CN116370507A - 协同细菌组合物以及其制造方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有微生物种群的治疗性组合物，其用于预防、治疗以及减轻与例如人类的哺乳动物个体的菌群失调相关的症状。

Description

协同细菌组合物以及其制造方法和用途

本申请是申请日为2014年11月25日、申请日号为201480073118.5、名称为“协同细菌组合物以及其制造方法和用途”的专利申请的分案申请。

相关申请案

本申请案涉及2013年11月25日申请的题为“协同细菌组合物以及其制造方法和用途(SYNERGISTIC BACTERIAL COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCTION AND USETHEREOF)”的共同拥有的国际申请案第PCT/US13/71758号，它们都要求2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,518号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,519号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,520号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,521号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,522号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,524号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,515号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,517号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,525号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,526号、2012年11月23日申请的美国临时专利申请案第61/729,527号；2013年11月25日申请的美国临时专利申请案第61/908,698号；2013年11月25日申请的美国临时专利申请案第61/908,702号；以及2013年11月26日申请的美国专利申请案第14/091,201号的优先权，其全部披露内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

本申请案要求2013年11月25日申请的题为“协同细菌组合物以及其制造方法和用途”的美国临时专利申请案第61/908,698号；2013年11月25日申请的题为“成分确定的细菌组合物以及其制造方法和用途”的美国临时专利申请案第61/908,702号；2014年5月28日申请的题为“协同细菌组合物以及其制造方法和用途”的美国临时专利申请案第62/004,183号；以及2014年5月28日申请的题为“协同细菌组合物以及其制造方法和用途”的美国临时专利申请案第62/004,187号的权益，其全部披露内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

序列表的引用

本申请案包括以电子方式作为文本文件提交的序列表，所述文本文件名为28155PCT_sequencelisting.txt，创建于2014年11月24日，大小为4,196,247字节。所述序列表以引用的方式并入。

背景技术

微生物会定殖在哺乳动物的胃肠(GI)道中、皮肤上以及其它上皮和组织生态位(例如口腔、眼表面和阴道)中。胃肠道中生存有丰富且多样的微生物群落。它是一个复杂的系统，为许多不同物种或生物体(包括不同的细菌系)群落提供环境或生态位。数百种不同物种可在健康个体的胃肠道中形成共生的群落，且生物体的这一补充从出生时发展到最终到3岁时形成功能上成熟的微生物种群。这些种群中的微生物菌株之间的相互作用以及微生物与宿主(例如宿主免疫系统)之间的相互作用使群落结构成形，伴有对影响微生物分布的资源的可利用性和竞争。此类资源可以是食物、位置以及对生长空间或微生物可能附接的物理结构的可获得性。举例来说，宿主膳食与胃肠道菌丛成形有关。

健康微生物丛为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的定殖抗性、必需营养物生物合成和吸收、以及维持健康肠上皮的免疫刺激和经适当控制的全身免疫性。在‘菌群失调’或共生被破坏的环境中，微生物丛功能可能损失或被扰乱，引起对病原体的易感性升高、代谢特征改变或诱导可能导致局部或全身炎症或自体免疫性的促炎性信号。因此，肠道微生物丛在许多疾病和病症(包括消化道的多种病原性感染)的发病机制中起重要作用。举例来说，个体在正常肠道微生物丛已经由于使用广谱抗生素而被扰乱时会变得更容易患上病原性感染。这些疾病和病症中的一些是会显著降低个体生活质量并且最终可能致命的慢性病况。

粪便移植已显示有时是患有严重或难治愈胃肠感染和其它病症的有效治疗，所述治疗用多种微生物阵列重新填充肠道，所述微生物阵列通过产生对关键病原体的增殖和存活有害的生态环境来对其进行控制。已证实此类方法可能降低宿主对感染的敏感性。然而，粪便移植一般仅用于复发性病例，因为其具有在宿主之间传递感染性或过敏原性媒介的可能性，涉及到数百种未知菌株从供体潜在传递到患者，并且难以大规模执行。另外，粪便移植本质上非标准化并且可能在任何给定捐赠中可能传递不同所需和/或非所需材料。因此，需要可用于降低对感染的易感性和/或促进健康肠道微生物丛恢复的成分确定的组合物。

另外，从业者需要使用粪便移植对当前在实验基础上治疗的病症进行安全并且可重现的治疗。

发明内容

为了满足安全需要，可以通过诱发健康GI微生物组来调节病症的可重现治疗，并且为了治疗与GI微生物组有关的疾病，申请人已经设计出具有多种功能特性的经分离细菌菌株的细菌组合物，具体来说适用于基于与那些细菌菌株有关的申请人发现和关于那些菌株和那些菌株的组合的特性的分析和洞察治疗菌群失调(例如使GI微生物组恢复到健康状态)以及治疗与肠道中存在的感染或微生物物种不平衡有关的病症的那些细菌组合物，导致本文所披露的本发明。

在第一方面中，提供的是包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物至少包含能够形成孢子的第一类型的经分离细菌、能够形成孢子的第二类型的经分离细菌和任选地能够形成孢子的第三类型的经分离细菌，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型不相同，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少两个能够协同减少和/或抑制至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。在一些实施例中，细菌组合物包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种类型的能够形成孢子的经分离细菌。在其它实施例中，细菌组合物包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种类型的不含至少一种孢子形成相关基因的经分离细菌。在其它实施例中，细菌组合物包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种类型的孢子形式的经分离细菌。在其它实施例中，细菌组合物包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种类型的营养体型经分离细菌。在其它实施例中，细菌组合物包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种类型的孢子形式的经分离细菌，并且其中细菌组合物进一步包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种类型的营养体型经分离细菌。在其它实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌并且至少约20％经分离细菌能够形成孢子或为孢子形式。在其它实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，并且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子或为孢子形式。在其它实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以近似相等的浓度存在于组合物中。在其它实施例中，第一类型和第三类型以近似相等的浓度存在于组合物中。在其它实施例中，第二类型和第三类型以近似相等的浓度存在于所述组合物中。在其它实施例中，第一类型以至少约150％第二类型和/或第三类型的浓度存在于所述组合物中。在其它实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以至少约150％第三类型的浓度独立地存在于组合物中。在其它实施例中，组合物基本上由介于两种与约二十种类型的之间的经分离细菌组成，其中至少两种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子。在其它实施例中，至少两种类型的经分离细菌为孢子形式。在其它实施例中，第一、第二和第三类型独立地选自表1。在其它实施例中，第一、第二和第三类型包含操作分类单位(OTU)区别。在其它实施例中，OTU区别包含低于约95％一致性的16SrRNA序列相似性。在其它实施例中，第一、第二和第三类型独立地包含如下细菌，其包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

