CN102939391A - 炎症性肠病的诊断方法 - Google Patents

Abstract

此处描述了一种用于诊断炎症性肠病的新方法，该方法基于确定来自人肠道微生物组的至少一个基因的缺失。

Description

炎症性肠病的诊断方法

技术领域

炎症性肠病是一种病因不明的慢性疾病，其特征在于胃肠道不同水平的持久性黏膜炎症。溃疡性结肠炎和克罗恩氏病是炎症性肠疾病的两种主要类型。溃疡性结肠炎导致限制在结肠的持续性黏膜炎症，而克罗恩氏病导致在整个胃肠道的任意位置非持续性穿壁性炎症（transmural inflammation），尽管其最通常地影响回肠末端（terminal ileum）。最常见的肠道病变由黏膜溃疡、肠壁肿胀和肠腔狭窄（stricturing）组成。这些慢性炎症病变可导致症状比如腹泻、便急（faecal urgency）、腹痛和发热、以及不同严重程度的并发症包括出血、肠梗阻、败血症和营养不良。

背景技术

流行病学研究证明在上个世纪自1950年以来，在西欧和北美这种疾病的发病率（incidence）稳步上升。二十年后在南欧和日本发病率上升，但如今发病率（incidence rate）与北欧和北美同样的显著。最近的数据表明东欧国家以及南亚和东亚的发病率越来越高。发病率的变化似乎与西化的生活方式有关，包括饮食习惯的变化和环境的变化比如改善的卫生条件和产业化。如今，合并的患病率（prevalence）数字（溃疡性结肠炎加上克罗恩氏病）表明炎症性肠病影响了高达0.5％的发达社会的群体。

炎症性肠病对社会的影响是非成比例的高，作为表现常发生在年轻的时候，并且有可能造成终身的健康状况不佳。目前，还没有炎症性肠疾病的治愈或根除疗法。通常，溃疡性结肠炎和克罗恩氏病均呈现起伏的活动（activity），具有不受控的、慢性黏膜炎症发作（bouts），随后是缓解期间发生的重塑过程。主要治疗方法通常是药物疗法来减轻炎症活动的发作并防止缓解时未来的复发。可以用各种药物治疗患者，包括5-ASAs（如美沙拉嗪）、类固醇（如泼尼松龙）、和免疫抑制剂（如硫唑嘌呤）。此外，当标准药物治疗失败时，患者也可以接受新的生物药物如单克隆抗体（如抗TNF-α抗体英夫利昔单抗）。尽管它们一般有效，但这种药物可以具有重大的负担。它们不仅贵，副作用还是常见的，对于免疫抑制剂发生率为28％，对于类固醇上升到50％。有些患者可出现严重的副作用，如全身性感染或瘤形成，因此目前的疗法需要密切的监视。此外，约30％患有溃疡性结肠炎的患者和50％患有克罗恩氏病的患者，在他们生活中的某些时候需要手术。

可用的药物疗法不能达到这种疾病的根除或永久治愈，这主要是由于这样的事实，溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的确切病因仍有待澄清。然而，至少在过去几年中，导致黏膜炎症性病变的病理生理机制已被部分揭示。有令人信服的证据表明，炎症性肠病中观察到的炎症是肠道（gut）微生物群落和黏膜免疫系统之间的异常反应引起的。黏膜免疫系统的T辅助性淋巴细胞（Th）对病原体的防御反应与旨在清楚病原体的炎症过程有关，但同时这些过程也破坏了宿主组织。在正常情况下，一些共生的肠道微生物在肠道淋巴滤泡中对于诱导调节性T淋巴细胞（Tregs）似乎发挥了重要作用。调节性T淋巴细胞是被称为“免疫耐受”现象的关键作用者（player），因为这些淋巴细胞在对被识别为非致病性的微生物抗原反应时不诱导炎症。调节性T淋巴细胞介导的免疫耐受是必要的自我平衡机制，通过这种机制宿主可以承受肠道当中或其它身体表面无害抗原的巨大负担，而不通过炎症进行反应。一些证据表明，在具有遗传易感性的个体中，Th淋巴细胞介导的对抗腔细菌的免疫是驱动产生肠病变和/或损害病变消除的炎症过程中的关键事件。肠道微生物群（microbiota）与黏膜免疫部分间的缺陷相互作用可导致引起慢性肠炎症的异常。

一些研究已经表明粪便微生物群的组成在患有炎症性肠疾病的受试者与健康对照之间是不同的。报道的差异是多样的，且各项研究之间并不总是一致的。因此，不可能使用公开的差异来区分患有炎症性肠疾病的患者和健康人。然而，如上面所解释的，将确定特定环境下在炎症性肠病特别是克罗恩氏病的发作和维持中的固有的（indigenous）肠道微生物。因此仍然需要一种新的、可靠的方法来允许一致性的炎症性肠病诊断。

