OTU26的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26和OTU882的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882和OTU1283的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283和OTU57的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57和OTU1285的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285和OTU932的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932和OTU312的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954的细菌的存在量。

在某些实施方案中，所述方法还包括检测来自消化道的样品中选自以下OTU中一个OTU或多个OTU的细菌的存在量的步骤：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094。在某些实施方案中，还包括检测来自消化道的样品中选自以下OTU中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或全部11个OTU的细菌的存在量的步骤：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094。在某些实施方案中，至少检测OTU479的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479和OTU236的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236和OTU1063的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063和OTU532的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532和OTU602的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602和OTU353的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353和OTU518的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518和OTU1172的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172和OTU939的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939和OTU405的细菌的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094的细菌的存在量。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取来自消化道的样品中选自以下30对OTU中的一对或多对的细菌的存在量之比：OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312、OTU954与OTU1175、OTU932与OTU1283、OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172、OTU405与OTU1181、OTU890与OTU1094。在某些实施方案中，检测来自消化道的样品中选自上述30对OTU中至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11对、至少12对、至少13对、至少14对、至少15对、至少16对、至少17对、至少18对、至少19对、至少20对、至少21对、至少22对、至少23对、至少24对、至少25对、至少26对、至少27对、至少28对、至少29对或全部30对的细菌的存在量之比。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取来自消化道的样品中选自以下11对OTU中的一对或多对的细菌的存在量之比：OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312、OTU954与OTU1175和OTU932与OTU1283。在某些实施方案中，获取来自消化道的样品中选自上述成对OTU中至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对和全部11对的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175和OTU1160与OTU163的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163和OTU26与OTU890的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890和OTU882与OTU1283的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283和OTU952与OTU1175的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175和OTU1181与OTU163的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890和OTU57与OTU1181的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181和OTU1222与OTU312的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312和OTU954与OTU1175的细菌的存在量之比。在某些实施方案中，检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312、OTU954与OTU1175和OTU932与OTU1283的细菌的存在量之比。

在某些实施方案中，所述方法还包括获取来自消化道的样品中选自以下19对OTU中的一对或多对的细菌的存在量之比：OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172、OTU405与OTU1181、OTU890与OTU1094。在某些实施方案中，获取来自消化道的样品中选自上述成对OTU中至少1对、至少2对、至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11对、至少12对、至少13对、至少14对、至少15对、至少16对、至少17对、至少18对或全部19对的细菌的存在量之比。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181和OTU952与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181和OTU163与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175和OTU1222与OTU479的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479和OTU163与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181和OTU57与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175和OTU236与OTU1063的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063和OTU890与OTU1283的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063和OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175和OTU602与OTU1063的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063和OTU353与OTU890的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890和OTU1222与OTU518的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518和OTU882与OTU1172的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181和OTU890与OTU939的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939和OTU1222与OTU163的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163和OTU163与OTU1172的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172和OTU405与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172、OTU405与OTU1181和OTU890与OTU1094的存在量。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取表3中R1-R30所示序列组的存在量之比中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、或全部30个的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括定量检测来自消化道的样品中的SEQID NO:1-27所示序列中至少1条、至少2条、至少3条、至少4条、至少5条、至少6条、至少7条、至少8条、至少9条、至少10条、至少11条、至少12条、至少13条、至少14条、至少15条、至少16条、至少17条、至少18条、至少19条、至少20条、至少21条、至少22条、至少23条、至少24条、至少25条、至少26条或全部27条的步骤。

优选地，所述方法包括获取表4各行中所示的各R1-R30在表3中所代表的存在量之比。

优选地，所述方法包括定量检测来自消化道的样品中的序列的步骤，所述序列是表4各行中所示的各R1-R30在表3中所代表的存在量之比中的序列。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括获取表3中R1-R30所示的序列含量比的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括定量检测来自消化道的样品中的SEQID NO:1-27所示序列的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取表3中R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26所示序列组的存在量之比中一个或多个或全部的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括获取表3中R1、R2、R3、R4、R6、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R19、R20、R21、R22、R23、R25、R27、R28、R29所示序列组的存在量之比中一个或多个或全部的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括定量检测来自消化道的样品中SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24所示序列中的一条或多条或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法包括定量检测来自消化道的样品中序列的步骤，所述序列是表3中R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26所示序列组的存在量之比中所用的序列中的一个或多个或与其具有至少98％序列相同性的变体。所述方法还包括定量检测来自消化道的样品中的SEQ ID NO:3、9、14、15、16、17、18、20、21、23、25、26和27所示序列中一个或多个或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取表3中R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26、R27所示序列组的存在量之比中一个或多个或全部的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括获取表3中R1、R2、R3、R4、R6、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R19、R20、R21、R22、R23、R25、R28、R29所示序列组的存在量之比中一个或多个或全部的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括定量检测来自消化道的样品中SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22、24和25所示序列中的一条或多条或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法包括定量检测来自消化道的样品中序列的步骤，所述序列是表3中R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26、R27所示序列组的存在量之比中所用的序列中的一个或多个或与其具有至少98％序列相同性的变体。所述方法还包括定量检测来自消化道的样品中的SEQ ID NO:3、9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27所示序列中一个或多个或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取表3中R2、R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26、R27、R30所示序列组的存在量之比中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或全部11个的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括获取表3中R1、R3、R4、R6、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R19、R20、R21、R22、R23、R25、R28、R29所示序列组的存在量之比中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或全部19个的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括定量检测来自消化道的样品中的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22、24和25所示序列中至少1条、至少2条、至少3条、至少4条、至少5条、至少6条、至少7条、至少8条、至少9条、至少10条、至少11条、至少12条、至少13条、至少14条、至少15条或全部16条序列或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括定量检测来自消化道的样品中的SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27所示序列中至少1条、至少2条、至少3条、至少4条、至少5条、至少6条、至少7条、至少8条、至少9条、至少10条或全部11条序列或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括获取表3中R2、R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26、R27、R30所示序列组的存在量之比的步骤。所述方法还包括获取表3中R29所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R13所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R25所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R23所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R28所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R22所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R20所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R6所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R19所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R9所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R21所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R10所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R12所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R15所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R14所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R11所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R1所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R4所示序列组的存在量之比的步骤。前述方法还包括获取表3中R3所示序列组的存在量之比的步骤。

在一个或多个实施方案中，本文的肺癌诊断方法包括定量检测来自消化道的样品中的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22、24和25所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。所述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:27或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:16或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:21或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:26或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ IDNO:23或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQID NO:9或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:20或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:18或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:17和/或15或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。前述方法还包括定量检测样品中SEQ ID NO:14或与其具有至少98％序列相同性的变体的步骤。

在一个或多个实施方案中，采用PCR扩增序列后进行定量检测。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：根据所述存在量之比获得评分，和根据评分诊断肺癌。

在一个或多个实施方案中，所述评分通过构建支持向量机(SVM)模型、随机森林模型、神经网络模型或贝叶斯方法获得。

在一个或多个实施方案中，评分中R1-R30的各比值具有权重系数。

在一个或多个实施方案中，评分根据下式计算：

评分＝1-1/(1+exp(a₀+R₁×a₁+R₂×a₂+…+R_n×a_n))

其中exp表示以e为底的指数；R₁,…,R_n为OTU对；a₀,…,a_n为权重系数；2<＝n<＝30。

在一个或多个实施方案中，权重系数通过构建支持向量机模型、随机森林模型、神经网络模型或贝叶斯方法等获取。

优选地，所述方法包括获取表3中R2、R5、R7、R8、R16、R17、R18、R24、R26、R27、R30所示序列组的存在量之比中步骤，所述评分根据下式计算：评分＝1-1/(1+exp(-2.32+R2×0.0987+R5×-0.113+R7×-0.109+R8×0.224+R16×0.122+R17×-0.124+R18×-0.0417+R24×0.145+R26×-0.323+R27×-0.0622+R30×-0.133))。

本文第二方面提供试剂，优选地，所述试剂是引物或探针。所述引物用于扩增本发明第一方面中描述的序列或片段或变体。所述探针与本发明第一方面中描述的序列或片段或变体在严谨条件下杂交。

本文还提供试剂盒，包括本发明第二方面所述的试剂和任选的PCR所需试剂，例如缓冲液、聚合酶、dNTP等。

本文还提供本发明第二方面所述的试剂和任选的SEQ ID NO:1-27中一个或多个序列在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，所述试剂用于定量检测本发明第一方面中描述的细菌或序列或片段或变体。在一个或多个实施方案中，所述SEQ ID NO:1-27中一个或多个序列是所述试剂检测的序列。