在另一方面中，所提供的是包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物包含第一类型的经分离细菌；第二类型的经分离细菌；以及第三类型的经分离细菌，其中第一、第二和第三类型中的至少一个能够形成孢子，其中第一、第二和第三类型不相同，并且其中第一、第二和第三类型中的至少两个的组合对至少一种类型的病原性细菌具有一致性。在一些实施例中，第一、第二和第三类型的组合能够对病原性细菌具有抑制性。在其它实施例中，第一、第二和第三类型的组合能够对病原性细菌具有细胞毒性或细胞生长抑制性。在其它实施例中，第一、第二和第三类型的组合能够对病原性细菌具有细胞毒性或细胞生长抑制性。在其它实施例中，第一、第二和第三类型的组合能够抑制浓度至少等于第一、第二和第三类型的组合的浓度的病原性细菌的增殖。在其它实施例中，病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌(Yersinia)、弧菌(Vibrio)、密螺旋体(Treponema)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、志贺杆菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、立克次体(Rickettsia)、假单胞菌(Pseudomonas)、奈瑟氏菌(Neisseria)、支原体(Mycoplasma)、分枝杆菌(Mycobacterium)、李斯特菌(Listeria)、钩端螺旋体(Leptospira)、军团菌(Legionella)、螺旋杆菌(Helicobacter)、嗜血杆菌(Haemophilus)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、埃希氏杆菌(Escherichia)、肠球菌(Enterococcus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、棒杆菌(Corynebacterium)、梭菌(Clostridium)、衣原体(Chlamydia)、嗜衣体(Chlamydophila)、弯曲杆菌(Campylobacter)、布鲁氏菌(Brucella)、疏螺旋体(Borrelia)以及博德特菌(Bordetella)。在其它实施例中，第一、第二和第三类型协同地相互作用。在其它实施例中，第一、第二和第三类型中的至少一个能够独立地形成孢子。在其它实施例中，第一、第二和第三类型中的至少两个能够独立地形成孢子。在其它实施例中，第一、第二和第三类型能够独立地形成孢子。

在其它实施例中，其中第一、第二和第三类型能够功能性填充投予组合物的人类个体的胃肠道。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含预防胃肠道的菌群失调。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含治疗胃肠道的菌群失调。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含降低胃肠道的菌群失调的严重度。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含减轻所述胃肠道的菌群失调的一种或多种症状。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含预防病原性细菌在胃肠道定殖。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含减少病原性细菌在胃肠道定殖。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含减少胃肠道中的一种或多种类型的病原性细菌的数目。在其它实施例中，胃肠道的功能性填充包含增加胃肠道中的一种或多种非病原性细菌的数目。还提供包含本文提供的细菌组合物的单个剂量单元，例如包含至少1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或1×10¹²菌落形成单位(CFU)的活细菌的剂量单元。还提供包含有效量的本文所提供的组合物并且进一步包含有效量的抗细菌剂的药物配制品、包含有效量的细菌组合物并且进一步包含有效量的抗真菌剂的药物配制品、包含有效量的细菌组合物并且进一步包含有效量的抗病毒剂的药物配制品，以及包含有效量的细菌组合物并且进一步包含有效量的抗寄生虫剂的药物配制品。

在另一方面中，提供包含向有需要的人类个体投予有效量的细菌组合物并且进一步包含向所述人类个体投予有效量的抗生物剂的方法。在一些实施例中，细菌组合物和抗生物剂同时投予。在其它实施例中，细菌组合物在投予抗生物剂之前投予。在其它实施例中，提供人类个体的胃肠道中存在的病原性细菌的数目经一段时间不会可检测地增加或可检测地减少的方法。在其它实施例中，人类个体被诊断为患有胃肠道菌群失调。在其它实施例中，人类个体被诊断为感染有选自由以下组成的群组的病原性细菌：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、假单胞菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、肠球菌、克雷伯氏菌、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、布鲁氏菌、疏螺旋体以及博德特菌。在其它实施例中，抗细菌剂在投予细菌组合物之前向人类个体投予。在其它实施例中，人类个体的胃肠道中存在的或从其中排泄的病原性细菌的数目在投予细菌组合物两周内可检测地减少。

在另一方面中，提供功能性填充人类个体的胃肠道的方法，其包含在使得第一、第二和第三类型功能上填入人类个体的胃肠道的条件下向个体投予有效量的本发明的细菌组合物。在一些实施例中，细菌组合物经口投予、经直肠投予或经口和经直肠投予的组合。在其它实施例中，细菌组合物经表面或经鼻投予或吸入。

还提供制备可食用产品的方法，其包含使本发明的细菌组合物与可食用载剂组合，其中可食用产品基本上不含不可食用材料。

一方面，提供包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物至少包含能够形成孢子的第一类型的经分离细菌和能够形成孢子的第二类型的经分离细菌，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型不相同，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个能够减少和/或抑制至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌，并且所述经分离细菌中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含i)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的能够形成孢子的经分离细菌，ii)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的并非已知能够形成孢子的经分离细菌，或iii)i)和ii)的任何组合。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以近似相等的浓度或活动水平存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以并非基本上相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型以至少约150％第二类型的浓度存在于组合物中，或其中第二类型以至少约150％第一类型的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，组合物基本上由以下组成：i)介于两种与约二十种类型之间的经分离细菌，其中至少两种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子；ii)介于两种与约二十种类型之间的经分离细菌，其中至少两种类型的经分离细菌并非已知能够形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌选自表1。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选的第三类型的经分离细菌包含操作分类单位(OTU)区别。在一个实施例中，OTU区别包含低于约95％一致性的16S rDNA序列相似性。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌独立地包含如下细菌，其包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合为：i)细胞毒性的，ii)细胞生长抑制性的，iii)能够降低病原性细菌的生长，iv)能够抑制病原性细菌的生长，v)能够降低病原性细菌的定殖，vi)能够抑制病原性细菌的定殖，或vii)i)到vi)的任何组合。在一个实施例中，组合能够抑制浓度至少等于第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约两倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约十倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够在病原性细菌存在下增殖。在一个实施例中，病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以抑制病原性细菌。在一个实施例中，组合物包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。

另一方面，提供包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物至少包含第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选的第三类型的经分离细菌，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型中的仅一个能够形成孢子，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个能够减少至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。

另一方面，提供包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物至少包含第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选的第三类型的经分离细菌，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型不是孢子或已知能够形成孢子，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个能够减少至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。

在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个能够降低至少一种类型的病原性细菌的生长速率。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个对至少一种类型的病原性细菌具有细胞毒性。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个对至少一种类型的病原性细菌具有细胞生长抑制性。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型选自表1。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型包含不同物种。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型包含不同属。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型包含不同科。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型包含不同目。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。

另一方面，提供包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物至少包含第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌，其中：i)第一类型、第二类型和任选的第三类型能够独立地形成孢子；ii)第一类型、第二类型和任选的第三类型中的仅一个能够形成孢子；或iii)第一类型和第二类型都不能形成孢子，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型不相同，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型能够功能性填充投予组合物的人类个体的胃肠道。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含预防胃肠道菌群失调。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含治疗胃肠道菌群失调。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减轻胃肠道菌群失调的严重程度。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减轻胃肠道菌群失调的一种或多种症状。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含预防病原性细菌在胃肠道生长和/或定殖。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减少病原性细菌在胃肠道生长和/或定殖。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减少胃肠道中的一种或多种类型的病原性细菌的数目。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含增加胃肠道中的一种或多种非病原性细菌的数目。在一个实施例中，细菌组合物包含0、1、2、3种或大于3种类型的能够形成孢子的经分离细菌。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的能够形成孢子的经分离细菌。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约7种类型的能够形成孢子的经分离细菌。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以并非基本上相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以近似相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型以至少约150％第二类型的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第二类型以至少约150％第一类型的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中至少一种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌选自表1。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选的第三类型的经分离细菌包含操作分类单位(OTU)区别。在一个实施例中，OTU区别包含低于约95％一致性的16SrDNA序列相似性。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌独立地包含如下细菌，其包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合对病原性细菌具有细胞毒性或细胞生长抑制性。在一个实施例中，组合能够抑制浓度至少等于第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约两倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约十倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以对病原性细菌具有细胞毒性。在一个实施例中，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以对病原性细菌具有细胞生长抑制性。