大多数肠共生体无法培养。已经开发出基因组策略来克服这种限制（Hamady和Knight,Genome Res,19:1141-1152,2009）。这些策略允许将微生物组定义为微生物群基因组中包含的基因的集合（Turnbaugh等人，Nature,449:804-8010,2007；Hamady和Knight,GenomeRes.,19:1141-1152,2009）。已证明，所有个体共有的少数物种的存在构成了人肠微生物群系统发育的核心（Tap等人，Environ Microbiol.,11(10):2574-2584,2009）。近期，宏基因组学（metagenomic）分析已导致对330万个非冗余人肠道微生物基因广泛目录的鉴定，这对应着576.7千兆个碱基的序列（Qin等人，Nature,2010,doi:10.1038/nature08821）。

发明内容

本发明人已使用基于在不同个体中来自人粪便DNA片段的分离和测序的方法。由于来自肠道的微生物基因的广泛目录现已可获得（Qin等人，Nature,2010,doi:10.1038/nature08821），可以计算在特定群体中（如，患炎症性肠病的患者）特定序列的拷贝数和频率。因此有可能鉴定特定基因的存在或缺失与特定病理存在或缺失之间的任何相关性。此外，可以确定个体中特定基因的拷贝数。

克罗恩氏病和溃疡性结肠炎是消化道慢性免疫炎症性疾病，统称为炎症性肠病。本发明人能够鉴定一组患有克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的患者和健康人对照之间显著不同的基因。这些基因列于表1（克罗恩氏病）和表2（溃疡性结肠炎）中。所述基因在健康个体中比在患者中更众多。这种观察在统计学上是显著的，因为微生物基因的总数在两个群体中没有不同。因此，在患炎症性肠病的个体中特定人肠道微生物基因存在丢失。

本发明的第一方面是一种用于诊断炎症性肠病的方法，所述方法包括确定是否至少一个基因从个体肠道微生物组中缺失的步骤。通过“个体肠道微生物组”，此处理解为构成所述个体微生物群的所有基因。术语“个体肠道微生物组”因此对应着所述个体肠道中存在的所有细菌的所有基因。

当基因在微生物组中的拷贝数在一定的阈值以下时，基因从微生物组中缺失。根据本发明，“阈值”意图表示这样的值，其允许对样本进行区分，在样本中兴趣基因的拷贝数对应着个体微生物组中低或高的拷贝数。特别是，如果一些拷贝小于或等于阈值，那么该基因在微生物组中的拷贝数被认为是低的，而如果拷贝数超过阈值，那么该基因在微生物组中的拷贝数被认为是高的。低拷贝数是指基因从微生物组中缺失，而大量拷贝是指基因存在于微生物组中。对于每个基因，最佳阈值可能根据测量基因拷贝数所使用的方法而不同。然而，其可容易地由技术人员基于若干个体的微生物组分析，在其中对于特定基因的拷贝数（低或高）是已知的，以及基于和对照基因的拷贝数的比较而确定。

本发明的方法从而允许技术人员仅仅基于来自个体肠道微生物组的基因的存在或缺失来诊断病理。特定基因的拷贝数和携带该基因的细菌细胞数目有直接的相关性。本发明的方法从而允许技术人员通过微生物组分析来检测生态失调，即微生物的不平衡。并非肠道中的所有物种已被鉴定，因为大多数无法培养，并且很难鉴定。此外，在给定个体肠道中发现的大多数物种是罕见的，这使得它们很难检测（Hamady和Knight,Genome Res,19:1141-1152,2009）。在本发明的这一方面，不需要先鉴定所述基因所属的细菌物种。因此本发明的诊断方法不限于确定已知的肠道细菌物种的群体变化，还包括尚未分类学上描述的细菌。

