CN110607262B - 一种干预炎性肠炎的益生菌组合物及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种干预炎性肠炎的益生菌组合物及其筛选方法和应用，涉及生物医药技术领域，所述益生菌组合物包括：Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium scardovii、Clostridium butyricum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus delbrueckii、Oxalobacter formigenes、Lactobacillus acidophilus、Enterococcus faecalis；本发明综合考虑多个影响因素，除了补充拮抗炎性肠炎的特异治病细菌，还添加了对肠粘膜起保护作用的益生菌、提高免疫能力的益生菌，以及可以减少炎症反应的益生菌，通过增强肠道黏膜屏障功能、调节肠道黏膜免疫及恢复肠道微生物群落构成等全方位入手，来改善或治疗炎性肠炎，获得更好的疗效。

Description

一种干预炎性肠炎的益生菌组合物及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物医药技术领域，具体地，涉及一种干预炎性肠炎的益生菌组合物及其筛选方法和应用。

背景技术

炎性肠炎(Inflammatory Bowel Disease，简称IBD)是一组不明原因的慢性肠道炎症性疾病，临床主要表现为腹胀、腹痛、腹泻、粘液血便、粘膜脓便；包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，以持续性肠道非特异性炎症为特征，通常反复发作、迁延不愈，临床上仍无特效性的治疗手段。近年来越来越多的研究报道肠道菌群及其代谢产物、宿主基因易感性及肠道黏膜免疫三方面共同参与了IBD的发病机制，且已证实IBD患者的肠道菌群组成与正常人明显不同。

人体肠道中含有多达10¹³～10¹⁴个、共15000～36000种微生物，其数量为人体细胞的10倍，是人体最大的贮菌库，肠道菌群是维持人体健康运转的重要“伙伴”，在营养物质合成、吸收，免疫力构建等诸多方面发挥重要作用。在遗传易感性的基础上，当外界因素和肠道菌群引起免疫失衡时可引起IBD。早期研究发现免疫缺陷的小鼠在肠道无菌的条件下，不会发生肠道炎症。动物实验及临床研究也表明抗生素及生态制剂对部分IBD患者有效。因此，肠道菌群在IBD发生、发展及预后中扮演着重要角色。

开发益生菌制剂，重建肠道微生态，恢复肠道菌群稳态，有望成为治疗炎性肠炎的一个有效手段。益生菌能通过殖民抵抗的机制，与病原菌竞争粘附位置，抵抗病原菌侵袭，调节宿主免疫反应，保护人体免疫系统。另外，益生菌比致病菌更耐酸，其可以产生有机酸等酸性物质，营造酸性微环境，从而抑制致病菌的生长。益生菌的使用可以对抗IBD患者肠道菌群的失调，从而恢复疾病导致的肠菌生态失衡，减少细菌引起的炎症、遗传毒性、致癌途径等。然而，目前益生菌的靶向治疗方法尚未在IBD中进行深入的研究。

中国专利号CN201910495866.7公开了一种复合益生菌菌剂用于制备治疗溃疡性结肠炎产品的用途，所述复合益生菌菌剂包含4株益生乳酸菌株，分别为干酪乳杆菌Zhang、动物双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8和植物乳杆菌C2，其选用的益生菌并非都来源于人体，进入宿主体内后，很难与宿主适应，定殖能力较差，功效有限；其次，适用范围有限，不能针对不同中国人的体质。因此，开发益生菌药物有重大的意义，也面临着急剧的挑战。

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供了一种干预炎性肠炎的益生菌组合物及其筛选方法和应用。

一种干预炎性肠炎的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括：Bifidobacteriumanimalis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium longum、Bifidobacteriumscardovii、Clostridium butyricum、Lactobacillus brevis、Lactobacillusdelbrueckii、Oxalobacter formigenes、Lactobacillus acidophilus和Enterococcusfaecalis。

进一步的，包括以下重量配比的益生菌：包括：1×10⁹～10¹¹CFU/mLBifidobacterium animalis、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Bifidobacterium bifidu、1×10¹⁰～10¹²CFU/mL Bifidobacterium longum、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Bifidobacterium scardovii、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Clostridium butyricum、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Lactobacillusbrevis、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Lactobacillus delbrueckii、1×10⁹～10¹¹CFU/mLOxalobacter formigenes、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Lactobacillus acidophilus和1×10¹⁰～10¹²CFU/mL Enterococcus faecalis。