在一个或多个实施方案中，所述消化道是肠道。在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌来自肠道。在一个或多个实施方案中，来自消化道的样品是粪便。

本发明还提供消化道细菌16S rRNA或其片段和/或所述消化道细菌16S rRNA或其片段的检测试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，所述试剂盒还包括定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，所述消化道细菌是本文第一方面中描述的细菌。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下目中两目或更多目的细菌：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下科中两科或多科的细菌：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales，和任选的unclassified_o__Clostridiales。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下属中两属或多属的细菌：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus，或以下种中一种或多种的细菌：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Roseburia faecis和Ruminococcus bromii，和任选的Blautia obeum、和Bacteroides ovatus。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下OTU中一个或多个OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954，和任选的选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094。

在一个或多个实施方案中，所述16S rRNA的片段为V3和V4可变区。

在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为扩增所述16S rRNA或其片段的引物和任选的与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。

在一个或多个实施方案中，所述引物用于扩增SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22、24和25中一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体。

在一个或多个实施方案中，所述引物还用于扩增SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体。

优选地，所述引物是SEQ ID NO:28-29或与其具有至少80％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述探针与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22、24和25中一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体在严谨条件下杂交。在一个或多个实施方案中，所述探针还与SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体在严谨条件下杂交。

在一个或多个实施方案中，所述定量试剂检测消化道细菌16S rRNA或其片段的存在量；优选地，所述定量试剂为所述16S rRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。

在一个或多个实施方案中，所述16S rRNA的片段具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个的序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，

在一个或多个实施方案中，所述16S rRNA的片段具有选自SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:3所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQID NO:25所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体。

在一个或多个实施方案中，所述16S rRNA的片段具有本文第一方面中描述的序列或片段或变体。

在一个或多个实施方案中，所述消化道是肠道，优选地，所述消化道细菌来自粪便。

本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括消化道细菌16S rRNA或其片段和/或所述消化道细菌16S rRNA或其片段的检测试剂，和定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，和任选的PCR扩增所需试剂和/或定量检测所需试剂，所述消化道细菌是本文第一方面中描述的细菌。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下属中两属或多属的细菌：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus。

在一个或多个实施方案中，所述消化道细菌选自以下种中一种或多种的细菌：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Roseburia faecis和Ruminococcus bromii，和任选的Blautia obeum、和Bacteroides ovatus。

在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为扩增所述16S rRNA或其片段的引物和任选的与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。优选地，所述引物的序列如SEQID NO:28和29所示。

在一个或多个实施方案中，所述定量试剂检测消化道细菌16S rRNA或其片段。优选地，所述定量试剂为所述16S rRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。

在一个或多个实施方案中，所述16S rRNA的片段具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个的序列或与其具有至少98％序列相同性的变体。

本发明还提供核酸分子的检测试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，所述核酸分子包含消化道细菌16S rRNA的V3和V4可变区的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，所述片段至少100bp、至少150bp、或至少200bp、至少300bp、或至少400bp、或至少500bp，所述消化道细菌是本文第一方面中描述的细菌。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体。优选地，所述核酸分子具有选自SEQID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:3所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:25所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子具有本文第一方面中描述的序列或片段或变体。

在一个或多个实施方案中，所述检测试剂是扩增所述片段或变体的引物和任选的与所述片段或变体在严谨条件下杂交的探针。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括定量检测所述消化道细菌存在量的定量试剂。优选地，所述定量试剂检测所述核酸分子的存在量。更优选地，所述定量试剂为所述片段或其变体的DNA测序引物或与所述片段或其变体在严谨条件下杂交的探针。

本发明还提供核酸分子的检测试剂，所述核酸分子包含消化道细菌16S rRNA的V3和V4可变区的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，所述片段至少100bp、至少150bp、或至少200bp、至少300bp、或至少400bp、或至少500bp，所述消化道细菌是本文第一方面中描述的细菌。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体。优选地，所述核酸分子具有选自SEQID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:3所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:25所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，更优选地，所述核酸分子具有选自SEQID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的，所述核酸分子具有SEQ ID NO:3所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的，所述核酸分子具有SEQ ID NO:25所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的，所述核酸分子具有选自SEQ IDNO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括核酸分子的检测试剂，和任选的PCR扩增所需试剂，所述核酸分子包含消化道细菌16S rRNA的V3和V4可变区的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，所述片段至少100bp、至少150bp、或至少200bp、至少300bp、或至少400bp、或至少500bp，所述消化道细菌是本文第一方面中描述的细菌。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括定量检测所述核酸分子的定量试剂和任选的定量检测所需试剂。优选地，所述定量试剂为所述片段或变体的DNA测序引物或与所述片段或其变体在严谨条件下杂交的探针。

附图说明

图1：肺癌病人肠道菌群发生紊乱。A：肺癌组和健康组中平均每个样品测序得到的OTU数量；B：肠道菌群α-diversity分析，Shannon指数越高表明菌群多样性越高，Chao指数越高表明菌群丰富度越高；C：Venn图统计不同分类水平中肺癌组和健康组所有样品中所共有或独有的菌种数目，包含OTU水平、种水平、属水平和门水平。浅色和深色部分分别代表健康组和肺癌组所独有的菌种数目，中间重叠部分代表两组共有的菌种数目；D：主坐标分析(Principal Co-ordinates analysis，PCoA)图，横坐标为第一主坐标轴，纵坐标代表第二主坐标轴，百分比表示对样品差异的贡献度。使用Unweighted Unifrac、Weighted Unifrac和Bray-Curtis三种距离算法算法比较肺癌组和健康组两组间屋中的丰度分布差异程度。并且用ANOSIM分析，即相似性分析，来检验两组差异是否显著大于组内差异。

图2：Wilcox秩和检验在门、属和种三种水平对两组样本的肠道差异菌比较，图2中的菌种测序序列数，即含量，在两组之间差异p<0.05。肺癌组和健康组菌群丰度差异用箱式图表示，显示数据位置和分散情况。每组数值给出五个特征值，包括除异常值外的最小值、最大值、中位数和两个四分位数。柱状图中中间横线即每组的中位数。最小值和最大值以外的异常值用圆点表示。纵坐标用log10表示。A、肺癌组中丰度显著降低的肠道菌种；B、肺癌组中丰度显著升高的肠道菌种。

图3：基于OTU的肺癌诊断标志物。A-B：基于OTU标志物的预测效果的ROC曲线，其中支持向量机(support vector machine，SVM)模型(A)，病人区别指标(patientdiscrimination index，PDI)(B)。实线是训练集(Discovery cohort)ROC曲线，虚线是验证集(Validation cohort)ROC曲线。C：PDI在早期患者和健康对照组中的分布。

具体实施方式

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的技术方案。

本研究对96例肺癌病人和101例健康人的肠道菌群作为研究对象进行16sRNA多样性测序，其中54例肺癌样本和71例健康人样本作为训练集(Discovery cohort)筛选肺癌标志物，剩余样品作为验证集(Validation cohort)验证标志物对肺癌预测的效果。通过生物信息学和统计学分析找出OTU水平30对菌的初始集合，逐步递减至11对OTU的集合，该集合对肺癌预测的AUC＝96.4％，验证集预测AUC＝78.7％。将每种菌在肺癌和健康人组中的相对含量带入特定公式，计算PDI(patient discrimination index)指标，得出该集合的特异阈值，根据此阈值大小即可判断患有肺癌的风险。PDI预测AUC在训练集和验证集中分别是88.5％和74.8％。通过设计所述11对OTU的特异性引物，检测这11对菌的含量，得出PDI值，并结合CT结果判断肺癌发生的概率，减少良性患者诊断的创伤可能性。本发明也可作为日常普查及早发现肺癌发生的风险。

因此，本文提供一种肺癌诊断方法，所述方法包括检测来自肠道的样品中选自以下任一目的细菌的存在量的步骤：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。在某些实施方案，检测自以下这种目水平的细菌的存在量：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales和Lactobacillales的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales和Bacteroidales的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales和Clostridiales的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales的存在量。

在某些实施方案中，包括检测来自消化道的样品中选自以下任一科的细菌的存在量的步骤：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales。在某些实施方案，检测选自以下任一1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个科水平的细菌的存在量：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae和Streptococcaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae和Rikenellaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae和Ruminococcaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Bacteroidaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae和Bifidobacteriaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae和Clostridiaceae的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae和[Odoribacteraceae]的存在量。在某些实施方案中，至少检测Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales的存在量。在某些实施方案中，所述方法还检测unclassified_o__Clostridiales的存在量。