有多种方式获得所述个体肠道微生物DNA样本（Sokol等人，Inflamm.BowelDis.,14(6):858-867,2008）。例如，有可能制备通过结肠镜获得的黏膜标本、或活检。然而，结肠镜是一种侵入性程序，不同研究之间在收集程序方面是不确定的。同样地，有可能通过手术获得活检。然而，和结肠镜相比，手术是更加侵入性的程序，其对微生物群体的作用是未知的。优选的是粪便分析，其为一种已经被可靠地用在本领域中的程序（Bullock等人,Curr Issues Intest Microbiol.;5(2):59-64,2004;Manichanh等人.,Gut,55:205-211,2006;Bakir等人,Int J Syst Evol Microbiol,56(5):931-935,2006;Manichanh等人,Nucl.AcidsRes.,36(16):5180-5188,2008;Sokol等人,Inflamm.Bowel Dis.,14(6):858-867,2008）。在实验实施例的方法部分描述了这种程序的一个实例。粪便含有约10¹¹个细菌细胞每克（湿重）以及细菌细胞包括约粪便质量的约50%。粪便的微生物群主要代表远端大肠的微生物学。因此有可能从个体粪便中分离和分析大量微生物DNA。通过“微生物DNA”，此处应理解为来自人肠道任何定居细菌群落的DNA。术语“微生物DNA”包括编码和非编码序列；尤其不限于完整基因，还包括编码序列的片段。粪便分析因此是非侵入性的程序，其产生从患者到患者一致性的且直接可比较的结果。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括从所述个体粪便获得微生物DNA的步骤。在另一个优选的实施方式中，收集来自所述个体的粪便，提取DNA，并确定至少一个基因在个体肠道微生物组中的存在或缺失。通过技术人员已知的所有方法可确定基因的存在或缺失。例如，所述个体的整体微生物组可能被测序，并且在生物信息学方法的帮助下搜索所述基因的存在或缺失。在实验实施例的方法部分描述了这样的策略的一个实例。或者，用特异性探针通过杂交如Southern杂交在微生物组中寻找兴趣基因。在这个特定的实施方式中，尽管Southern杂交是完全合适的，无论如何使用微阵列更方便和更敏感，这对于本领域技术人员而言是非常显而易见的。在另一个实施方式中，通过扩增，特别是通过定量PCR（qPCR），可检测到兴趣基因的存在。这些技术（Southern、微阵列、qPCR等）目前是本领域技术人员常规使用的，因此不需要在此处详述。

在另一个优选的实施方式中，炎症性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。在另一个优选实施方式中，所述疾病是克罗恩氏病；在另一个优选实施方式中，所述疾病是溃疡性结肠炎。

在另一个优选的实施方式中，确定在个体肠道微生物组中缺失或存在的基因选自表1和2中列出的基因的组中。在另一个优选的实施方式中，基因选自表1中列出的基因的组中；在另一个优选的实施方式中，基因选自表2中列出的基因的组中。本领域技术人员将不会有任何困难认识到测试的基因越多，结果可信度越高。根据另一个优选实施方式，本发明的方法包括确定列于表1中的至少50%的基因，更优选，表1中至少75%的基因，甚至更优选，表1的至少90%的基因的存在或缺失。根据另一个优选实施方式，本发明的方法包括确定列于表2中的至少50%的基因，更优选，表2中至少75%的基因，甚至更优选，表2的至少90%的基因的存在或缺失。

尽管微生物菌丛（flora）中发现的大量细菌物种没有被鉴定，已知大多数细菌属于拟杆菌属（Bacteroides）、梭菌属（Clostridium）,梭杆菌属（Fusobacterium）,真细菌属（Eubacterium）,瘤胃球菌属（Ruminococcus）,消化球菌属（Peptococcus）,消化链球菌属（Peptostreptococcus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）。其它属比如大肠杆菌属（Escherichia）和乳杆菌属（Lactobacillus）以更小的范围存在。属于这些属的一些个体物种已被鉴定，并且这些物种的一些基因是已知的。已导致330万个非冗余微生物基因的鉴定的广泛宏基因组学研究还允许大多数新序列的指定（assignment）。属于给定物种的基因以和所述物种的所有其它基因相同的频率存在于个体中。因此有可能在各种个体中针对每个通过本发明方法鉴定的基因来确定所述基因的存在或缺失与已知属于特定细菌物种的一组基因的存在或缺失之间是否有相关性。这种相关性表明未知基因属于所述特定细菌物种。本发明人因此已经表明一些细菌物种与炎症性肠病表型相关，而其它细菌物种与健康表型相关。通过所述物种的线性组合可以预测炎症性肠病表型，即个体肠道中存在的炎症性肠病表型相关的细菌物种越多，与所述个体肠道中健康表型相关的物种越少，所述个体患炎症性疾病的可能性越高。例如，人肠道中普拉梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii）和Roseburia inulinivorans（无对应译文）的缺失，以及Clostridium boltae（无对应译文）、多枝梭菌（Clostridium ramosum）和活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）的存在表示这个人患有克罗恩氏病。同样地，人肠道中Akkermansia muciniphila（无对应译文）的缺失以及多毛拟杆菌（Bacteroidescapillosus）和柔嫩梭菌（Clostridium leptum）的存在表示这个人患有溃疡性结肠炎。