本发明所涉及的微生物菌种可以通过现有技术进行培养，或者通过市购例如中国典型培养物保藏中心，在本发明中，微生物菌种为自行培养得到。

一种干预炎性肠炎的益生菌组合物的筛选方法，包括以下步骤：

S1、构建人体肠道微生物组数据库，所述数据库整合广泛宿主来源的肠道菌群宏基因组序列和物种分类组成及其相对丰度；

S2、对正常人和炎性肠炎患者的物种相对丰度信息进行组间差异分析，筛选关键的潜在致病菌；

S3、采用随机森林分析，输入步骤S2筛选得到的潜在致病菌，挑选出的对于分组贡献度最大的致病菌，正常人肠道中不存在的物种认定为炎性肠炎的致病菌，作为生物标记物；

S4、构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群，所述特异治病菌群包括抑制致病菌生长、对肠粘膜起保护作用、提高免疫能力和/或减少炎症反应的益生菌；

S5、结合步骤S1的人体肠道微生物组数据库，基于物种分类组成及其相对丰度，对特异治病菌群的配比进行优化，之后动物实验验证，得到干预炎性肠炎的益生菌组合物。

采用上述的技术方案：通过生物信息学平台对宏基因组原始序列进行解读，完成微生物物种的注释，并计算相对丰度，同时应用多种统计学方法简便、快速、准确地定性定量甄别在炎性肠炎发病过程中起关键作用的致病菌；针对致病菌寻找益生菌组合，目的性强，避免了筛选的盲目性，筛选效率高，针对性强，疗效好；而且选用的益生菌来源于人体自身，提高了益生菌在肠道的定殖率。其次，本发明采用数据库GMrepo，涵盖了目前已知的所有肠道微生物物种和功能信息，信息量庞大，筛选得到的生物标记物适用于任何不同来源、不同宿主、不同环境下人体，具有优异的普适性和信息全面性。

进一步的，步骤S1中，所述构建人体肠道微生物组数据库的具体操作如下：

S11、搜索并下载生物信息数据库正常人和炎性肠炎患者的宏基因组原始数据；

S12、对原始数据进行过滤和质量控制，获得高质量序列；

S13、进行宏基因组物种注释分析，从注释结果中提取物种的分类信息，并计算物种的相对丰度，生成一个包括所有宏基因组序列和物种分类组成及其相对丰度的人体肠道微生物组数据库。

进一步的，步骤S11中，所述生物信息数据库为人体肠道微生物组在线仓库GMrepo(http://gmrepo.humangut.info/home)，GMrepo数据库收录了253个项目，共58,903个人体肠道样本，样本量大、针对性强，且肠道微生物信息覆盖全面。

进一步的，步骤S2中，所述组间差异分析采用LEfSe分析，选取LDA得分值大于2的作为关键的潜在致病菌。

进一步的，步骤S3中，所述随机森林分析使用1000棵随机森林决策树进行建模，并以10倍交叉验证。同时结合LEfSe分析和随机森林建模分析，使鉴定得到的差异致病菌更加可靠。

进一步的，步骤S4中，所述构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群的具体操作如下：

S41、基于文献和已有数据，筛选可抑制致病菌生长的益生菌；

S42、查阅文献，筛选对肠粘膜起保护作用、提高免疫能力和/或减少炎症反应的益生菌；

S43、合并步骤S41和步骤S42的益生菌，构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群。

由于炎性肠炎机制复杂，不是单一因素引起，不仅会使机体产生炎症反应，还会损伤肠道粘膜，降低机体免疫能力。针对鉴定到的致病菌，多方面综合考虑，从整体、多方面、多角度补充有益菌群，除了补充拮抗炎性肠炎的特异治病细菌，添加了对肠粘膜起保护作用的益生菌、提高免疫能力的益生菌，以及可以减少炎症反应的益生菌，通过增强肠道黏膜屏障功能、调节肠道黏膜免疫及恢复肠道微生物群落构成等全方位入手来改善或治疗炎性肠炎，获得更好的疗效。

上述干预炎性肠炎的益生菌组合物在改善和/或治疗炎性肠炎中的应用。

本发明所达到的有益技术效果：

1.本发明综合考虑多个影响因素，除了补充拮抗炎性肠炎的特异治病细菌，还添加了对肠粘膜起保护作用的益生菌、提高免疫能力的益生菌，以及可以减少炎症反应的益生菌，通过增强肠道黏膜屏障功能、调节肠道黏膜免疫及恢复肠道微生物群落构成等全方位入手，来改善或治疗炎性肠炎，获得更好的疗效。