另一方面，提供单个剂量单元，其包含本发明的组合物。在一个实施例中，剂量单位包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的孢子或营养细菌细胞。在一个实施例中，剂量单元包含药学上可接受的赋形剂、肠溶包衣或其组合。在一个实施例中，剂量单元进一步包含选自以下的药物：皮质类固醇、美沙拉嗪(mesalazine)、美沙拉明(mesalamine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、柳氮磺胺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A(cyclosporin A)、巯基嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松(prednisone)、甲胺喋呤(methotrexate)、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、用于鼻炎的抗胆碱激导性药物、抗胆碱激导性解充血剂、肥大细胞稳定剂、单株抗IgE抗体、疫苗以及其组合，其中所述药物以有效调节至少一种病原体的量和/或活性的量存在。在一个实施例中，所述剂量单元经配制用于经口投予、经直肠投予、或经口与经直肠投予的组合，或者经配制用于经表面、经鼻或吸入投予。在一个实施例中，剂量单位包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。

另一方面，提供试剂盒，其在一个或多个容器中包含：基本上不含活营养细菌细胞的第一类型的细菌孢子的第一经纯化种群；基本上不含活营养细菌细胞的第二类型的细菌孢子的第二经纯化种群；以及任选地基本上不含活营养细菌细胞的第三类型的细菌孢子的第三经纯化种群，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型的细菌孢子不相同，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型的细菌孢子当共存于有需要的人类个体的胃肠道的目标区域中时，能够功能性填充胃肠道。在一个实施例中，第一经纯化种群和第二经纯化种群存在于单个容器中。在一个实施例中，第一经纯化种群、第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群存在于两个或任选地三个容器中。在一个实施例中，第一经纯化种群和第二经纯化种群经冻干或基本上脱水。在一个实施例中，试剂盒在一个或多个容器中进一步包含有效量的抗细菌剂、有效量的抗病毒剂、有效量的抗真菌剂、有效量的抗寄生虫剂或其于一个或多个容器中的组合。在一个实施例中，试剂盒进一步包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。在一个实施例中，第一经纯化种群、第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。

还提供医药配制品，其包含有效量的本发明的组合物，并且进一步包含有效量的抗细菌剂、有效量的抗真菌剂、有效量的抗病毒剂、有效量的抗寄生虫剂。

还提供可食用产品，其包含第一类型的细菌孢子的第一经纯化种群、第二类型的细菌孢子的第二经纯化种群和任选地第三类型的细菌孢子的第三经纯化种群，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型的细菌孢子不相同，其中可食用产品基本上不含活营养细菌细胞，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型的细菌孢子当向有需要的人类个体投予时能够功能性填充人类个体的胃肠道。在一个实施例中，可食用产品包含食品或食品添加剂、饮料或饮料添加剂或医疗食品。在一个实施例中，可食用产品包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的活孢子。在一个实施例中，可食用产品包含选自表1的第一类型的细菌孢子和第二类型的细菌孢子，或其中第一类型的细菌孢子和第二类型的细菌孢子独立地包含细菌孢子，所述细菌孢子包含与选自表1的细菌中所存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。在一个实施例中，第一经纯化种群、第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。

还提供包含向有需要的人类个体投予有效量的细菌组合物的方法，所述细菌组合物至少包含第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选地第三类型的经分离细菌，其中：第一类型、第二类型和任选的第三类型能够独立地形成孢子；第一类型、第二类型和任选的第三类型中仅一个能够形成孢子；或第一类型第二类型和任选的第三类型都不能形成孢子，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型不相同，并且其中第一类型、第二类型和任选的第三类型中的至少一个对人类个体的胃肠道中存在的病原性细菌发挥抑制性作用，使得胃肠道中存在的病原性细菌的数目经一段时间不会可检测地增加或可检测地减少。在一个实施例中，组合物包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。在一个实施例中，人类个体被诊断为患有胃肠道菌群失调。在一个实施例中人类个体被诊断为感染有选自由以下组成的群组的病原性细菌：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在一个实施例中，细菌组合物与i)抗生素、ii)益生元、或iii)i)和ii)的组合同时投予。在一个实施例中，细菌组合物在投予i)抗生素、ii)益生元、或iii)i)和ii)的组合之前投予。在一个实施例中，细菌组合物在投予i)抗生素、ii)益生元、或iii)i)和ii)的组合之后投予。在一个实施例中，人类个体的胃肠道中所存在的或从其中排泄的病原性细菌的数目在投予细菌组合物的一个月内、两周内或一周内可检测地减少。在一个实施例中，人类个体的胃肠道中所存在的或从其中排泄的病原性细菌的数目在投予所述细菌组合物的三天内、两天内或一天内可检测地减少。在一个实施例中，人类个体在投予细菌组合物的一个月内、两周内、一周内、三天内或一天内可检测地不含病原性细菌。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含：i)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的能够形成孢子的经分离细菌，ii)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的并非已知能够形成孢子的经分离细菌，或iii)i)和ii)的任何组合。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1种能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1种不能形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌，其中i)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌能够形成孢子，ii)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌不能形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以近似相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以并非基本上相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型以至少约150％第二类型的浓度存在于组合物中，或其中第二类型以至少约150％第一类型的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中至少两种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子。在一个实施例中，组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中至少两种类型的经分离细菌不能形成孢子。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌选自表1。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选的第三类型的经分离细菌包含操作分类单位(OTU)区别。在一个实施例中，OTU区别包含低于约95％一致性的16S rDNA序列相似性。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌独立地包含如下细菌，其包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合对病原性细菌具有细胞毒性或细胞生长抑制性。在一个实施例中，组合能够抑制浓度至少等于第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约两倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约十倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以对病原性细菌具有细胞毒性。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以对病原性细菌具有细胞生长抑制性。

还提供功能上填充人类个体的胃肠道的方法，其包含在使得第一类型、第二类型和任选的第三类型功能上填充人类个体的胃肠道的条件下向个体投予有效量的细菌组合物，所述细菌组合物至少包含第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选地第三类型的经分离细菌，其中i)第一类型、第二类型和任选的第三类型能够独立地形成孢子；ii)第一类型、第二类型和任选的第三类型中仅一个能够形成孢子或iii)第一类型、第二类型和任选的第三类型都不能形成孢子，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型不相同。在一个实施例中，组合物包含表4a或表4b的任一行中所述的细菌的组合，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。在一个实施例中，细菌组合物经口投予、经直肠投予、或经口与经直肠投予的组合。在一个实施例中，细菌组合物经表面或经鼻投予或吸入。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌选自表1。在一个实施例中，细菌组合物基本上由孢子组成，其中孢子包含第一类型的经分离细菌的孢子、第二类型的经分离细菌的孢子和任选的第三类型的经分离细菌的孢子。在一个实施例中，第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌独立地包含细菌孢子，所述细菌孢子包含与选自表1的细菌中所存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含预防胃肠道菌群失调。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含治疗胃肠道菌群失调。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减轻胃肠道菌群失调的严重程度。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减轻胃肠道菌群失调的一种或多种症状。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含预防病原性细菌在胃肠道中定殖。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含减少病原性细菌在胃肠道定殖和/或生长。在一个实施例中，其中胃肠道的功能性填充包含减少胃肠道中的一种或多种类型的病原性细菌的数目。在一个实施例中，胃肠道的功能性填充包含增加胃肠道中的一种或多种非病原性细菌的数目。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、5、7或9种类型的能够形成孢子的经分离细菌。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且经分离细菌中的至少20％能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。在一个实施例中，细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌，其中i)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌能够形成孢子，ii)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌不能形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以近似相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型以并非基本上相等的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，第一类型以至少约150％第二类型的浓度存在于组合物中，或其中第二类型以至少约150％第一类型的浓度存在于组合物中。在一个实施例中，所述组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中i)至少一种类型的经分离细菌能够形成孢子；ii)至少一种类型的经分离细菌不能形成孢子，或iii)i)和ii)的组合。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合对病原性细菌具有抑制性。在一个实施例中，组合降低病原性细菌的生长速率。在一个实施例中，组合对病原性细菌具细胞生长抑制性或细胞毒性。在一个实施例中，组合能够抑制浓度至少等于第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的病原性细菌的生长。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约两倍的病原性细菌的生长。在一个实施例中，组合能够抑制浓度为第一类型、第二类型和任选的第三类型的组合的浓度的至少约十倍的病原性细菌的增殖。在一个实施例中，病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以减少或抑制病原性细菌的生长。在一个实施例中，第一类型、第二类型和任选的第三类型协同地相互作用以减少或抑制病原性细菌的定殖。在一个实施例中，所述方法包含向人类个体投予单个剂量单元，所述单个剂量单元包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹个或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的活细菌。在一个实施例中，剂量单元包含基本上呈孢子形式的细菌群体。在一个实施例中，剂量单元包含药学上可接受的赋形剂和/或肠溶包衣。在一个实施例中，单位剂量经配制用于经口投予、经直肠投予或经口与经直肠投予的组合。在一个实施例中，单位剂量经配制用于经表面或经鼻投予或用于吸入。