本领域技术人员清楚本发明的基因可以用作生物标志物，例如在患炎症性肠病的患者治疗过程中。因此，在另一实施方式中，本发明包括一种用于监测炎症性肠病治疗疗效的方法。当对炎症性肠病的治疗有效时，最初观察到的生态失调逐渐消失。然而，当所述个体患病时，一些特定的基因从个体肠道缺失（如，当疾病是克罗恩氏病时，表1的基因，或者当个体患有溃疡性结肠炎时，表2的基因），这些基因在治疗过程中重新出现。在本实施方式中，本发明的方法因此包括以下步骤：首先确定是否至少一个基因从所述患者的微生物组中缺失，施用治疗，确定是否所述至少一个基因存在于患者的微生物组中。在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：在治疗之前和之后，从所述个体的粪便中获得微生物DNA。在另一个优选的实施方式中，在治疗之前和之后，从所述个体收集粪便，提取DNA，并确定至少一个基因从个体肠道微生物组中的存在或缺失。

在另一个优选的实施方式中，炎症性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。在另一个优选实施方式中，所述疾病是克罗恩氏病；在另一个优选实施方式中，所述疾病是溃疡性结肠炎。

在另一个优选的实施方式中，确定在个体肠道微生物组中缺失或存在的基因选自表1和2中列出的基因的组中。在另一个优选的实施方式中，基因选自表1中列出的基因的组中；在另一个优选的实施方式中，基因选自表2中列出的基因的组中。在本发明方法的一个具体实施方式中，表1和/或表2中至少50%、75%或90%的基因在治疗前从所述个体肠道微生物组中缺失。因此，根据优选的实施方式，本发明的方法包括确定列于表1中的至少50%的基因，更优选，表1中至少75%的基因，甚至更优选，表1的至少90%的基因的存在或缺失。根据另一个优选的实施方式，本发明的方法包括确定列于表2中的至少50%的基因，更优选，表2中至少75%的基因，甚至更优选，表2的至少90%的基因的存在或缺失。

本发明还包括专门用于实施本发明方法的试剂盒，其包括在患有炎症性肠病的患者中缺失，而在健康人当中存在的所有基因。尤其是，本发明涉及专门用于实施本发明方法的微阵列，其包括与在患有炎症性肠病的患者中缺失而在健康人当中存在的所有基因结合的探针。在一个优选的实施方式中，所述微阵列是核酸微阵列。根据本发明，“核微阵列”由附着至基底（substrate）上的不同核酸探针组成，该基底可以是微芯片、玻璃载片或微球尺寸的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃或硝酸纤维素构成。探针可以是核酸比如cDNA（“cDNA微阵列”）或寡核苷酸（“寡核苷酸微阵列”，为长度大约25至大约60个碱基对或更少的寡核苷酸）。作为核酸技术的替代，可以使用定量PCR，并且因此特异于待测基因的扩增引物对于进行根据本发明的方法也是非常有用的。因此本发明进一步涉及用于在患者中诊断炎症性肠病的试剂盒，包括如上所述的专门的微阵列或在患有炎症性肠病的患者中缺失而在健康人当中存在的基因的特异性扩增引物。然而这些试剂盒可允许技术人员检测10%、25%、50%或75%的所述基因，当它们允许检测90%、95%、97.5%或甚至99%的所述基因时，它们是最有用的。因此，根据本发明的微阵列将包括与至少10%、25%、50%或75%，以及优选90%、95%、97.5%，和甚至更优选至少99%的所述基因结合的探针。同样地，用于定量PCR的试剂盒将含有允许至少10%、25%、50%或75%，以及优选90%、95%、97.5%，和甚至更优选至少99%的所述基因的扩增。

在一个优选的实施方式中，炎症性肠病选自克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。在另一个优选实施方式中，所述疾病是克罗恩氏病；在另一个优选实施方式中，所述疾病是溃疡性结肠炎。在另一个实施方式中，在患有克罗恩氏病的患者中缺失而在健康人中存在的基因是表1中列出的基因；在另一个实施方式中，它们在表2中列出。

附图说明

图1：CD相关基因和UC相关基因的整体分析。A）在健康个体中更多的CD相关基因。每个个体基因数目相对于CD相关基因的函数的图，其表明该基因在健康个体中比患者中更多。B）在健康个体中更多的UC相关基因。每个个体基因数目相对于UC相关基因的函数的图，表明该基因在健康个体中比患者中更多。