在某些实施方案中，包括检测来自消化道的样品中选自以下任一属的细菌的存在量的步骤：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus。在某些实施方案，检测选自以下任意1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个属水平的细菌的存在量：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus和Faecalibacterium的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium和Bacteroides的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides和Bifidobacterium的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium和Clostridium的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium和Blautia的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia和Odoribacter的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter和Roseburia的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia和Klebsiella的存在量。在某些实施方案中，至少检测Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus的存在量。

在某些实施方案中，包括检测来自消化道的样品中选自以下任一种的细菌的存在量的步骤：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Blautia obeum、Roseburia faecis、Ruminococcus bromii和Bacteroides ovatus。在某些实施方案，检测选自以下任意1、2、3、4、5或6个种水平的细菌的存在量：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Blautia obeum、Roseburia faecis、Ruminococcus bromii和Bacteroides ovatus。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii和Bifidobacteriumlongum的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum和Roseburia faecis的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum、Roseburia faecis和Ruminococcus bromii的存在量。在某些实施方案中，至少检测Faecalibacteriumprausnitzii、Bifidobacterium longum、Roseburia faecis、Ruminococcus bromii的存在量。在某些实施方案中，所述方法还检测Blautia obeum和Bacteroides ovatus的存在量。

在某些实施方案中，包括检测来自消化道的样品中选自以下任一种的细菌的存在量的步骤：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094。在某些实施方案，检测选自以下任意1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个OTU水平的细菌的存在量：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094。在某些实施方案中，至少检测OTU890的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890和OTU1181的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181和OTU513的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513和OTU1175的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175和OTU952的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952和OTU163的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163和OTU1160的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160和OTU1222的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222和OTU26的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26和OTU882的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882和OTU1283的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283和OTU57的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57和OTU1285的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285和OTU932的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932和OTU312的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479和OTU236的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236和OTU1063的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063和OTU532的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532和OTU602的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602和OTU353的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353和OTU518的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518和OTU1172的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172和OTU939的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939和OTU405的存在量。在某些实施方案中，至少检测OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094的存在量。

在某些实施方案中，本文提供一种肺癌诊断方法，所述方法包括检测来自肠道的样品中所选自以下任一对或多对OTU的细菌的存在量之比：OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312、OTU954与OTU1175和OTU932与OTU1283。在某些实验方案中至少检测OTU513与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175和OTU1160与OTU163的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163和OTU26与OTU890的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890和OTU882与OTU1283的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283和OTU952与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175和OTU1181与OTU163的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175和OTU1181与OTU163的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890和OTU57与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181和OTU1222与OTU312的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312和OTU954与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU513与OTU1175、OTU1160与OTU163、OTU26与OTU890、OTU882与OTU1283、OTU952与OTU1175、OTU1181与OTU163、OTU1285与OTU890、OTU57与OTU1181、OTU1222与OTU312、OTU954与OTU1175和OTU932与OTU1283的存在量。在某些实施方案中，本文提供一种肺癌诊断方法，所述方法包括检测来自消化道的样品中选自以下任一对或多对OTU的细菌的存在量之比：OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172、OTU405与OTU1181和OTU890与OTU1094。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181和OTU952与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181和OTU163与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175和OTU1222与OTU479的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479和OTU163与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181和OTU57与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175和OTU236与OTU1063的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063和OTU890与OTU1283的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063和OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175和OTU602与OTU1063的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063和OTU353与OTU890的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890和OTU1222与OTU518的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518和OTU882与OTU1172的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181和OTU890与OTU939的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939和OTU1222与OTU163的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163和OTU163与OTU1172的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172和OTU405与OTU1181的存在量。在某些实施方案中至少检测OTU890与OTU1181、OTU952与OTU1181、OTU163与OTU1175、OTU1222与OTU479、OTU163与OTU1181、OTU57与OTU1175、OTU236与OTU1063、OTU890与OTU1283、OTU532与OTU1175、OTU602与OTU1063、OTU353与OTU890、OTU1222与OTU518、OTU882与OTU1172、OTU932与OTU1181、OTU890与OTU939、OTU1222与OTU163、OTU163与OTU1172、OTU405与OTU1181和OTU890与OTU1094的存在量。

优选的是，上述所提及的各目、科、属、种或OTU的细菌各自含有下表1所对应于的特征序列。例如，Blautia属细菌可以是含有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24中任意一条序列的细菌；Bacteroides属细菌可以是含有SEQ ID NO:6、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27中任意一条序列的细菌；Bifidobacterium属细菌可以是含有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18中任意一条序列的细菌，等等。应理解的是，含有与SEQ ID NO:1-27任一序列的序列相同性在95％以上、98％以上、99％以上的序列的菌也包括在本文所述的范围内，只要该菌确实能在人体肠道中检出和/或属于人体肠道菌群。此外，应理解的是，表1所列的目、科、属和种是以所示特征序列在Greengene数据库获得的相应分类和名称。当以所示序列在其它数据库(SILVA和NCBI)中进行检索和比对时，会得到不同分类和名称的细菌(表2)，但只要该细菌含有本文所述的特征序列或含有与本文所述特征序列的序列95％以上、98％以上、99％以上的序列，该细菌仍包括在本文的范围之内，可用于本文的肺癌诊断。OTU以及特征序列分组如表3所示。

表1，OTU及其特征序列在Greengene数据库中比对出的种、属、科和目水平的名称

表2,OTU及其特征序列在NCBI和Silva数据库中比对出的种、属、科、目、纲、门和界水平的名称

表3 OTU以及特征序列分组

表4示例性的OTU比值组合

*各R1-R30如表3所示

可采用本领域周知的方法检测某种感兴趣的细菌的存在及其量。例如，可检测本文披露的特征序列(如表1所示)，通过该特征序列的存在及含量表征细菌的存在及含量。应理解的是，当检测到的序列与前述SEQ ID NO:1-27序列中的任意一条序列具有95％以上、98％以上、99％以上的序列相同性时，可认为检测本文所述的特征序列，即检测感兴趣的细菌，并可用于肺癌诊断。

可采用本领域周知的工具计算两条序列之间的序列相同性，例如可采用NCBI上提供的序列比对软件以默认参数进行比对。本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(A与G)的互换，嘧啶核苷酸之间的(T或U与C)的互换。因此，在本发明多核苷酸中的一个或多个保守性取代将不会在实质上影响其活性。

可采用本领域周知的方法检测序列或其片段或变体的存在及含量。例如，可通过PCR法、DNA测序、探针法等检测序列的存在，也可以用这些方法检测序列的含量。本领域知晓这些方法中所需的特异性试剂以及其他试剂。例如，PCR法需要特异性引物以及其他试剂包括dNTP、缓冲液、聚合酶等；DNA测序法需要特异性引物以及其他试剂包括缓冲液、聚合酶、以及视测序原理而用的dNTP、探针、纳米孔蛋白、ddNTP等；探针法需要特异性探针以及其他试剂包括缓冲液等。本文的检测方法往往涉及引物。本文中，待扩增序列为细菌16srRNA或其片段或16s rRNA的V3和V4区的片段时，引物可识别待扩增序列的两端位于待扩增序列之外的序列，也可以是识别待扩增序列内的任意序列的引物，只要扩增出的序列可以检测感兴趣的细菌的存在及其量即可。本文的检测方法还可能涉及探针。本文的探针可识别待扩增序列内的任意序列，只要该任意序列可以检测感兴趣的细菌的存在及其量即可。

本发明还提供消化道细菌16S rRNA或其片段和/或所述消化道细菌16S rRNA或其片段的检测试剂或定量试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，以及，核酸分子的检测试剂或定量试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途。本文所述“制备”表示使用16SrRNA或片段或所述试剂直接制造、产生试剂盒中的内容物的过程，或者利用16S rRNA或片段或所述试剂的序列信息和/或特征制造、产生试剂盒的内容物的过程。