另一方面，提供减少人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目的方法，其包含在使得所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述医药配制品约一个月内减少的条件下，向所述个体投予有效量的医药配制品，所述医药配制品包含有效量的根据权利要求1、21、22或31中任一项所述的组合物，且进一步包含有效量的抗微生物剂。在一个实施例中，所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述医药配制品约两周内减少。在一个实施例中，所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述医药配制品约一周内减少。在一个实施例中，所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述医药配制品约三天内减少。在一个实施例中，所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述医药配制品约一天内减少。在一个实施例中，抗微生物剂包含抗细菌剂。在一个实施例中，抗微生物剂包含抗真菌剂。在一个实施例中，抗微生物剂包含抗病毒剂。在一个实施例中，抗微生物剂包含抗寄生虫剂。

另一方面，提供制备可食用产品的方法，其包含使可食用载剂与至少包含第一类型的经分离细菌的第一经纯化种群、至少包含第二类型的经分离细菌的第二经纯化种群和任选地至少包含第三类型的经分离细菌的第三经纯化种群组合，其中：i)第一类型、第二类型和任选的第三类型能够独立地形成孢子；ii)第一类型、第二类型和任选的第三类型中仅一个能够形成孢子或iii)第一类型、第二类型和任选的第三类型都不能够形成孢子，其中第一类型、第二类型和任选的第三类型的细菌不相同，其中可食用产品基本上不含不可食用材料。在一个实施例中，第一经纯化种群、第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群中的至少一个基本上由活孢子组成。在一个实施例中，第一经纯化种群、第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群基本上由活孢子组成。在一个实施例中，可食用产品基本上不含活营养细菌细胞。在一个实施例中，活孢子在所述可食用产品被有需要的人类个体食用时能够功能性填充所述人类个体的胃肠道。在一个实施例中，可食用产品包含食品或食品添加剂。在一个实施例中，可食用产品包含饮料或饮料添加剂。在一个实施例中，可食用产品包含医疗食品。在一个实施例中，可食用产品包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的活孢子。在一个实施例中，第一经纯化种群、第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群包含表4a或表4b的任一行，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。在一个实施例中，孢子为选自表1的细菌。在一个实施例中，第一经纯化种群和第二经纯化种群独立地包含细菌孢子，所述细菌孢子包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

还提供降低个体的胃肠道中的病原体丰度的方法，其包含以治疗有效量投予组合物，并且使细菌组合物与病原体在个体的胃肠道中竞争。

进一步提供治疗腹泻的方法，其包含以治疗有效量投予细菌组合物，并且使细菌组合物减轻病原体在个体胃肠道中的腹泻作用。在一个实施例中，所述病原性细菌选自由以下各者组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在一个实施例中，病原体是艰难梭菌(Clostridium difficile)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、病原性大肠杆菌(Escherichia coli)或万古霉素耐药性肠球菌属(vancomycin-resistant Enterococcus spp.)。在一个实施例中，所述病原体是艰难梭菌。在一个实施例中，所述组合物经口投予。在一个实施例中，组合物包含表4a或表4b的任一行，或表4a的具有++++或+++标示的任一行，或表4a的具有第75百分位标示的任一行中所述的细菌的组合。

在一些方面中，本发明涉及包含选自表10的网状生态的组合物。在一些实施例中，网状生态包含表10中所提供的网状进化枝。在其它实施例中，网状生态包含表10中所提供的网状OTU。在一些情况下，组合物包含尾叶布劳特氏菌(Blautia producta)、双孢梭菌(Clostridium disporicum)、无害梭菌(Clostridium innocuum)、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei)、奥比赛登梭菌(Clostridium orbiscindens)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)以及毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)5_1_57FAA。在一些实施例中，组合物组合物有效用于治疗菌群失调的至少一种病征或症状，例如有效用于减轻与艰难梭菌、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumonii)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)或万古霉素耐药性肠球菌(VRE)有关的感染或菌群失调的至少一种病征或症状。

另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含选自表4a、表4b或表12中鉴别的异三聚体的细菌异三聚体，使得异三聚体在CivSim分析中可例如抑制病生菌的生长。

在一些方面中，本发明涉及一种组合物，其包含选自表14、表15、表16、表17、表17、表18、表19、表20或表21中鉴别的异三聚体的细菌异三聚体，使得异三聚体的生物体可扩增和/或移入人类胃肠道中。在一些实施例中，可在向患有菌群失调的人类投予组合物之后发生移入和/或扩增。在一些实施例中，菌群失调与人类胃肠道中存在艰难梭菌有关。

以下的说明书中将部分阐述另外的目的和优点，并且所述目的和优点将部分从描述中显而易见，或者可通过对实施例的实践学习。所述目的和优点将借助于在所附权利要求书中特别指出的元素和组合来实现以及获得。

应理解，前述一般描述和以下详细描述都只是示范性和解释性的并且不限制权利要求书。

并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的随附图式图示了几个实施例，并且与具体实施方式一起用以进一步阐明实施例。

表格简要说明

表1为对属、种和系统发生进化枝作出分类分配的操作分类单位(OTU)的列表。细菌OTU的进化枝成员资格是基于16S序列数据。进化枝是基于系统发生树的布局确定，所述系统发生树是使用系统发生学领域普通技术人员熟悉的最大似然法从全长16S序列建构。建构进化枝以确保指定进化枝中的全部OTU：(i)彼此在指定数目的引导支持节点内，和(ii)在5％遗传相似性内。同一进化枝内的OTU可以基于16S-V4序列数据根据与不同进化枝中的OTU不同的基因学和系统发生学区别，而同一进化枝内的OTU紧密相关。同一进化枝内的OTU进化上紧密相关并且可以使用或不使用16S-V4序列数据彼此区别。同一进化枝的成员由于其进化上的相互关系而在例如人类肠道中存在的微生物生态学中起类似功能作用。用同一进化枝的一种物种取代另一物种的组合物可能具有保守生态功能并且因此适用于本发明。全部OTU根据其形成孢子的假定能力标识而与其是病原体还是病生菌无关(参看针对“病生菌”的描述的定义)。NIAID(国立过敏反应与感染性疾病研究所)优先病原体标示为‘A类’、‘B类’或‘C类’，并且机会病原体标示为‘OP’。不是发病因素或作为病原体存在的能力未知的OTU标示为‘N’。‘SEQ ID号’指示序列表文件中的OTU识别码并且‘公共DB登记号’指示公共序列储存库中的OTU识别码。