图2：A）针对处于所定义的水平（至少50%的基因）的群体的部分，5个物种的线性组合很好地区分克罗恩氏病表型；B）3个物种区分溃疡性结肠炎。

具体实施方式

方法

人粪便样本收集。西班牙个体是健康对照或处于临床缓解中的患有慢性炎症性肠病的患者（克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）。要求患者和健康对照提供冷冻的大便样本。在家里获得新鲜的大便样本，并且通过将它们储存在他们的家用冰箱中立即冷冻样本。使用封闭的聚苯乙烯泡沫容器将冷冻样本交付给医院，然后它们被保存在-80℃直到分析。

DNA提取。各粪便样本的冷冻等份（200mg）悬浮在250μl的异硫氰酸胍、0.1M Tris（pH7.5）和40μl10%N-月桂酰基肌氨酸中。然后，如先前所述（Manichanh等人，Gut,55:205–211,2006）进行DNA提取。通过NanoDrop（Thermo Scientific）和琼脂糖凝胶电泳估计DNA的浓度及其分子大小。

DNA文库的构建和测序。按照制造商的说明书（Illumina）制备DNA文库。我们使用了如其它地方所述的相同工作流程来进行集群（cluster）生成、模板杂交、等温扩增、线性化、封闭和变性以及测序引物的杂交。碱基识别途径（base-callingpipeline）（版本IlluminaPipeline-0.3）用于处理原始的荧光图像并识别（call）序列。我们为最先的15个样本的每个构建一个文库（克隆插入大小200bp），为其余109个样本的每个构建具有不同克隆插入大小（135bp和400bp）的两个文库用来验证实验的重复性。为了估计新序列生成和测序深度之间的最佳回报（return），我们使用短寡核苷酸比对程序（SOAP）将来自样本MH0006和MH0012的IlluminaGA读取与产生自相同的两个样本的总共311.7Mb的468,335桑格（Sanger）读取（分别156.9和154.7Mb）进行比对（Li等人，Bioinformatics,25:1966–1967,2009）并且95%序列同一性的匹配要求。用约4Gb的Illumina序列，覆盖94%和89%的桑格读取（分别对于MH0006和MH0012）。对于MH0006和MH0012分别进一步广泛测序至12.6和16.6Gb只带来了有限的（moderate）覆盖率增加至大约95%。桑格读取的90%以上被Illumina序列覆盖到一个非常高且统一的水平，这表明在Illumina GA序列中有很少或没有偏倚（bias）。正如所预期的，大比例的Illumina序列（对于M0006和M0012分别为57%和74%）是新的且不能被描绘到（mappedonto）桑格读取上。在4和12-16Gb测序水平上，该部分（fraction）是相似的，这证实大部分的新序列（novelty）在4Gb时已经被捕获。

我们为其余122个样本产生35.4-97.6百万个读取，平均62.5百万个读取。第一批15个样本的测序读取长度为44bp且第二批为75bp。

所用的公共数据存放于GenBank的测序的细菌基因组（共806个基因组）于2009年1月10日从NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。从HMP数据库（http://www.hmpdacc-resources.org/cgi-bin/hmp catalog/main.cgi）、GenBank（67个基因组）、圣路易斯的华盛顿大学（85个基因组，2009年4月版本，http://genome.wustl.edu/pub/organism/Microbes/Human Gut Microbiome/）下载已知的人肠道细菌基因组序列，并且通过MetaHIT计划（17个基因组，2009年9月版本，http://www.sanger.ac.uk/pathogens/metahit/）进行测序。在这个计划中使用的其它肠道宏基因组学数据包括：（1）从美国个体测序的人肠道宏基因组学数据（Zhang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,106:23652370,2009），用登录号SRA002775从NCBI下载；（2）来自日本个体的人肠道宏基因组学数据（Kurokawa等人，DNA Res.14:169–181,2007），在EMBL上（http://www.bork.embl.de）从P.Bork的小组下载。本研究中我们构建的整合NR数据库包括NCBI-NR数据库（2009年4月版本）以及来自已知人肠道细菌基因组的所有基因。