2.本发明通过生物信息学平台对宏基因组原始序列进行解读，完成微生物物种的注释，并计算相对丰度，同时应用多种统计学方法简便、快速、准确地定性定量甄别在炎性肠炎发病过程中起关键作用的致病菌；针对致病菌寻找益生菌组合，目的性强，避免了筛选的盲目性，筛选效率高，且疗效好；而且选用的益生菌来源于人体自身，提高了益生菌在肠道的定殖率。

3.本发明采用数据库GMrepo，涵盖了目前已知的所有肠道微生物物种和功能信息，信息量庞大，筛选得到的生物标记物适用于任何不同来源、不同宿主、不同环境下人体，具有优异的普适性和信息全面性。

附图说明

图1随机森林筛选得到的炎性肠炎的特异致病菌；图中Coefficients大于0的菌代表其在炎性肠炎中显著增加，应该抑制其生长；而Coeffecients小于0的菌，表示其在炎性肠炎中显著降低，应该增加其丰度；

图2实施例2益生菌组A的益生菌定植丰度随时间变化曲线图；

图3实施例2益生菌组B的益生菌定植丰度随时间变化曲线图；

图4实施例2益生菌组C的益生菌定植丰度随时间变化曲线图；

图5实施例2益生菌组A的致病菌定植丰度随时间变化曲线图；

图6实施例2益生菌组B的致病菌定植丰度随时间变化曲线图；

图7实施例2益生菌组C的致病菌定植丰度随时间变化曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种干预炎性肠炎的益生菌组合物的筛选方法，包括以下步骤：

S1、构建人体肠道微生物组数据库，所述数据库整合广泛宿主来源的肠道菌群宏基因组序列和物种注释信息；具体操作如下：

S11、搜索并下载生物信息数据库正常人和炎性肠炎患者的宏基因组原始数据；本实施例中，生物信息数据库为人体肠道微生物组在线仓库GMrepo，本领域的技术人员应该知道生物信息数据库也可以选用NCBI等；

S12、用Trimmomatic软件对原始数据进行过滤和质量控制，修剪和去除原始数据中的接头(adapter)和低质量序列，要求所有位置的10％分位数大于30，并用Fastqc软件评价质控后的数据，获得高质量序列；

S13、采用MetaPhIAn2软件进行宏基因组物种注释分析；本领域的技术人员应该知道，物种注释分析软件不应限于本发明提供的MetaPhIAn2软件，只要能实现物种注释分析的软件皆可实现本发明的技术方案。MetaPhIAn2的数据库里包含共得到17000多个参考基因组，包括13500个细菌和古菌，3500个病毒和110种真核生物；经过MetaPhIAn2注释处理，实现精确的物种分类分配，然后计算出物种的相对丰度，从而生成一个包括所有宏基因组序列和物种分类组成及其相对丰度的人体肠道微生物组数据库；物种注释能达到种水平的精度，以及菌株水平的鉴定和追踪；

S2、根据步骤S1的物种分类组成及其相对丰度，对正常人和炎性肠炎患者两组进行组间差异分析，本实施例中，采用LEfSe分析(LDA Effect Size)，LEfSe是一种用于发现和解释如基因、通路和分类单元等的高维度数据生物标识的分析工具，它既强调统计意义，又考虑到生物相关性，基于线性判别分析(Linear discriminant analysis，LDA)效应量(Effect size)，可以分析组间菌群差异，找出各组间显著差异的微生物物种，有助于开发生物标志物(biomaker)等研究。根据选取LEfSe分析结果，选取LDA得分值大于2的作为关键的潜在致病菌；

S3、采用随机森林分析，利用多棵决策树的集成学习策略，对样本进行训练并进行预测，输入步骤S2筛选得到的显著差异的潜在致病菌，使用1000棵随机森林决策树进行建模，并以10倍交叉验证(10-fold cross-validation)估计“基线”误差(Baseline error)的大小，挑选出来的对于分组贡献度最大的致病菌，具体结果见图1，图中横坐标大于0表示在炎性肠炎中其丰度上升，而小于0代表该菌丰度下降，前者需要被清除，后者需要添加；将上述筛选到的致病菌输入到步骤S1的数据库中，查看其在正常人群中的丰度，在正常人肠道中不存在的菌认定为炎性肠炎的致病菌，作为生物标记物；则需要抑制的细菌有Escherichia coli和Klebsiella pneumoniae；后续试验采用致病株Escherichia coliO157:H7 str.Sakai和Escherichia coli UTI89(UPEC)以及Klebsiella pneumoniae为例进行说明；