表2提供系统发生进化枝和其使用16S全长和V4测序确定的成员。

表3为所提供的细菌组合物适用的人类疾病、病症和病况的列表。

表4a.提供体外测试的代表性本发明的组合。

表4b.提供体外测试的代表性本发明的组合。

表5提供在CivSim分析中和体内测试代表性本发明的三元OTU组合的数据。

表6提供15种成员的细菌组合物体外抑制VRE的能力的数据。

表7提供15种成员的细菌组合物体外抑制克雷伯氏肺炎杆菌的能力的数据。

表8提供15种成员的细菌组合物体外抑制摩氏摩根菌的能力的数据。

表9提供表明预防性鼠类模型中本发明的组合针对艰难梭菌感染的功效的数据。

表10.提供预防性鼠类模型中针对艰难梭菌感染测试的示范性本发明的组合。

表11.提供与用于治疗患有艰难梭菌相关腹泻疾病的患者的细菌组合物有关的细菌OTU，以及包含进行移入和生态扩增以在治疗后在患者中形成更多样微生物生态学的OTU的OTU。包含经增强生态学的OTU在治疗之前在患者体内不存在和/或以极低频率存在，使得其不包含大量总微生物运输并且基因组和/或微生物分析法不可检测。作为移入和经增强生态学成员的OTU通过表征处理后相对丰度增加的OTU来鉴别并且分别为：(i)存在于乙醇处理的孢子制剂中并且不存在于患者预治疗中，或(ii)不存在于乙醇处理的孢子制剂中，但用制剂处理之后其相对丰度由于处理形成的有利生长条件而随时间增加。值得注意的是，扩增OTU可以在个体中从低频储集器生长或从例如饮食的外源性源引入。标示出处理细菌组合物中包含“核心”组合物的OTU。

表12提供如通过平均对数抑制大于零假设的99％信赖区间(C.I.)(参看实例6，++++)测量展现针对艰难梭菌的抑制并且在至少一个孢子生态处理中或用组合物处理之后的人类个体微生物组中鉴别出来的细菌组合物。

表13提供向患有艰难梭菌相关腹泻疾病的个体投予的细菌疗法中所包含的示范性4-mer到10-mer细菌组合物。

表14提供用孢子生态组合物处理之后在至少一名患者(对处理起反应的29名)中移入或扩增的示范性三元OTU。各三元组合在全部剂量中或三元组合的生物体在处理后的一段时间内一起存在于全部个体中。

表15提供至少一名个体中移入的示范性OTU。投予的孢子生态组合物的95％剂量中存在所述三元组合。

表16提供用孢子生态组合物处理之后在至少一名患者中扩增的示范性OTU。三元组合在一些处理后时间点一起存在于至少75％个体中。

表17提供存在于至少75％所投予孢子生态组合物的剂量中的示范性OTU组合。含有所列三元组合的全部投予剂量使OTU梭菌属SM4/1在给予含有三元组合物的剂量的个体中扩增或移入。

表18提供存在于至少75％所投予孢子生态组合物的剂量中的示范性三元OTU组合。含有所列三元组合的全部投予剂量使OTU梭菌属SSC/2在给予含有三元组合的组合物的个体中扩增或移入。

表19提供存在于至少75％所投予孢子生态组合物的剂量中的示范性三元OTU组合。含有所列三元组合的全部投予剂量使OTU梭菌属NML 04A032在给予含有三元组合的组合物的个体中扩增或移入。

表20提供存在于至少75％所投予孢子生态组合物的剂量中的示范性三元OTU组合。含有所列三元组合的全部投予剂量使OTU梭菌属NML 04A032、酸奶瘤胃球菌(Ruminococcus lactaris)和扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)在给予含有三元组合的组合物的个体中扩增或移入。

表21提供存在于至少75％所投予孢子生态组合物的剂量中的示范性三元OTU组合。含有所列三元组合的全部投予剂量使OTU直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、颤杆菌属G2(Oscillibacter sp.G2)、酸奶瘤胃球菌和扭链瘤胃球菌在给予含有三元组合的组合物的个体中扩增或移入。

表22提供本发明的实施例的OTU中存在的生物体的替代名称。

附图说明

图1示出了示范性系统发生树以及OTU和进化枝的关系。

A、B、C、D和E表示OTU，也称为树中的叶。进化枝1包含OTU A和B，并且进化枝2包含OTU C、D和E，并且进化枝3为包含OTU D和E的进化枝2的亚群。界定树中的进化枝的树中的节点可以统计学支持或非统计学支持。进化枝内的OTU比另一进化枝中的OTU彼此更类似；进化枝分配的稳定性由进化枝中在OTU上游的节点的统计支持程度表示。

图2提供16S rDNA基因的示意图并且指示根据本发明的实施例的高变区1-9(V1-V9)的坐标。基于使用由Brosius等人,来自大肠杆菌的16S核糖体RNA基因(16S rRNA)的完整核苷酸序列(Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene(16SrRNA)from Escherichia coli),《美国国家科学院院刊》(PNAS)75(10):4801-4805(1978)定义的大肠杆菌系统命名法的编号，V1-V9的坐标分别是69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294以及1435-1465。

图3以粗体突出显示了上文由Brosius等人描述的示范性参考大肠杆菌16S序列中每一高变区的核苷酸序列。

图4提供体外测试的本代表性发明组合以及其对病原体生长的各别抑制。

图5示出了验证根据本发明的实施例的网状生态学细菌组合物的功效的体内仓鼠艰难梭菌复发预防模型。

图6示出了用微生物孢子生态预处理和处理后，患有复发性艰难梭菌相关疾病的人类个体的肠道中总微生物多样性增加(使用Chao-1多样性指数测量)。

图7示出了用微生物孢子生态预处理和处理后，患有复发性艰难梭菌相关疾病的人类个体的肠道中微生物组的组成改变(使用布雷-柯蒂斯PCoA度量标准(Bray-CurtisPCoA metric)测量)。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“抗氧化剂”指的是(但不限于)例如β-胡萝卜素(维生素A前驱体)、维生素C、维生素E和抑制反应性氧物质促进的氧化或反应的硒(“ROS”)以及其它自由基和非自由基物质的多种物质中的任何一种或多种。另外，抗氧化剂是能够减缓或防止其它分子氧化的分子。抗氧化剂的非限制性实例包括虾青素、类胡萝卜素、辅酶Q10(“CoQ10”)、类黄酮、谷胱甘肽、Goji(枸杞)、桔皮苷、乳酸枸杞(lactowolfberry)、木酚素、叶黄素、番茄红素、多酚、硒、维生素A、维生素C、维生素E、玉米黄素或其组合。

“骨干网生态”或简称“骨干网”或“骨干”为形成基础组合物的微生物组合物，其可以构造或减去以使网状生态或功能性网状生态最佳，从而分别具有特异性生物学特征或包含所要功能特性。微生物组疗法可以包含这些“骨干网生态”的整体，或“骨干网”可以通过添加或减去“R基团”修饰，获得网状生态所要特征和特性。如本文所用的“R基团”可在多个术语中定义，包括(但不限于)个别OTU、源自特异性系统发生进化枝或所要表型(例如形成孢子的能力)的个别或多个OTU、或包含的功能性细菌组合物。“骨干网”可包含计算上衍生的整体网状生态或可以是表示网络中有助于功效的关键节点的计算网络的子组(例如(但不限于)根本OTU)。人类胃肠道中的生物体数目以及健康个体之间的多样性是健康肠道微生物组生态学的功能性冗余的指示。参看人类微生物组联盟(The Human MicrobiomeConsortia).2012.健康人类微生物组的结构、功能和多样性(Structure,function anddiversity of the healthy human microbiome).《自然(Nature)》486:207-214。这一冗余造成OTU或功能性路径(即“骨干网”)的不明显亚群非常可能对维持健康状况和或催化有害性状态变换成一种健康状况来说至关重要。一种利用这一冗余的方式是通过取代共用指定进化枝(参见下文)的OTU或添加骨干网中不存在的进化枝成员。