Illumina GA短读取的从头拼接。每个DNA样本的高品质短读取通过SOAP从头汇编程序（assembler）进行拼接（Li.和Zhu,GenomeRes.,20(2):265-272,2010）。简单而言，我们首先根据17-mer的频率从拼接中过滤低丰度序列。在拼接的前面筛选深度低于5的17-mers，对于这些低频率序列不太可能进行拼接，而删除它们会显著降低对内存的要求，并且使得在普通超级计算机（在我们的研究所中512GB的内存）上进行拼接变得可行。然后一个一个地处理序列，de Bruijn图的数据格式被用来存储序列之间的重叠信息。由单一读取支持的重叠路径是不可信的并删除。由测序错误或微生物株之间的遗传变异引起的短的低深度tips（无对应译文）和bubbles（无对应译文）分别进行修剪（trim）和合并。读取路径被用来解决微小的重复。最后，我们在重复边界处打破连接，输出以明确连接作为重叠群（contig）的连续序列。选择宏基因组学的特殊模式，并且参数“-K21”和“-K23”分别用于44bp和75bp的读取来指示所需的最小序列重叠。对各样本独立地进行从头拼接之后，我们将所有未拼接的读取合并到一起，并针对它们进行拼接，以便使数据的利用最大化，并且通过将所有样本的数据放在一起来拼接在各读取集合（set）中具有低的频率但是对于拼接具有足够序列深度的微生物基因组。

使用桑格读取验证Illumina重叠群。我们使用BLASTN（WUBLAST2.0）从样本MH0006和MH0012（分别156.9Mb和154.7Mb）到来自相同样本的Illumina重叠群（单个最佳命中在75bp以上且超过95%同一性）来绘制桑格读取。各比对扫描共线性的断裂（breakage），其中两条序列在比对的一端具有至少50个碱基未比对。每一个这样的断裂被认为是在共线性断裂位置的Illumina重叠群的拼接错误。彼此30bp以内的错误进行合并。如果在错误两侧存在与重叠群结构有60bp一致的桑格读取，则丢弃该错误。为了比较，我们在来自MH0006的454Titanium读取（550Mb读取）的Newbler2拼接上重复这种操作。对于Illumina拼接我们估计14.12个错误每Mb重叠群，这与454拼接（20.73每Mb）是可媲美的。描绘至少一个桑格读取的Illumina重叠群的98.7%在绘制（mapped）区域的99.55%上是共线性的，这可媲美于这种454重叠群的97.86%在绘制区域的99.48%上是共线性的。

人肠道微生物组覆盖率的评价。使用SOAP，通过允许在第一35-bp区域中至多两个错配以及读取序列上90%的同一性，将Illumina GA读取比对至拼接的重叠群以及已知的细菌基因组。使用BLASTN，以1×10^-8、超过100bp的比对长度和最小90%同一性截止值，将Roche/454和桑格测序读取比对至相同的参考。当通过SOAP比对至MH0006和MH0012的GA读取、比对至来自相同样本的桑格读取时，允许两个错配并且同一性设置为读取序列的95%。

非冗余基因集合的基因预测和构建。我们使用MetaGene（Noguchi等人，Nucleic Acids Res,.34,5623–5630,2006）——其使用通过给定序列的GC含量估计的双连密码子（di-codon）频率，并基于匿名基因组序列预测ORF的整个范围—从各124个样本的重叠群中以及从合并拼接的重叠群中找到ORF。然后使用BLAT将预测的ORF彼此比对（Kent等人，Genome Res.,12:656–664,2002）。具有大于95%同一性以及比对长度覆盖较短基因的90%以上的一对基因被分组在一起。共有基因的组然后进行合并，各合并的组中最长的ORF用于代表该组，组的其它成员作为冗余。因此，我们通过排除冗余从所有预测基因中组织了非冗余基因集合。最后，过滤长度小于100bp的ORF。我们使用NCBI的遗传代码将ORF翻译成蛋白质序列（Ley等人，Nature Rev.Microbiol,.6:776–788,2008）。

基因的鉴定。

为了使鉴定低丰度基因和降低鉴定错误率之间建立平衡，我们探索了阈值设置对在个体微生物组中鉴定基因所需的读取覆盖率的影响。当鉴定所需的读取数目从2增加至6时，基因的数目降低约两倍，此后缓慢变化。无论如何，为了将罕见基因纳入分析中，我们选择了2个读取的阈值。

基因分类指定（Gene taxonomic assignment）。使用针对整合NR数据库的BLASTP比对进行预测的基因的分类指定。对具有大于1×10^-5的e-值的BLASTP比对命中进行过滤，针对各基因由e-值≤10×最佳（top）命中的e-值所定义的显著匹配被保留，用来区分分类的组。然后我们通过在MEGAN中实施的基于最低共同祖先（LCA）的算法确定了各个基因分类学上的水平（Huson等人，GenomeRes.,17:377–386,2007）。以指定的分类单元（taxon）的分类学水平体现基因的保守水平的方式，基于LCA的算法将基因指定至分类群（taxa）。例如，如果一个基因在许多物种中是保守的，则它被指定到LCA，而不是一个物种。