本文中，来自消化道的样品通常为粪便。可采用通用引物进行检测。通用引物通常用于扩增细菌16S rRNA。示例性的通用引物可如表5(SEQ ID 28和SEQ ID 29)所示。获得通用引物后，可采用常规的方法进行PCR扩增，以及PCR产物纯化、定量和均一化。例如，可采用TransStart Fastpfu DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物。PCR产物可采用常规的方法或设备进行定量，然后按照测序量要求进行相应比例的混合。可采用常规的手段进行测序，例如可使用常规的试剂盒对PCR产物进行测序前准备，并构建Miseq文库，之后进行Miseq测序。获得测序数据后，对所得数据进行优化与统计。例如，首先根据Paired-End reads(PE序列数)之间的重叠关系，应用Flash软件进行将成对的读数(reads)拼接(merge)成一条序列，同时使用QIIME(Quantitiative Insights IntoMicrobial Ecology)软件包(version l.9.1)对读数的质量和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，从而获得感兴趣序列及其含量。之后对序列的含量进行数据处理，例如采用PDI(patientdiscrimination index)。本领域知晓通过构建支持向量机(SVM)模型、随机森林模型、神经网络模型或贝叶斯方法等获得PDI公式过程。本发明使用支持向量机(SVM)模型构建的PDI公式如下：

评分＝1-1/(1+exp(a₀+R₁×a₁+R₂×a₂+…+R_n×a_n))

示例性地，针对11对候选标志物的公式如下：PDI_OTU＝1-1/(1+exp(-2.32+R2×0.0987+R5×-0.113+R7×-0.109+R8×0.224+R16×0.122+R17×-0.124+R18×-0.0417+R24×0.145+R26×-0.323+R27×-0.0622+R30×-0.133))。将11对OTU含量之比代入上面公式得到PDI值。根据此值，得到阈值c＝0.4，当PDI≥c判断为肺癌病人，PDI<c则认为是健康人。

应理解，当采用通用引物测序时，对于将检测的每一种菌，检测表1所列的对应序列，计算表3所示的比值后，代入上述式计算PDI值。例如当涉及上式中的11对OTU时，检测这些OTU在表1中所列的对应序列，计算比值后代入上述式计算PDI值。

在某些实施方案中，本文使用特异性引物进行检测。例如，可选择表1中感兴趣的检测菌株中感兴趣的特征序列，针对该特征序列设计特异性引物，利用这些特异性引物实施Real-time PCR定量检测特征序列的含量，并计算相应的PDI，从而对对象是否患有肺癌进行诊断。对于这类方法，通常先从样品(如粪便)中提取细菌全基因组，然后进行Real-time PCR，进行定量检测。

实施例

一、实验材料和方法

1、临床粪便标本的收集

2016年3月至2017年10月共收集上海市肺科医院住院患者96例肺癌患者，所有患者均经细胞和病理学确诊；正常对照组来自上海市第十人民医院体检科体检的101例健康人，所有正常对照组人群均未发现肺部或者其他器官的恶性肿瘤。

上述样本中54例肺癌和71例健康人样本作为训练集，用于筛选肺癌标志物；剩余42例肺癌样本和30例健康人样本混合作为测试集，用于验证标志物预测肺癌的效果。

所有入试者的粪便采集依照自愿原则，均签署知情同意书。排除近期行抗生素及益生菌制剂治疗者，肺癌组、肺部良性肺癌组与健康对照组收集鲜粪便标本各一份，用无菌棉签挑取新鲜粪便放入无菌管后立即放入-80℃超低温冰箱中保存。

2、实验仪器及实验试剂

2.1实验仪器

2.2实验试剂

2.2.1提取粪便标本试剂盒

stool DNA kit：Omega Biotck公司，美国；

无水乙醇：上海振兴化工一厂，上海。

2.2.2琼脂糖凝胶电泳试剂：

1×TAE Buffer：TaKaRa，中国；

琼脂糖(Biowest Agarose G-10)：Biowest，西班牙；

D2000 DNA Marker：天根生化科技有限公司，中国；

Tanon^TM核酸染料：上海天能科技有限公司，中国。

2.2.3PCR扩增及纯化试剂：

Fastpfu DNA Polymerase：北京全式金生物科技有限公司，中国；

三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)：TaKaRa，中国；

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒：Axygen公司，美国。

2.2.4PCR产物定量及文库构建试剂：

QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统：Promega，美国；

建库试剂盒TruSeq DNA LT Sample Prep K：Illumina公司，美国。

3、实验方法

3.1粪便标本DNA提取

提取方法依照试剂盒(

stool DNA kit)说明书操作如下：

(1)冰上制冷，刮取50-100mg样品加入至2ml提前装入200mg玻璃珠的离心管。

(2)样品融化之前迅速加300μL SP1缓冲液，10μL蛋白酶K溶液到离心管中，至少5min最大速度震荡使样品完全溶解。

(3)70℃水浴13min，期间涡旋震荡两次。

(4)90℃水浴5min，期间涡旋震荡一次。

(5)冰上静置2min，加100μL SP2缓冲液，涡旋震荡30秒使样品混匀充分。

(6)冰上静置5min，13000g离心5min使粪便彻底沉淀。

(7)避开杂质，仔细吸取上表层1.5ml至新离心管中。

(8)离心管中加入200μL HTR，移液器反复抽吸混匀，涡旋震荡10秒。

(9)室温静置2min，13000g离心2min，使杂质吸收HTR成颗粒状。

(10)2ml新离心管中移取250μL上清液，同时加入250μL BL缓冲液和250μL无水乙醇，涡旋震荡10秒充分混合样品。

(11)将所得整体样本，加到

DNA离心管柱并套上2ml收集管，13000g室温状态下离心1min后弃掉液体和收集管。

(12)重新安装进新的收集管，加入500μL HB缓冲液后13000g高速离心1min后弃掉液体和收集管。

(13)再次安装进新的收集管中，加入750μL用无水乙醇稀释过的DNA洗涤缓冲液后13000g离心1min后弃掉液体，将离心管再重新插入新收集管。

(14)13000g室温高速离心2min，是柱子干燥。

(15)再将离心管套入新的1.5ml收集管中，200μL的洗脱缓冲液(已预热至60-70℃)加入离心管中，静置2min后13000g离心2min，所得即样品的基因组DNA，然后利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，提取的DNA立即保存于-80℃超低温冰箱。

3.2 PCR扩增及纯化

(1)按指定测序区域(细菌16s V3-V4可变区)，合成带有barcode的特异引物，设计如表5所示：

表5：细菌16S rRNA V3-V4可变区引物设计

(2)PCR高保真酶采用TransStart Fastpfu DNA聚合酶，反应体系如下：5×Fastpfu缓冲液，4μL；2.5mM dNTPs，2μL；正向引物(5μM)，0.8μL；反向引物(5μM)，0.8μL；Fastpfu聚合酶，0.4μL；模板DNA，10ng；补ddH₂O至20(5μM))μL。

(3)PCR反应参数如下：预变性95℃5min，变性95℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃45sec(共27个循环)，最后延伸72℃10min，保存在10℃下。

(4)各样本重复3次PCR，将同一样本的产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPreDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris HCl洗脱，2％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.3 PCR产物定量和均一化

质检合格后，对PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量，然后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

3.4 Miseq文库构建

按照操作样品制备试剂盒(IlluminaTruseq TM DNA)说明书操作，对PCR产物进行测序前准备，并使用TruSeq DNA LT Sample Prep K试剂盒建库。制备文库过程概括如下：

(1)连接“Y”字形接头；

(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；

(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；

(4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

3.5 Miseq测序

建库后在Illumina Miseq平台对PCR产物进行双端测序。测序过程概括如下：

(1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；

(2)另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；

(3)PCR扩增，产生DNA簇；

(4)DNA扩增子线性化成为单链；

(5)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；

(6)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；

(7)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸；

(8)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

4、生物信息学分析

4.1数据优化与统计

Miseq测序得到的是双端序列数据，首先根据Paired-End reads(PE序列数)之间的重叠关系，应用Flash软件进行将成对的读数(reads)拼接(merge)成一条序列，同时使用QIIME(Quantitiative Insights Into Microbial Ecology)软件包(version l.9.1)对读数的质量和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向。

数据去杂方法和参数：

(1)过滤读数尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的读数；

(2)根据PE读数之间的重叠关系，将成对读数拼接成一条序列，最小重叠长度为10bp；

(3)拼接序列的重叠区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；

(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

使用软件：FLASH、QIIME。

4.2 OTU聚类

OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一分类单元(品系，属，种，分组等)设置的同一标志。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作(cluster)。利用Usearch软件平台使用软件Usearch(version7.1 http://driver5.com/uparse/)对所有序列进行归类操作，将相似度大于97％序列聚类为一个OTU，并参照Uparse官方网站提供的最新版本(SSUII5)对OTU进行过滤。