S4、构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群，所述特异治病菌群包括抑制致病菌生长、对肠粘膜起保护作用、提高免疫能力和/或减少炎症反应的益生菌；具体操作如下：

S41、基于文献和已有数据，筛选可抑制致病菌生长的益生菌，见表1；查阅文献，找到对肠道致病菌具有抑制作用的益生菌，再基于细菌拮抗原理，通过平板实验筛选拮抗致病菌的特异益生菌；进一步通过摇瓶实验排除可能促进其他致病菌生长的益生菌以及尽量避免益生菌间的相互抑制作用；

表1抑制致病菌生长的益生菌

S42、查阅文献，筛选对肠粘膜起保护作用、提高免疫能力和/或减少炎症反应的益生菌；长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌能够有效降低机体炎症反应；乳酸杆菌和双歧杆菌对肠粘膜具有保护作用；嗜酸乳杆菌具备cis-9，trans-11共轭亚油酸的合成能力，而共轭亚油酸具有多种生活活性，能有效提高机体免疫调节能力；由于炎症性肠炎是一个复杂的疾病，基于此，除了添加可以抑制炎性肠炎的致病菌的益生菌外，我们还添加多种可以对肠粘膜起保护作用的益生菌、提高免疫能力的益生菌，以及可以减少炎症反应的益生菌；在表1的基础上，再添加嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；

S43、合并步骤S41和步骤S42的益生菌，构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群；

S5、结合步骤S1的人体肠道微生物组数据库，基于物种分类组成及其相对丰度，对特异治病菌群的配比进行优化，具体见表2，之后进行动物实验验证，得到干预炎性肠炎的益生菌组合物。

本发明的益生菌组合物包括：Bifidobacterium animalis、Bifidobacteriumbifidum、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium scardovii、Clostridiumbutyricum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus delbrueckii、Oxalobacterformigenes、Lactobacillus acidophilus和Enterococcus faecalis。

进一步优化益生菌的含量：包括以下配比的益生菌：1×10⁹～10¹¹CFU/mLBifidobacterium animalis、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Bifidobacterium bifidu、1×10¹⁰～10¹²CFU/mL Bifidobacterium longum、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Bifidobacterium scardovii、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Clostridium butyricum、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Lactobacillusbrevis、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Lactobacillus delbrueckii、1×10⁹～10¹¹CFU/mLOxalobacter formigenes、1×10⁹～10¹¹CFU/mL Lactobacillus acidophilus和1×10¹⁰～10¹²CFU/mL Enterococcus faecalis。

实施例2动物体内验证实验

益生菌悬液制备：购置益生菌，使用前将其接种于液体培养基中，37℃培养16h，离(3000rpm，8min，4℃)后，弃上清，菌泥用无菌生理盐水调整菌悬液浓度为10¹²CFU/mL备用。

实验分组：空白对照组、DSS模型组、益生菌组A，益生菌组B，和益生菌组C和对比例，益生菌配比见下表1。

表1益生菌不同组别配比表

动物实验：实验小鼠(4周龄，雄性，18-22g)，在正式实验前于恒温(22℃)、恒湿、昼夜循环12h环境中适应性饲养一周，实验期间自由饮水进食，采用右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)建立小鼠溃疡结肠炎模型。将SPF级BALB/C小鼠随机分成5组，每组10只，分为空白对照组、DSS模型组和益生菌组A，益生菌组B，和益生菌组C。除空白组外，其余均用DSS造模。根据小鼠症状(表2)和组织学损伤评分标准(表3)，判断溃疡性结肠炎小鼠模型建立是否成功，对于造模成功的小鼠，分别按表1中相应配比灌胃益生菌组合物，无菌条件下取小鼠肠道内容100mg，置于灭菌后的试管中，于-80℃冻存，备宏基因组测序分析。分析在造模前后小鼠粪便中致病菌和益生菌的丰度。