基因功能分类。

我们使用BLASTP在eggNOG数据库（Jensen等人，Nucleic AcidsRes.,36:D250D254,2008）和KEGG数据库（Kanehisa等人，Nucleic AcidsRes.,32:D277D280,2004）中用e值≤1×10^-5搜索预测的基因的蛋白质序列。以具有最低e值的NOG或KEGG同源物的功能注释基因。eggNOG数据库是COG和KOG数据库的整合。由COG注释的基因分为25个COG类，由KEGG注释的基因被指定到KEGG途径。

最小肠道细菌基因组的测定。通过基因长度和集群拷贝数标准化（normalized）指定到eggNOG集群的非冗余基因的数目。按照标准化的基因数目将集群进行排序，并且确定包括编码必需的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基因的集群的范围，计算这些集群在100个集群的连续组当中的比例。涵括基因集群的范围的分析，除iPath透射（projection）以外，使用KEGG和手工验证途径完整性和它们所编码的蛋白质机制（machineries）。

总功能补充和最小宏基因组的测定。我们计算n个个体的随机组合中存在的直系同源组和/或基因家族的总的和共有的数目（n=52至124，每个bin100次重复柱）。在三组基因集群上进行这种分析：（1）已知的eggNOG直系同源组（也就是那些带有功能注释的，不包括在其中发生术语未确定的（[Uu]ncharacteri[sz]ed）、未知的（[Uu]nknown）、预测的（[Pp]redicted）或假设的（[Pp]utative）的那些）；（2）所有的eggNOG直系同源组；（3）所有直系同源组加上从未指定至上述两个类别的剩余基因中所构建的基因家族。使用MCL从全-对-全（all-against-all）BLASTP结果中，以1.1的膨胀因子（inflation factor）和60的片段分数（bit-score）截止值，对家族进行集群操作（van Dongen,Ph.D.Thesis,Univ.Utrecht,2000）。

稀疏分析（rarefaction analysis）。鉴于内存的限制，使用EstimateS在100个随机选取的样本上进行总基因丰富度（richness）的估计。由于CV值>0.5，计算chao2（经典）和ICE丰富度估计量，且使用较大的两个（ICE）的估计。对这种样本大小的估计为3,621,646个基因（ICE），而S_obs（Mao Tau）为3,090,575个基因或85.3%。ICE估计量曲线没有完全饱和，表明需要添加额外的样本来实现最终的决定性估计。

常见的细菌核心。为了消除非常相似的株的影响，并评估群体的个体当中已知微生物物种的存在，我们使用650个测序的细菌和古细菌的基因组作为参照集合。集合由932个公众可获得的基因组组成，使用90%同一性截止值和在至少80%长度的相似性，通过相似性对该基因组进行分组。从各组中仅使用最大的基因组。将来自124个个体的Illumina读取绘制到集合上用于物种谱（profiling）分析，并且当序列可获得时，通过手工检查和通过使用基于16S的集群监管（curated）源自相同物种（由大小上>20%区分）的基因组。

个体之间微生物基因组的相对丰度。我们通过独特的绘图Illumina读取计算了基因组覆盖率并将其标准化至1Gb的序列，以修正不同个体中不同的测序水平。针对每个个体在所有非冗余细菌基因组集合的物种上汇总覆盖率，并计算各物种相对于总和的比例。

物种共存网络。针对在至少一个个体中具有Illumina读取≥1%的基因组覆盖率的155个物种，我们计算了124个个体的整个群体当中测序深度（丰度）之间的配对物种间Pearson相关性。来自获得的11,175物种间相关性，使用Cytoscape对小于-0.4或在0.4以上的相关性（n=342）在图中进行可视化（Shannon等人，Genome Res.13:24982504,2003）。作为在图中的节点大小显示每个物种的平均基因组覆盖率。

结果

所用群体和方法的概述。对于克罗恩氏病，群体的大小是8位患者和13位健康对照；对于溃疡性结肠炎，是12位患者和12位健康对照。对于各疾病，通过ranksum搜索330万个基因的整个基因目录来搜寻两组之间显著差异的那些。通过基因大小（较大的基因是较大的目标并且更频繁地遇到）和不同个体测序程度上的差异对基因频率进行标准化。显著差异的基因的数目受阈值的影响，并分组。简言之，在p<3×10^-4处发现3802个“CD（克罗恩氏病）-相关基因”以及在p<10^-3处发现4841个“UC（溃疡性结肠炎）-相关基因”。