分析步骤如下：

(1)对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)；

(2)去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)；

(3)按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列；

(4)将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97％以上的序列，生成OTU表格。

4.3分类学分析(Taxonomy)

为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平：domin(域)，kingdom(界)，phulum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。16s细菌核糖体数据库如下：

Silva(Release123 http://www.arb-silva.de)；

Greengene(Release 13.5http://greengenes.secondgenome.com/)。

使用软件及算法：Qiime平台(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)、RDP Classifer(version2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)

本研究采用Greengene数据库进行分类学分析，设置信度阈值为0.7，即每段序列在数据库中会比对100次，重复出现次数大于70次的即认为是该物种。分类学数据库中会出现一些分类学谱系中的中间等级没有科学名称，以norank作为标记。分类学比对后根据置信度阈值的筛选，会有些分类谱系低于置信阈值，没有得到分类信息，在统计时以Unclassified作为没有分类信息的标记。

4.4多样性指数分析(α-diversity)

群落生态学中研究微生物多样性，通过单样本的多样性分析(α-diversity)可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。

计算菌群丰度(Community richness)的指数有：

Chao-the Chao1 estimator(http://www.mothur.org/wiki/Chao)；

Ace-the ACE estimator(http://www.mothur.org/wiki/Ace)；

计算菌群多样性(Community diversity)的指数有：

Shannon-the Shannon index(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)；

Simpson-the Simpson index(http://www/mothur.org/wiki/Simpson)；

计算测序深度指数有：

Coverage-the Good’s coverage(http://www.mothur.org/wiki/Coverage)。

使用的分析软件：mothur(version v.1.30.1http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)指数分析，用于指数评估的OTU相似水平97％。

4.5物种组成分析

Venn图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的物种(如OTU)数目，可以比较直观的表现环境样本的物种(如OTU)数目组成相似性及重叠情况。通常情况下，分析时选用相似水平为97％的OTU或其他分类学水平的样本表。

使用的软件：R语言工具统计和作图。

4.6样品比较分析(β-diversity)

比较微生物群落在不同样品中的构成差异。其中主坐标分析(Principal Co-ordinates analysis，PCoA)是一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究本群落组成的相似性或差异性。PCoA分析，首先对一系列特征值和特征向量进行排序，然后选择排在前几位的最主要特征值，通过不同的距离算法得到相应的距离值，将其表现在坐标系里，如果样品成分越相似，则映射在PCoA图中的距离越近。常见的距离算法有Bray-Curtis和UniFrac两种。UniFrac的算法需要各个物种分类单元(如OTU、属等)的系统进化树，通过计算进化树各物种的系统发育进化关系，从而计算样本间距离，其中unweighted UniFrac距离算法没有计入不同环境样本的序列相对丰度，而weighted UniFrac算法在计算树枝长度时将序列的丰度信息进行加权计算，因此unweighted UniFrac可以检测样本间变化的存在，而weighted UniFrac可以更进一步定量的检测样本间不同谱系上发生的变异。Bray-Curtis距离算法主要基于独立的物种分类单元(如OTU、属等)进行计算，不考虑各物种之间的进化关系或关联信息。Bray-Curtis算法采用加权的计算方法，同时考虑物种有无和物种丰度。

使用的分析软件：R语言PCoA统计分析和作图、R语言作图，使用FastTree(version2.1.3http://www.microbesonline.org/fasttree/)根据最大似然法构建进化树，然后利用FastUniFrac(http://UniFrac.colorado.edu/)分析得到样本间距离矩阵。

4.7组间群落差异性分析

组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中标出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异的显著性。分析可选择域(Domain)、界(Kingdom)、门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)、OTU等不同分类水平。本研究在Species(属)水平观测肺癌组和健康人组之间丰富度差异的物种。并通过Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sumtest)对两组样本的物种进行差异分析，找出在两组之间存在显著性差异的物种。

使用的软件：R的stats包和python的scipy包。

4.8 Voom算法

Voom算法是Limma分析软件里面较新的一种算法，可用于高通量测序数据的差异分析。分析测序数据时先将每个species水平的所有reads数用logCPM(log2-counts permillion)表示，然后对mean-variance关系建模，建模方式采用精确权重法(precisionweights)也就是“voom”，获得这一species的相对含量，为后续筛选肿瘤标志物做准备。

4.9最大相关最小冗余(minimum-redundancy maximum-relevancy，mRMR)算法

在筛选肺癌标志物过程中，为了找出与肺癌和健康状态相关的特征菌种，首先需要对初始特征集合进行搜索。为了提高筛选的精度和泛化性能，我们采用最小冗余最大相关mRMR算法，在找出相关菌种的同时，又尽可能多地降低了冗余性。

4.10支持向量机(support vector machine，SVM)模型

本研究使用支持向量机算法来判断初始筛选的肺癌肠道菌群标志物集合对肺癌预测的效果。我们采用的评价指标包括：敏感度(sensitivity)和特异度(sepecificity)，通过对初始集合进行逐步优化，使得各评价指标的综合表现最佳。

4.11 PDI(patient discrimination index)分析

为了将筛选到的菌群标志物应用到临床，我们构建了临床指标PDI，该指标与之前提出的PDI部分相关(PMID:25079328)，但是重要的区别是，每个标志物都有一个权重，可以通过逻辑回归来评估。计算OTU的PDI公式如下：

PDI_OTU＝1-1/(1+exp(-2.32+

OTU513:s__norank_f__Rikenellaceae/OTU1175:s__Faecalibacteriumprausnitzii×0.0987+OTU1160:s__Bididobacteriumlongum/OTU163:s__norank_g__Bacteroides×-0.113+OTU26:s__norank_f__Ruminococcaceae/OTU890:s__norank_f__Enterobacteriaceae×-0.109+OTU882:s__norank_g__Odoribacter/OTU1283:s__Roseburia faecis×0.224+OTU952:s__norank_f__Lachnospiraceae/OTU1175:s__Faecalibacteriumprausnitzii×0.122+OTU1181:s__norank_g__Streptococcus/OTU163:s__norank_g__Bacteroides×-0.124+OTU1285:s__Ruminococcusbromii/OTU890:s__norank_f__Enterobacteriaceae×-0.0417+OTU57:s__norank_g__Klebsiella/OTU1181:s__norank_g__Streptococcus×0.145+OTU1222:s__norank_g__Clostridium/OTU312:s__norank_g__Blautia×-0.323+OTU954:s__norank_o__Clostridiales/OTU1175:s__Faecalibacterium prausnitzii×-0.0622+OTU932:s__norank_g__Bacteroides/OTU1283:s__Roseburia faecis×-0.133))

11对OTU含量之比代入上面公式得到的PDI值。根据此值，我们得到阈值c＝0.4，当PDI≥c判断为肺癌病人，PDI<c则认为是健康人。exp(exponential)表示以e为底的指数。

4.12 ROC(receiver operating characteristic curve)曲线

ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，通过构图法揭示敏感性和特异性的相互关系。ROC曲线将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、特异性为横坐标绘制成曲线，曲线下面积(operatingcharacteristic curve，AUC)越大，诊断准确性越高。

5.统计学方法

正态分布计算资料以中位数(范围)和平均数±标准差表示，使用SPSS20.0软件进行unpaired t-test检验和Fisher’s exact test进行分析，P<0.05定义为差异有统计学意义。

二、实验结果

1.临床样品信息统计

训练集的54肺癌病人和71例健康人临床信息汇总于表6。如表6所示，肺癌病人与健康人的平均年龄和身体质量指数(BMI)之间没有显著差异，健康人的性别分布中，女性比男性数目略多。此次收集的肺癌样品主要是肺癌早期阶段的样品，在训练集中，原位腺癌(作为0期)14.81％、Ⅰ期77.78％、Ⅱ期7.41％，肺癌类型均为非小细胞肺癌，其中腺癌(ADC)90.74％、鳞癌(SCC)5.56％和大细胞肺癌(LCC)3.70％，不同类型的癌症比例符合近十年人口统计学和肺癌临床诊断数据。54例肺癌病人中，94.44％的病理未发生癌症转移。肺癌分类信息统计可以看出训练集中均为早期肺癌样品，这样的分析结果可以为临床应用提供更高的价值。

表6：训练集研究样本的基本信息

注：Unpaired t-test用于比较肺癌组和健康人组的年龄和BMI；Fisher’s exacttest用于比较两组的性别分布。N/A，not applicable，表示不适用。