“细菌组合物”指的是包含两个或更多个OTU的微生物共生物种。骨干网生态、功能性网生态、网络等级和核心生态是细菌组合物的全部类型。“细菌组合物”还可以指源自一种微生物或多种微生物的酶的组合物。如本文所用，细菌组合物包括治疗性微生物组合物、预防性微生物组合物、孢子群、经纯化孢子群或乙醇处理的孢子群。

“进化枝”是指系统发生树中统计学上有效的节点下游的系统发生树的OTU或成员。进化枝在系统发生树中包含一组末端叶(即树的顶端)，其为独特单源进化单元并且在一定程度上共用序列相似性。进化枝为分级的。在一个实施例中，选择用于界定进化枝的系统发生树中的节点取决于适于用于计算树形拓扑结构的潜在数据的清晰度水平。示范性进化枝描绘于表1和表2中。如本文所用，细菌OTU的进化枝成员资格是基于16S序列数据。进化枝是基于系统发生树的布局确定，所述系统发生树是使用系统发生学领域普通技术人员熟悉的最大似然法从全长16S序列建构。建构进化枝以确保指定进化枝中的全部OTU：(i)彼此在指定数目的引导支持节点内，和(ii)在5％遗传一致性内。同一进化枝内的OTU可以基于16S-V4序列数据根据与不同进化枝中的OTU不同的基因学和系统发生学区别，而同一进化枝内的OTU紧密相关。同一进化枝内的OTU进化上紧密相关并且可以使用或不使用16S-V4序列数据彼此区别。同一进化枝的成员由于其进化上的相互关系而在例如人类肠道中存在的微生物生态中起类似功能作用或预测起类似功能作用。在一些实施例中，组合物中来自进化枝的一个OTU可以经来自同一进化枝的不同OTU取代。

宿主生物体的“定殖”包括细菌或其它微观生物体的非暂时性驻留。如本文所用，“减少病原性细菌或非病原性细菌在宿主个体胃肠道(或任何其它微生物生态位)定殖”包括缩短细菌在胃肠道中的停留时间以及减少胃肠道中或粘附于胃肠道内腔表面的细菌的数目(或浓度)。定殖的减少可以是永久性的或在短时间内发生。粘附的病原体的减少可以通过测定活组织检查样品中的病原性负荷直接证明或减少可以例如通过测量哺乳动物宿主的粪便中的病原性负荷间接测量。

两种或更多种细菌的“组合”包括两种细菌在同一物质或产品中或在物理上连接的产品中的物理共存，以及两种细菌的时间上共投予或共定位。

如本文所用的术语“基本上由……组成”符合专利检验和程度手册(Manual ofPatent Examination and Procedure)(MPEP；2014年3月)中所提供的定义。本文要求的本发明的基础和新颖特征包括催化哺乳动物个体(例如人类)的微生物组生态学从有害性到更正常状态改变的能力，以及促进如说明书(例如参看表14-21)中所述的微生物组组分移入和扩增的能力。在非限制性实例中，更正常状态可包括与菌群失调有关的疾病或病症的病征或症状减轻。

细菌的“细胞毒性”活性包括杀灭细菌细胞(例如病原性细菌细胞)的能力。“细胞抑制”活性或细菌包括部分或完全抑制细菌细胞(例如病原性细菌细胞)的生长、代谢和/或增殖的能力。细胞毒性活性还可以适用于其它细胞类型，例如(但不限于)真核细胞。

“二聚体”指的是包含两种OTU的细菌的组合。描述“均二聚体”和“杂二聚体”指的是两种OTU分别相同或不同的组合。

“菌群失调”指的是肠道或其它身体区域(包括粘膜或皮肤表面)的微生物丛或微生物组中的生态网络的正常多样性和/或功能被破坏的状态。微生物丛的优选(例如理想)状态的任何破坏可以视为菌群失调，即使此类菌群失调不会导致健康状况可检测降低。这一菌群失调状态可能是不健康的，其可仅在某些条件下不健康，或其可防碍个体变得更健康。菌群失调可能归因于多样性减少、一种或多种病原体或病生菌的过度生长、能够仅在个体中存在某些遗传和/或环境病况时引起疾病的共生生物体，或向不再为宿主提供有益功能且因此不再促进健康状况的生态网络转变。

“生态区位”或简称为“生态位”指的是生物体或生物体群组占据的生态空间。生态位描述生物体或生物体种群对资源分布、物理参数(例如宿主组织空间)和竞争者(例如当资源丰富时生长和当捕食者、寄生虫和病原体稀少时)如何反应，以及其如何继而改变那些相同因素(例如限制其它生物体获取资源、充当捕食者的食品源和捕获物的消费者)。

“萌发”是材料或组合物或物理化学过程能够直接或间接诱发休眠孢子形式的细菌或孢子形式的细菌群组在宿主生物体和/或体外无性生长。

“抑制”病原体或非病原体涵盖抑制本发明的细菌组合物的任何所要功能或活性。抑制的示范(例如减少病原性细菌的生长或降低病原性细菌的定殖水平)提供于本文中并且由所属领域普通技术人员用其它方式鉴别。病原性或非病原性细菌“生长”的抑制可包括抑制病原性或非病原性细菌的尺寸增加和/或抑制病原性或非病原性细菌的增殖(或繁殖)。病原性或非病原性细菌定殖的抑制可以通过测量处理之前和之后病原体的量或负荷来证实。“抑制”或“抑制”行为包括病原体的一种或多种活性(例如生长、增殖、定殖和功能)的全部停止和部分降低。功能的抑制包括例如抑制病原性基因产物(例如细菌组合物诱发的毒素或侵入性菌毛)的表达。

“经分离”涵盖细菌或其它实体或物质，其已经(1)与和其在最初产生(无论在自然界中还是在实验环境中)时相关的组分中的至少一些分离，和/或(2)通过人力产生、制备、纯化和/或制造。经分离细菌包括培养的那些细菌，即使此类培养物不单一培养物。经分离细菌可与和其最初相关的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其它组分分离。在一些实施例中，经分离细菌超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。在一些实施例中，经分离细菌与和其最初相关的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的其它组分分离。在一些实施例中，经分离细菌超过80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过约99％纯。如本文所用，物质在其实质上不含其它组分时是“纯的”。术语“纯化”、“正在纯化”和“经纯化”指的是细菌或其它物质已经与和其在最初产生或生成(例如无论在自然界中还是在实验环境中)时或在其最初产生后的任何时间期间相关的至少一些组分分离。如果细菌或细菌种群在产生时或产生之后经分离(例如与含有细菌或细菌种群的物质或环境分离)或通过培养传代，那么所述细菌或细菌种群可以视为经纯化的，并且经纯化细菌或细菌种群可含有高达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或高于约90％其它物质并且仍视为“经分离”。在其它实施例中，经纯化细菌或细菌种群可含有高达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％其它物质并且仍视为“经分离”。在一些实施例中，经纯化细菌和细菌种群超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。在一些实施例中，经纯化细菌和细菌种群超过80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％纯。在本文提供的细菌组合物的实例中，组合物中所存在的一种或多种细菌类型可独立地从含有所述细菌类型的物质或环境中产生和/或存在的一种或多种其它细菌中纯化。细菌组合物和其细菌组分总体上从残余生境产物中纯化。