BMI基因的整体分析。显著差异的基因，即CD相关基因（图1A）或UC相关基因（图1B），按个体进行绘制。在健康个体中CD相关基因的中位数是3038，在克罗恩氏病患者中只有643。在2组当中中位基因数目是非常显著差异的（p<2×10^-13，单尾t检验）。同样地，在健康个体中UC相关基因的中位数是3402，在患有溃疡性结肠炎的患者中是1212。差异是非常显著差异的（p<6.7×10^-5，单尾t检验）。

比较所有基因和CD相关基因或UC相关基因的分布。微生物组的所有基因和CD相关基因或UC相关基因的分布进行了比较。两组之间所有基因的数目和频率比CD相关基因或UC相关基因有更少的差异。CD相关基因分布并不简单地反映所有基因分布；相似地，UC相关基因分布并不简单地反映基因分布中的一般倾向。克罗恩氏病患者和溃疡性疾病患者中基因的丢失因此是显著的。

CD相关和UC相关物种。使用指定到330万目录中的基因的分类学指定将CD相关基因和UC相关基因分配到物种（Qin等人，Nature,2010,出版中,doi:10.1038/nature08821）。发现68%的CD相关基因，但只有32.8%的所有基因，来自厚壁菌门（firmicutes）。另一方面，拟杆菌门(bacteroidetes)的频率对于CD相关基因是22%和对于微生物组的所有基因是18.4%。同样地，70%的UC相关基因来自厚壁菌门，而只有15%来自拟杆菌门。因此，炎症性肠病，比如克罗恩氏病和溃疡性疾病，与厚壁菌门的变化相关。物种首先通过指定到CD相关基因和UC相关基因当中基因数目进行鉴定。然后来自相同物种的其它基因从目录中抽出，并且对各物种在不同个体中评估50个代表性基因（这非常有利地与使用单一16S基因进行了比较，目前进行16S基因来鉴定物种）的存在。在个体中如果发现至少一半的标志物基因，则认为存在物种。使用Chi2检验通过与所有群体分布（对于克罗恩氏病，13相对于8；对于溃疡性结肠炎，12相对于12）进行比较来评估健康者和患者之间分布的显著性。对于克罗恩氏病，普拉梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii）和Roseburia inulinivorans（无对应译文）与健康人群有关（分别p=2.4×10^-2和p=9.3×10^-3），即它们倾向于从患者中缺失。另一方面，Clostridium boltae（无对应译文）、多枝梭菌（Clostridium ramosum）和活泼瘤胃球菌（Ruminococcusgnavus）与患者群体有关（p=4×10^-3，p=1.8×10^-3和p=6.4×10^-3）。在物种鉴定的基础上，表明这5个物种的线性组合完全预测克罗恩氏病表型（图2A）。健康个体和患者分别显示为蓝色和红色的点。物种存在（纵坐标）对应着“好物种”基因（与克罗恩氏病负相关（anti-associated））减去“坏物种”的基因（与克罗恩氏病相关）的总和。个体按物种存在（横坐标）进行排序。如果个体有过多的“好物种”基因，他或她将位于排名的前面并且倾向于是健康的，而如果有过多的“坏物种”基因，他或她将位于排名的右面并且倾向于是病态的。对于溃疡性结肠炎，Akkermansia muciniphila（无对应译文）与健康表型有关，而多毛拟杆菌（Bacteroides capillosus）和柔嫩梭菌（Clostridium leptum）与患者群体有关。如图2B中所示，3种物种的线性组合预测溃疡性结肠炎表型。

表1：CD相关基因

表2：UC相关基因

Claims (10)

1.一种用于诊断炎症性肠病的方法，所述方法包括确定是否来自表1和/或表2的至少一个基因从个体肠道微生物组中缺失的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。

3.根据权利要求1所述的方法，其中表1和/或表2的至少50%、75%或90%的基因从所述个体肠道微生物组中缺失。

4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括从所述个体粪便获得微生物DNA的步骤。

5.一种用于监测炎症性肠病治疗疗效的方法，所述方法包括步骤：首先确定是否至少一个基因从所述患者的微生物组中缺失，施用治疗，确定是否所述至少一个基因存在于患者的微生物组中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。

7.根据权利要求5所述的方法，其中在治疗之前表1和/或表2的至少50%、75%或90%的基因从所述个体肠道微生物组中缺失。

8.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括至少一个从所述个体粪便获得微生物DNA的步骤。

9.一种微阵列，其包括与表1和/或表2的至少10%、25%、50%、75%、90%、95%、97.5%或99%的基因杂交的探针。

10.一种用于诊断炎症性肠病的试剂盒，其包括权利要求9所述的微阵列或特异于表1和/或表2的至少10%、25%、50%、75%、90%、95%、97.5%或99%的基因的扩增引物。

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