2.肠道菌群多样性分析

Illumina MiSeq测序后，通过比对，我们在Greengrene数据库中得到大约6百万个序列。菌群的信息用最小分类单元OTU表示，将相似度大于97％的序列认为是同一个物种(species)。

图1结果显示，健康组和肺癌组平均每个样品得到的OTU数分别是292.6和265.8，肺癌组测到的OTU显著少于健康组(图1，A)。通过α-diversity分析，用Shannon和Chao两个指数分别代表群落多样性和丰富度，Shannon指数两组之间没有显著差异，而在Chao指数中，肺癌组显著降低，表明肺癌病人肠道菌群丰富度降低(图1，B)。分别在OTU、种(Species)、属(Genus)、门(Phylum)不同水平上进一步研究两组样品分布情况，Venn图显示，在四种分类水平上，健康组和肺癌组都各自有其独特的肠道菌群(图1，C)，表明与健康人相比，肺癌病人肠道菌群已经发生显著变化，有些菌消失，但又有新的菌出现。从主坐标分析(Principal Co-ordinates analysis，PCoA)图中可以看出Unweighted Unifrac、Weighted Unifrac和Bray-Curtis三种距离算法算法可以将两组样品在横轴PC1上明显分离区分，ANOSIM分析，即相似性分析显示，肺癌组和健康组之间的差异P<0.05(图1，D)，表明肺癌病人肠道菌群发生了显著变化，表明肺癌的发生已经伴随肠道菌群发生紊乱。

3.肠道菌群差异性分析

利用Wilcox秩和检验在不同水平对两组样品进行了菌群差异的比较。结果显示在图2中。

图2显示，在门水平，有4种菌在肺癌组中降低，而3种菌在肺癌组中显著增加；在属水平，有31种菌在肺癌组中降低，13种菌增加；在种水平，有41种菌在肺癌组中降低，而15种菌在肺癌组中显著增加。门水平中丰度最高的几种菌例如，Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes和Proteobacteria这四种菌的丰度在肺癌病人样品中都发生了显著的变化。肺癌病人种水平显著增加的17种菌主要来自Bacterioides和Parabacteroides，而Firmicutes和Actinobacteria两个门主要产生短链脂肪酸，具有抑炎抗肿瘤的功效，却在肺癌病人中显著减少。这些结果表明，跟健康人相比，肺癌病人肠道内菌群已经紊乱，某些菌的变化直接或者间接作用影响肺癌的进程。

4.肠道菌群标志物预测早期肺癌病人

由于早期肺癌诊断较难，一般诊断确诊的病人都已经到中晚期，癌细胞已经转移到远端器官，直接影响病人的存活率，为了尽早发现病灶以及对病灶准确定性，以免延误早期肺癌的治疗和避免肺内良性结节的过度诊断而实施不必要手术，我们使用生物信息学方法进行初始特征集合的搜索。具体操作方法如下：首先根据所有检测到的OTU含量，筛选出在肺癌和健康组中含量最高的13种OTU作为内参(表7)，然后将所有剩余的OTU跟内参OTU含量去比较(当然内参OTU之间也可以比较)，得出其相对对数变化值(Relative logarithmicchanges，RLCs)。当该OTU的RLCs在肺癌组和健康组两组中存在显著差异时，将其当作候选标志物。根据mRMR方法，本发明人一共筛选到了30对OTU的初始集合(表3)。使用这30对OTU初始集合训练一个初始支持向量机(SVM)模型来预测疾病状态。为了满足临床应用的需求，我们选择逐渐降低初始特征集合的菌种数目，筛选出种类更少、假阳性率更低的菌种集合。结果如表8所示，申请人对2对至30对OTU的组合均进行了研究，发现10对以上的OTU组合均可以实现预测肺癌的效果。其中11对OTU(表3中的第R2、R5、R7、R8、R16-18、R24、R26、R27和R30)的集合对于预测肺癌的效果最优(AUC＝96.4％)(图3，A)，并且用验证集验证其有效性AUC＝78.7％(图3，A)。为了进一步满足肺癌病人临床诊断的可操作性，对这11对OTU标志物都加上一个权重，然后通过逻辑回归来评估，汇总成该集合的PDI指数，PDI在训练集和验证集中的AUC分别为88.5％和74.8％(图3，B)。并且得到相应的阈值c＝0.4，PDI≥0.4判断为肺癌患者，PDI<0.4则认为是健康人(图3，C)。PDI是菌种含量在肺癌病人对健康人中的变化方向，相加得到的单一指标数值，PDI值越大，患有肺癌的可能性就越高。

表7，内参OTU及其种水平名称

内参OTU ID	种水平名字
		OTU 890	s_norank_f__Enterobacteriaceae(SEQ ID NO:1)
OTU1181	s_norank_g__Streptococcus(SEQ ID NO:2)
		OTU513	s_norank_f__Rikenellaceae(SEQ ID NO:3)
OTU1175	s_Faecalibacterium prausnitzii(SEQ ID NO:4)
		OTU952	s_norank_f__Lachnospiraceae(SEQ ID NO:5)
OTU163	s_norank_g__Bacteroides(SEQ ID NO:6)
		OTU1160	s_Bifidobacterium longum(SEQ ID NO:7)
OTU1222	s_norank_g__Clostridium(SEQ ID NO:8)
		OTU26	s_norank_f__Ruminococcaceae(SEQ ID NO:10)
OTU882	s_norank_g__Odoribacter(SEQ ID NO:11)
		OTU1283	s_Rosebruia faecis(SEQ ID NO:12)
OTU57	s_norank_g__Klebsiella(SEQ ID NO:13)
		OTU1285	s_Ruminococcus bromii(SEQ ID NO:19)
OTU932	s_norank_g__Bacteroides(SEQ ID NO:22)
		OTU312	s_norank_g__Blautia(SEQ ID NO:24)
OTU954	s_norank_o__Clostridiales(SEQ ID NO:25)

表8

总之，我们通过提取人体肠道菌群，对16S的可变区进行测序，使用Greengene微生物16S数据库，确定微生物的物种组成和相对含量，然后找出能够较好反映健康和疾病状况的11对微生物，并以其相对含量作为肺癌的预测指标。该方法具有较高的敏感性和特异性，通过与CT等诊断手段进行组合可以是一个很好的无创筛查策略。

在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域研究人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书写限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 利用肠道细菌检测早期肺癌

<130> 181087

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag 60

gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcggg gaggaaggga gtaaagttaa tacctttgct 120

cattgacgtt acccgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 180

ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggtttgttaa 240

gtcagatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat ctgatactgg caagcttgag 300

tctcgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 360

taccggtggc gaaggcggcc ccctggacga agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg 420

agcaaacagg attagaaacc ctagtagtcc 450

<210> 2

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtagggaatc ttcggcaatg ggggcaaccc tgaccgagca acgccgcgtg agtgaagaag 60

gttttcggat cgtaaagctc tgttgtaagt caagaacgag tgtgagagtg gaaagttcac 120

actgtgacgg tagcttacca gaaagggacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 180

cgtaggtccc gagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttgata 240

agtctgaagt taaaggctgt ggctcaacca tagttcgctt tggaaactgt caaacttgag 300

tgcagaaggg gagagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaggaa 360

caccggtggc gaaagcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcgtgggg 420

agcgaacagg attagaaacc ctagtagtcc 450

<210> 3

<211> 445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtgaggaata ttggtcaatg gacgcaagtc tgaaccagcc atgccgcgtg caggatgacg 60

gctctatgag ttgtaaactg cttttgtacg agggtaaacg cagatacgtg tatctgtctg 120

aaagtatcgt acgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

attcaagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggtgcg taggcggttt gataagttag 240

aggtgaaatt tcggggctca accctgaacg tgcctctaat actgttgagc tagagagtag 300

ttgcggtagg cggaatgtat ggtgtagcgg tgaaatgctt agagatcata cagaacaccg 360

attgcgaagg cagcttacca aactatatct gacgttgagg cacgaaagcg tggggagcaa 420

acaggattag aaaccctagt agtcc 445

<210> 4

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gtgaggaata ttggtcaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag 60

gtcttcggat tgtaaactcc tgttgttgag gaagataatg acggtactca acaaggaagt 120

gacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aaaacgtagg tcacaagcgt tgtccggaat 180