“根本OTU”或“根本功能”指的是许多网状生态或功能性网状生态共用的一种或多种OTU或功能性路径(例如KEGG或COG路径)并且是许多个体中存在的网状结构的成员(即普遍的)。由于根本OTU和其相关功能路径无处不在的性质，其对健康个体中的网状生态的功能极其重要并且在患有疾病的个体中通常遗失或含量降低。根本OTU和其相关功能可能以低、中等或高丰度存在于个体中。“非根本OTU”或“非根本功能”指的是网状生态或功能性网状生态中观测到的OTU或功能不并且不是根本OTU或功能。

“微生物丛”指的是动物个体中或动物个体(通常哺乳动物，例如人类)上出现(持续或暂时)的微生物群落，包括真核生物、古细菌、细菌和病毒(包括细菌病毒，即噬菌体)。

“微生物组”指的是持续和暂时生活在人体中或人体上的微生物群落的遗传内容，包括真核生物、古细菌、细菌以及病毒(包括细菌病毒(即噬菌体))，其中“遗传内容”包括基因组DNA、RNA(例如核糖体RNA)、表观基因组、质粒以及所有其它类型的遗传信息。

“微生物运输”或简称为“运输”指的是栖息在人类体内或人类上的生态位的微生物种群。运输通常根据相对丰度定义。举例来说，OTU1占60％总微生物运输，意味着OTU1相较于进行测量的样品中的其它OTU具有60％相对丰度。运输最通常基于单个OTU或OTU群组的相对丰度或运输由分配到所述OTU的测序读数的数目相对于样品的测序读数总数定义的基因组测序数据。或者，运输可以使用微生物分析法测量。

“微生物扩增”或简称为“扩增”指的是以下微生物种群建立或显著增加：(i)所投予的治疗性微生物组合物不存在或不可检测(如通过使用标准基因组和微生物技术测定)，(ii)在微生物组合物传递之前，在宿主生态位(例如胃肠道、皮肤、鼻孔前部或阴道)中不存在、不可检测或以低频率存在，以及(iii)在以低频率存在的情况下，投予微生物组合物之后存在或显著增加，例如2倍、5倍、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷或超过1×10⁸。包含经扩增生态的微生物可以源自外源性来源，例如食物和环境，或从其以低频率存在的宿主体内的微生态位生长。细菌微生物组合物的投予诱发目标生态位中促进这些共生微生物生长的有利条件的环境变换。在无使用细菌组合物处理存在的情况下，宿主可以持续暴露于这些微生物；然而，未观测到与微生物含量增加并且包含经扩增的生态的稳定种群有关的持续生长和积极健康作用。

“微生物移入”或简称为“移入”指的是目标生态位中建立细菌组合物中存在的OTU，其在处理之前不存在于经处理宿主中。包含移入的生态的微生物存在于治疗性微生物组合物中，并且在处理时作为宿主微生物生态的组分建立。移入的OTU可以持续短暂时间段建立，或在用细菌组合物处理后填充宿主的微生物生态中证明长期稳定性。移入的生态可以诱发目标生态位中促进共生微生物生长的有利条件的环境变换，其能够催化从有害生态转变成一种代表性健康状态。

如本文所用，术语“矿物”理解为包括硼、钙、铬、铜、碘、铁、镁、锰、钼、镍、磷、钾、硒、硅、锡、钒、锌或其组合。

“网状生态”指的是一定数目个体中共同存在的进化枝或OTU的共生物种。如本文所用，“网络”通过描绘特定节点(即进化枝或OTU)和边缘(特定进化枝或OTU之间的接点)如何彼此相关以界定进化枝或OTU的共生物种的结构生态的曲线以数学方式定义。任何指定网状生态将具有固有系统发生多样性和功能特性。网状生态还可以根据其功能性能力定义，其中例如节点将由例如(但不限于)以下的要素构成：酶、直系同源群组簇(COGS；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21090/)或KEGG同源性路径(www.genome.jp/kegg/)；这些网状结构称为“功能性网状生态”。可以通过定义共同包含功能性网状生态定义的功能的OTU群组来实施功能性网状生态减少。

“网络类别”和“网络类别生态”指的是一般计算上测定包含具有类似系统发生特征和/或功能特征的生态的网状生态群组。网络类别因此含有系统发生学或功能上定义的相关网状生态群组(即簇)的重要生物学特征。网络类别生态的一个代表是经设计的微生物共生物种(通常非病原性细菌)，其代表许多不同个体中可见的一组系统发生学或功能上相关网状生态的核心特征。在一些情况中，网络类别尽管如本文所述设计，但以一个或多个个体中观测到的网状生态形式存在。网络类别生态适用于逆转或减轻潜在相关网状生态已经被破坏的个体中的菌群失调。

不含“不可食用产品”意思是本文提供的细菌组合物或其它物质在适用于投予(例如经口投予)人类个体的产品中不具有基本量的不可食用产品，例如不可食用、有害或以另外方式非所需的产品或物质。不可食用产品通常存在于来自现有技术的细菌制剂中。

“操作分类单位”和“OTU”(或多个“OTU”)指的是系统发生树中的末端叶并且由核酸序列(例如全基因组)或特异性基因序列，以及在物种水平上与这一核酸序列共用序列一致性的全部序列定义。在一些实施例中，特异性基因序列可以是16S序列或16S序列的一部分。在其它实施例中，对两种实体的整个基因组进行测序和比较。在另一实施例中，例如多基因座序列标签(MLST)、特异性基因或基因集合的选择区域可以进行遗传比较。在16S实施例中，在整个16S或16S的一些可变区上共用≥97％平均核苷酸一致性的OTU视为相同OTU。参看例如Claesson等人,2010.两种使用串联可变16S rRNA基因区域拆分高度复杂微生物丛组合物的下一代测序技术的比较(Comparison of two next-generation sequencingtechnologies for resolving highly complex microbiota composition using tandemvariable 16S rRNA gene regions).《核酸研究(Nucleic Acids Res)》38:e200.Konstantinidis等人,2006.基因组时代的细菌物种定义(The bacterial speciesdefinition in the genomic era).《伦敦皇家学会哲学学报:生物科学(Philos Trans RSoc Lond B Biol Sci)》361:1929-1940。在涉及全基因组的实施例中，共用≥95％平均核苷酸一致性的MLST、除16S以外的特异性基因或基因OTU集合视为相同OTU。参看例如Achtman和Wagner.2008.微生物多样性和微生物物种的遗传学性质(Microbial diversityand the genetic nature of microbial species).《自然研究微生物学(Nat.Rev.Microbiol.)》6:431-440；Konstantinidis等人,2006,上文.基因组时代的细菌物种定义.《伦敦皇家学会哲学学报:生物科学》361:1929-1940。可以通过比较生物体之间的序列来定义OTU。一般来说，具有小于95％序列一致性的序列不视为形成同一OTU的部分。OTU还可以通过核苷酸标记或基因的任何组合，具体来说高度保守基因(例如“管家”基因)或其组合来表征。此类表征采用例如WGS数据或全基因组序列。如本文所用，细菌“类型”指的是可以是菌株、种、进化枝或科的水平的OTU。