表2疾病活动度的评估标准

注：-：空缺

表3急性结肠炎小鼠肠道炎症组织学评分标准

注：-：空缺

在试验期间，空白对照组小鼠粪便中菌群种类和数量无显著性变化；益生菌组小鼠粪便中益生菌数量比空白对照组中增高，且随着灌胃天数的增加，小鼠粪便中益生菌数量逐渐增高，并逐渐趋于稳定，显著高于处理组(图2，3，4)，而致病菌的数量随着灌胃天数的增加呈下降趋势(图5，6，7)。当改变本发明益生菌的配比，清除炎性肠炎致病菌效果将明显降低。如对比例Bifidobacterium scardovii和Enterococcus faecalis含量高时，益生菌种类和数量将低于益生菌组，且致病菌的数量明显高于益生菌组，第28天测定，致病株Escherichia coli O157:H7 str.Sakai的丰度为0.65，致病株Escherichia coli UTI89(UPEC)的丰度为0.73以及Klebsiella pneumoniae的丰度为0.69；而益生菌组A、B、C致病株的丰度皆低于0.6。

本发明利用益生菌清除炎性肠炎致病菌的方法，取之于人，用之于人，相比于传统的抗生素，安全、有效、性能优良，不会产生耐药性等严重的副作用。首先基于细菌间拮抗原理，筛选益生菌配方。然后基于大量文献，搜索可以对肠粘膜起保护作用的益生菌、提高免疫能力的益生菌，以及可以减少炎症反应的益生菌，合并这些益生菌，获得益生菌种类。最后，结合数据库GMrepo中正常人的肠道菌群情况，基于这些益生菌在正常人肠道的相对丰度，对益生菌配方进行优化。筛选得到的益生菌配方更可靠、普适，能更好的定殖于肠道，最大程度的发挥抗菌作用。

Claims (1)

1.一种干预炎性肠炎的益生菌组合物的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、构建人体肠道微生物组数据库，所述数据库整合广泛宿主来源的肠道菌群宏基因组序列和物种分类组成及其相对丰度，具体操作如下：

S11、搜索并下载生物信息数据库正常人和炎性肠炎患者的宏基因组原始数据；所述生物信息数据库为人体肠道微生物组在线仓库GMrepo；

S12、用Trimmomatic软件对原始数据进行过滤和质量控制，修剪和去除原始数据中的接头和低质量序列，要求所有位置的10％分位数大于30，并用Fastqc软件评价质控后的数据，获得高质量序列；

S13、采用MetaPhIAn2软件进行宏基因组物种注释分析，从注释结果中提取物种的分类信息，并计算物种的相对丰度，生成一个包括所有宏基因组序列和物种分类组成及其相对丰度的人体肠道微生物组数据库；

S2、根据步骤S1的物种分类组成及其相对丰度，采用LEfSe分析工具对正常人和炎性肠炎患者的物种相对丰度信息进行组间差异分析，根据选取LEfSe分析结果，选取LDA得分值大于2的筛选作为关键的潜在致病菌；

S3、采用随机森林分析，利用多棵决策树的集成学习策略，对样本进行训练并进行预测，输入步骤S2筛选得到的潜在致病菌，使用1000棵随机森林决策树进行建模，并以10倍交叉验证估计“基线”误差的大小，挑选出的对于分组贡献度最大的致病菌；将上述筛选到的致病菌输入到步骤S1的数据库中，查看其在正常人群中的丰度，在正常人肠道中不存在的菌种认定为炎性肠炎的致病菌，作为生物标记物；

S4、构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群，所述特异治病菌群包括抑制致病菌生长、对肠粘膜起保护作用、提高免疫能力和/或减少炎症反应的益生菌，具体操作如下：

S41、基于文献和已有数据，筛选可抑制致病菌生长的益生菌；查阅文献，找到对肠道致病菌具有抑制作用的益生菌，再基于细菌拮抗原理，通过平板实验筛选拮抗致病菌的特异益生菌；进一步通过摇瓶实验排除促进其他致病菌生长的益生菌，并避免益生菌间的相互抑制作用；

S42、查阅文献，筛选对肠粘膜起保护作用、提高免疫能力和/或减少炎症反应的益生菌；

S43、合并步骤S41和步骤S42的益生菌，构建拮抗炎性肠炎的特异治病菌群；

S5、结合步骤S1的人体肠道微生物组数据库，基于物种分类组成及其相对丰度，对特异治病菌群的配比进行优化，之后动物实验验证，得到干预炎性肠炎的益生菌组合物。

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