tactgggtgt aaagggagcg caggcgggaa gacaagttgg aagtgaaatc catgggctca 240

acccatgaac tgctttcaaa actgtttttc ttgagtagtg cagaggtagg cggaattccc 300

ggtgtagcgg tggaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg 360

ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 5

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agtgaagaag 60

tatctcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagaaaatg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg cagacggcga tgcaagtctg gagtgaaagc ccggggctca 240

accccgggac tgctttggaa actgtatggc tagagtgctg gagaggcaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aagaacacca gtggcgaagg cggcttgctg 360

gacagtaact gacgttcagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 6

<211> 445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gtgaggaata ttggtcaatg ggcgagagcc tgaaccagcc aagtagcgtg aaggatgact 60

gccctatggg ttgtaaactt cttttataaa ggaataaagt cgggtatgga tacccgtttg 120

catgtacttt atgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggagcg tagatggatg tttaagtcag 240

ttgtgaaagt ttgcggctca accgtaaaat tgcagttgat actggatatc ttgagtgcag 300

ttgaggcagg cggaattcgt ggtgtagcgg tgaaatgctt agatatcacg aagaactccg 360

attgcgaagg cagcctgcta agctgcaact gacattgagg ctcgaaagtg tgggtatcaa 420

acaggattag aaaccctagt agtcc 445

<210> 7

<211> 430

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatggag 60

gccttcgggt tgtaaacctc ttttatcggg gagcaagcga gagtgagttt acccgttgaa 120

taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca agcgttatcc 180

ggaattattg ggcgtaaagg gctcgtaggc ggttcgtcgc gtccggtgtg aaagtccatc 240

gcttaacggt ggatccgcgc cgggtacggg cgggcttgag tgcggtaggg gagactggaa 300

ttcccggtgt aacggtggaa tgtgtagata tcgggaagaa caccaatggc gaaggcaggt 360

ctctgggccg ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagaaacc 420

ctagtagtcc 430

<210> 8

<211> 428

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtggggaata ttgcgcaatg ggggcaaccc tgacgcagca acgccgcgtg caggaagaag 60

gtcttcggat tgtaaactgt tgtcgcaagg gaagaagaca gtgacggtac cttgtgagaa 120

agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtgacaag cgttgtccgg 180

atttactggg tgtaaagggc gcgtaggcgg actgtcaagt cagtcgtgaa ataccggggc 240

ttaaccccgg ggctgcgatt gaaactgaca gccttgagta tcggagagga aagcggaatt 300

cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt 360

ctggacgaca actgacgctg aggcgcgaaa gtgtggggag caaacaggat tagaaaccct 420

agtagtcc 428

<210> 9

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg aaggaagaag 60

tatctcggta tgtaaacttc tatcagcagg gaagatagtg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggact ggcaagtctg atgtgaaagg cgggggctca 240

acccctggac tgcattggaa actgttagtc ttgagtgccg gagaggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacggtaact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 10

<211> 426

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagca acgccgcgtg aaggaagacg 60

gttttcggat tgtaaacttc tgttcttagt gaagaataat gacggtagct aaggagcaag 120

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 180

ttactgggtg taaagggagc gtaggcggga tgccaagtca gctgtgaaaa ctatgggctt 240

aacctgtaga ctgcagttga aactggtatt cttgagtgaa gtagaggttg gcggaattcc 300

gagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattcg gaggaacacc ggtggcgaag gcggccaact 360

gggctttaac tgacgctgag gctcgaaagt gtggggagca aacaggatta gaaaccctag 420

tagtcc 426

<210> 11

<211> 444

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gtgaggaata ttggtcaatg gacgtaagtc tgaaccagcc aagtcgcgtg agggaagact 60

gccctatggg ttgtaaacct cttttataag ggaagaataa gttctacgtg tagaatgatg 120

cctgtacctt atgaataagc atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atgcgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggtgcg taggcggttt attaagttag 240

tggttaaata tttgagctaa actcaattgt gccattaata ctggtaaact ggagtacaga 300

cgaggtaggc ggaataagtt aagtagcggt gaaatgcata gatataactt agaactccga 360

tagcgaaggc agcttaccag actgtaactg acgctgatgc acgagagcgt gggtagcgaa 420

caggattaga aaccctagta gtcc 444

<210> 12

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agcgaagaag 60

tatttcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagataatg acggtacctg actaagaagc 120

accggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg gtgcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg caggcggtgc ggcaagtctg atgtgaaagc ccggggctca 240

accccggtac tgcattggaa actgtcgtac tagagtgtcg gaggggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacgataact gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 13

<211> 427

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gtggggaatc ttgcgcaatg ggggaaaccc tgacgcagcg acgccgcgtg cgggatggag 60

gccttcgggc cgtgaaccgc tttcagcagg gaagacatta aggacggtac ctgcagaaga 120

agccccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggggcgag cgttatccgg 180

attcattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg cgcaccaggc gggatctcga aaccgggggc 240

tcaacctccg ggcggatccc gaaccggtgt gctcgagtgc ggtagaggaa gtcggaattc 300

ccggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatcg ggaagaacac cgatggcgaa ggcagacttc 360

tgggccgaca ctgacgctca ggcgcgaaag ctgggggagc gaacaggatt agaaacccca 420

gtagtcc 427

<210> 14

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg agtgaagaag 60

tatttcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagaaagtg acggtacctg aataagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggcaa ggcaagtctg aagtgaaagc ccggtgctta 240

acgccgggac tgctttggaa actgtttggc tggagtgccg gagaggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aagaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacggtaact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 15

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg aaggaagaag 60

tatctcggta tgtaaacttc tatcagcagg gaagatagtg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggtgt ggcaagtctg atgtgaaagg catgggctca 240

acctgtggac tgcattggaa actgtcatac ttgagtgccg gaggggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacggtaact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctagt 420

agtcc 425

<210> 16

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg aaggaagaag 60

tatctcggta tgtaaacttc tatcagcagg gaagaaaatg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggatg gacaagtctg atgtgaaagg ctggggctca 240

accccgggac tgcattggaa actgcccgtc ttgagtgccg gagaggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacggtaact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 17

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gtgggggata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag 60

gttttcggat tgtaaactcc tgtcgttagg gacgataatg acggtaccta acaagaaagc 120

accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aaaacgtagg gtgcaagcgt tgtccggaat 180

tactgggtgt aaagggagcg caggcggacc ggcaagttgg aagtgaaaac tatgggctca 240

acccataaat tgctttcaaa actgctggcc ttgagtagtg cagaggtagg tggaattccc 300

ggtgtagcgg tggaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg cgacctactg 360

ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 18

<211> 432

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg cgggatgacg 60

gccttcgggt tgtaaaccgc ttttgatcgg gagcaagcct tcgggtgagt gtacctttcg 120

aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg caagcgttat 180

ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgtag gcggttcgtc gcgtccggtg tgaaagtcca 240

tcgcttaacg gtggatctgc gccgggtacg ggcgggctgg agtgcggtag gggagactgg 300

aattcccggt gtaacggtgg aatgtgtaga tatcgggaag aacaccaatg gcgaaggcag 360

gtctctgggc cgttactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagaaa 420

ccctagtagt cc 432

<210> 19

<211> 426

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

gtgggggata ttgcgcaatg ggggcaaccc tgacgcagca acgccgcgtg aaggatgaag 60

gttttcggat tgtaaacttc ttttattaag gacgaaaaat gacggtactt aatgaataag 120

ctccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggagcaagcg ttgtccggat 180

ttactgggtg taaagggtgc gtaggcggct ttgcaagtca gatgtgaaat ctatgggctc 240

aacccataaa ctgcatttga aactgtagag cttgagtgaa gtagaggcag gcggaattcc 300

ccgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatggg gaggaacacc agtggcgaag gcggcctgct 360

gggctttaac tgacgctgag gcacgaaagc gtgggtagca aacaggatta gaaaccctag 420

tagtcc 426

<210> 20

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agtgaagaag 60

tatttcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagaaaatg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggcga agcaagtctg aagtgaaaac ccagggctca 240

accctgggac tgctttggaa actgttttgc tagagtgtcg gagaggtaag tggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacgataact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 21

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag 60

gtcttcggat tgtaaactcc tgttgttgag gaagataatg acggtactca acaaggaagt 120

gacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aaaacgtagg tcacaagcgt tgtccggaat 180

tactgggtgt aaagggagcg caggcgggaa gacaagttgg aagtgaaatc catgggctca 240

acccatgaac tgctttcaaa actgtttttc ttgagtagtg cagaggtagg cggaattccc 300

ggtgtagcgg tggaatgcgt agatatcggg aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg 360

ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctagt 420

agtcc 425

<210> 22

<211> 445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gtgaggaata ttggtcaatg ggcgagagcc tgaaccagcc aagtagcgtg aaggatgact 60

gccctatggg ttgtaaactt cttttataaa ggaataaagt cgggtatgca tacccgtttg 120

catgtacttt atgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggagcg taggcgggtt gttaagtcag 240

ttgtgaaagt ttgcggctca accgtaaaat tgcagttgat actggcgacc ttgagtgcaa 300

cagaggtagg cggaattcgt ggtgtagcgg tgaaatgctt agatatcacg aagaactccg 360

attgcgaagg cagcttactg gattgtaact gacgctgatg ctcgaaagtg tgggtatcaa 420

acaggattag aaaccctagt agtcc 445

<210> 23

<211> 445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gtgaggaata ttggtcaatg ggcgagagcc tgaaccagcc aagtagcgtg aaggatgaag 60

gctctatggg tcgtaaactt cttttatatg ggaataaagt tttccacgtg tggaattttg 120

tatgtaccat atgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggagcg taggtggatt gttaagtcag 240

ttgtgaaagt ttgcggctca accgtaaaat tgcagttgaa actggcagtc ttgagtacag 300

tagaggtggg cggaattcgt ggtgtagcgg tgaaatgctt agatatcacg aagaactccg 360

attgcgaagg cagctcacta gactgttact gacactgatg ctcgaaagtg tgggtatcaa 420

acaggattag aaaccctagt agtcc 445

<210> 24

<211> 425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg aaggaagaag 60

tatctcggta tgtaaacttc tatcagcagg gaagatagtg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggtgt ggcaagtctg atgtgaaagg catgggctca 240

acctgtggac tgcattggaa actgtcatac ttgagtgccg gaggggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacggtaact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acaggattag aaaccctagt 420

agtcc 425

<210> 25

<211> 429

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagca acgccgcgtg aaggaagaag 60

gttttcggat cgtaaacttc tatcaacagg gacgaagaaa gtgacggtac ctgaataaga 120

agccccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggggcaag cgttatccgg 180

aattactggg tgtaaaggga gcgtaggcgg cacgccaagc cagatgtgaa agcccgaggc 240

ttaacctcgc ggattgcatt tggaactggc gagctagagt acaggagagg aaagcggaat 300

tcctagtgta gcggtgaaat gcgtagatat taggaagaac accagtggcg aaggcggctt 360

tctggactga aactgacgct gaggctcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagaaaccc 420

tagtagtcc 429

<210> 26

<211> 445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

gtgaggaata ttggtcaatg gacgagagtc tgaaccagcc aagtagcgtg aaggatgaag 60

gttctatgga ttgtaaactt cttttatacg ggaataaacg aatccacgtg tggatttttg 120

catgtaccgt atgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggagcg tagatgggtt gttaagtcag 240

ttgtgaaagt ttgcggctca accgtaaaat tgcaattgat actggcagtc ttgagtacag 300

ttgaggtagg cggaattcgt ggtgtagcgg tgaaatgctt agatatcacg aagaactccg 360

attgcgaagg cagcttacta acctgtaact gacattgatg ctcgaaagtg tgggtatcaa 420

acaggattag aaaccctagt agtcc 445

<210> 27

<211> 445

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

gtgaggaata ttggtcaatg ggcgatggcc tgaaccagcc aagtagcgtg aaggatgact 60

gccctatggg ttgtaaactt cttttataaa ggaataaagt cgggtatgca tacccgtttg 120

catgtacttt atgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggagcg tagatggatg tttaagtcag 240

ttgtgaaagt ttgcggctca accgtaaaat tgcagttgat actggatgtc ttgagtgcag 300

ttgaggcagg cggaattcgt ggtgtagcgg tgaaatgctt agatatcacg aagaactccg 360

attgcgaagg cagcctgcta agctgcaact gacattgagg ctcgaaagtg tgggtatcaa 420

acaggattag aaaccctagt agtcc 445

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

actcctacgg gaggcagca 19

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims

1.消化道细菌16S rRNA或其片段和/或所述消化道细菌16S rRNA或其片段的检测试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，

其中，所述试剂盒还包括定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，所述消化道细菌选自：

以下目中两目或更多目的细菌：Enterobacteriales、Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales和Bifidobacteriales，或

以下科中两科或多科的细菌：Enterobacteriaceae、Streptococcaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae、Clostridiaceae、[Odoribacteraceae]和norank_o__Clostridiales，和任选的unclassified_o__Clostridiales，或

以下属中两属或多属的细菌：Streptococcus、Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium、Clostridium、Blautia、Odoribacter、Roseburia、Klebsiella和Ruminococcus，或

以下种中一种或多种的细菌：Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacteriumlongum、Roseburia faecis和Ruminococcus bromii，和任选的Blautia obeum、和Bacteroides ovatus，或

以下OTU中一个或多个OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU479、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU1285、OTU518、OTU1172、OTU932、OTU939、OTU312、OTU954、OTU405、OTU1094，

优选地，所述消化道细菌选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954，和任选的选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094，

优选地，所述16S rRNA的片段为V3和V4可变区；

优选地，所述检测试剂为扩增所述16S rRNA或其片段的引物和任选的与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针；更优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO:28和29所示，

优选地，所述定量试剂检测消化道细菌16S rRNA或其片段的存在量；更优选地，所述定量试剂为所述16S rRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述16S rRNA的片段具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个的序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，

更优选地，所述16S rRNA的片段具有选自SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ IDNO:3所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:25所示序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列或与其具有至少98％序列相同性的变体。

3.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其特征在于，所述消化道是肠道，优选地，所述消化道细菌来自粪便。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括消化道细菌16S rRNA或其片段和/或所述消化道细菌16S rRNA或其片段的检测试剂，和定量检测消化道细菌存在量的定量试剂，和任选的PCR扩增所需试剂和/或定量检测所需试剂，

其中，所述消化道细菌选自：

优选地，所述16S rRNA的片段为V3和V4可变区；

优选地，所述定量试剂检测消化道细菌16S rRNA或其片段，更优选地，所述定量试剂为所述16S rRNA或其片段的DNA测序引物或与所述16S rRNA或其片段在严谨条件下杂交的探针。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述16S rRNA的片段具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个的序列或与其具有至少98％序列相同性的变体，

6.核酸分子的检测试剂在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的用途，所述核酸分子包含消化道细菌16S rRNA的V3和V4可变区的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，所述片段至少100bp、至少150bp、或至少200bp、至少300bp、或至少400bp；

优选地，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:1-27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体；更优选地，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、19、22和24中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:3所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的SEQ ID NO:25所示序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，和任选的选自SEQ ID NO:9、14、15、16、17、18、20、21、23、26和27中的一个或多个序列的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，

优选地，所述检测试剂是扩增所述片段或变体的引物和任选的与所述片段或变体在严谨条件下杂交的探针，

其中，所述消化道细菌选自：

优选地，所述消化道细菌选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU890、OTU1181、OTU513、OTU1175、OTU952、OTU163、OTU1160、OTU1222、OTU26、OTU882、OTU1283、OTU57、OTU1285、OTU932、OTU312和OTU954，和任选的选自以下OTU中一个、一个以上或全部OTU的细菌：OTU479、OTU236、OTU1063、OTU532、OTU602、OTU353、OTU518、OTU1172、OTU939、OTU405和OTU1094。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括定量检测所述消化道细菌存在量的定量试剂，

优选地，所述定量试剂检测所述核酸分子的存在量，

更优选地，所述定量试剂为所述片段或其变体的DNA测序引物或与所述片段或其变体在严谨条件下杂交的探针。

8.如权利要求6-7中任一项所述的用途，其特征在于，所述消化道是肠道，优选地，所述消化道细菌来自粪便。

9.核酸分子的检测试剂，所述核酸分子包含消化道细菌16S rRNA的V3和V4可变区的片段或与其具有至少98％序列相同性的变体，所述片段至少100bp、至少150bp、或至少200bp、至少300bp、或至少400bp；

其中，所述消化道细菌选自：

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求9所述的核酸分子的检测试剂，和任选的PCR扩增所需试剂，

优选地，所述试剂盒还包括定量检测所述核酸分子的定量试剂和任选的定量检测所需试剂，更优选地，所述定量试剂为所述片段或变体的DNA测序引物或与所述片段或其变体在严谨条件下杂交的探针。