下表1示出了对属、种和系统发生进化枝做出的分类分配的操作分类单位(OTU)的列表。细菌OTU的进化枝成员资格是基于16S序列数据。进化枝是基于系统发生树的布局确定，所述系统发生树是使用系统发生学领域普通技术人员熟悉的最大似然法从全长16S序列建构。建构进化枝以确保指定进化枝中的全部OTU：(i)彼此在指定数目的引导支持节点内，和(ii)在5％遗传相似性内。同一进化枝内的OTU可以基于16S-V4序列数据根据与不同进化枝中的OTU不同的基因学和系统发生学区别，而同一进化枝内的OTU紧密相关。同一进化枝内的OTU进化上紧密相关并且可以使用或不使用16S-V4序列数据彼此区别。同一进化枝的成员由于其进化上的相互关系而在例如人类肠道中存在的微生物生态学中起类似功能作用。用同一进化枝的一种物种取代另一物种的组合物可能具有保守生态功能并且因此适用于本发明。全部OTU根据其形成孢子的假定能力标识而与其是病原体还是病生菌无关(参看针对“病生菌”的描述的定义)。NIAID优先病原体标示为‘A类’、‘B类’或‘C类’，并且机会病原体标示为‘OP’。不是发病因素或作为病原体存在的能力未知的OTU标示为‘N’。‘SEQID号’指示序列表文件中的OTU识别码并且‘公共DB登记号’指示公共序列储存库中的OTU识别码。

“病生菌”或“机会病原体”指的是健康主体中存在的特异性细菌物种，其可回应于特定遗传学或环境因素触发免疫介导的病变和/或疾病(Chow等人.,2011.《免疫学目前视点(Curr Op Immunol.)》肠道微生物丛和发炎性疾病的病生菌(Pathobionts of theintestinal microbiota and inflammatory disease).23:473-80)。病生菌是与获得性的感染性生物体机械上不同的机会性微生物。如本文所用的术语“病原体”包括获得性的感染性生物体和病生菌。

“病原体”、“病生菌”和“发病因素”涉及细菌或任何其它生物体或包括任何此类生物体的实体或能够引起或影响含有生物体或实体的宿主生物体的疾病、病症或病况(包括(但不限于)前期糖尿病、1型糖尿病或2型糖尿病)的实体。

“表型”指的是个别实体的一组可观测特征。举例来说，个别个体可具有“健康”或“疾病”表型。表型描述一种表型内的一种实体和全部实体共用描述所述表型的相同特征组的状态。个体的表型部分或完全由实体基因组和/或微生物组与环境(尤其包括饮食)的相互作用引起。

“系统发生多样性”是涉及指定网状生态或网络类别生态中存在的基于包含网络的OTU的生物多样性的生物学特征。系统发生多样性是相对术语，意思是与另一网络比起来更具系统发生学多样性的网状生态或网络类别含有较大量特有种、属以及分类科。种、属或分类科的独特性一般使用系统发生树定义，所述系统发生树代表全部种、属或分类科相对于彼此的遗传多样性。在另一实施例中，系统发生多样性可以使用系统发生树的总分支长度或平均分支长度来测量。可以通过纳入各种生物多样性使细菌组合物中的系统发生多样性最佳化。

“系统发生树”指的是一种基因序列到另一种基因序列的进化关系的图形表示，其使用一组经定义的系统发生重建算法(例如简约(parsimony)、最大似然(maximumlikelihood)或贝叶斯(Bayesian))生成。树中的节点代表相异的祖先序列，且任何节点的置信度由测量分支不确定性的引导或贝叶斯后验概率提供。

“前期糖尿病”指的是血糖含量高于正常值，但不够高以分类成糖尿病的病状。患有前期糖尿病的个体在十年内产生2型糖尿病的风险增加。根据CDC，前驱糖尿病可以通过空腹葡萄糖含量介于100-125mg/dL之间，口服葡萄糖耐量测试(OGTT)中糖负荷后2小时血浆葡萄糖介于140和199mg/dL之间，或血红蛋白A1c测试介于5.7％-6.4％之间来诊断。

“rDNA”、“rRNA”、“16S-rDNA”、“16S-rRNA”、“16S”、“16S测序”、“16S-NGS”、“18S”、“18S-rRNA”、“18S-rDNA”、“18S测序”以及“18S-NGS”指的是编码核糖体的RNA子单元的核酸。rDNA指的是编码包含RNA子单元的rRNA的基因。核糖体中存在两种RNA子单元，称为小子单元(SSU)和大子单元(LSU)；这些子单元的RNA遗传序列(rRNA)涉及通过遗传密码编码其(rDNA)的基因。rDNA基因和其互补RNA序列因其可变性而广泛用于测定生物体之间的进化关系，但仍充分保守以允许交叉生物体分子比较。通常，30S SSU的16S rDNA序列(长度约1542个核苷酸)用于原核生物的基于分子的分类分配并且40S SSU的18S rDNA序列(长度约1869个核苷酸)用于真核生物。16S序列用于系统发生重建，因为其总体上高度保守，但含有特定高变区，所述特定高变区具有足够的核苷酸多样性来区分大部分细菌的属和种。

“残余生境产物”指的是来源于人类或动物体内或之上的微生物丛的生境的物质。举例来说，微生物丛生活在胃肠道中的粪便中、在皮肤本身上、在呼吸道的唾液、粘液或泌尿生殖道的分泌物中(即与微生物群落相关的生物学物质)。基本上不含残余生境产物意思是细菌组合物不再含有与人类或动物个体之上或体内的微生物环境相关的生物学物质，且100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含或95％不含与微生物群落相关的任何污染性生物学物质。残余生境产物可包括非生物性物质(包括未消化的食物)或其可包括非所需微生物。基本上不含残余生境产物意思还是细菌组合物不含来自人类或动物的可检测细胞，且仅微生物细胞是可检测的。在一个实施例中，基本上不含残余生境产物意思还是细菌组合物不含可检测病毒(包括细菌病毒，即噬菌体)、真菌、支原体污染物。在另一实施例中，其意思是与微生物细胞相比，细菌组合物中少于1×10^-2％、1×10^-3％、1×10^-4％、1×10^-5％、1×10^-6％、1×10^-7％、1×10^-8的活细胞是人类或动物的。有多种方式实现这一纯化程度，它们都不是限制性的。因此，可通过在固体培养基上向单个菌落划线直到来自连续单个菌落的重复(例如(但不限于)两次)划线已展示仅单个菌落形态的多个步骤来分离所需组分，从而减少污染。或者，污染的减少可通过对单个所需细胞的多轮连续稀释(例如10-8或10-9倍稀释)来实现，例如经多次10倍连续稀释。这可以进一步通过展示多次分离的菌落具有类似细胞形状和革兰氏染色行为来证实。证实充足纯度的其它方法包括遗传分析(例如PCR、DNA测序)、血清学和抗原分析、酶和代谢分析，以及使用区分所需组分与污染物的仪器(例如流式细胞仪)与试剂的方法。

“协同作用”指的是例如两种微生物(例如两种不同物种或两个不同进化枝的微生物)的组合产生的作用大于组合组分的预期加成效率。在某些实施例中，两种或更多种微生物之间的“协同作用”可导致抑制病原体的生长能力。举例来说，如果三元组合的平均对数抑制大于各构成细菌的三聚体的对数抑制的总和除以三(导致各菌株的三倍较高剂量)，或对于二元组合，各构成细菌的均二聚体的对数抑制除以二，那么三元组合协同抑制艰难梭菌。在另一实例中，可以通过定义OTU组合物证明抑制比由分别测试的各细菌的对数抑制的总和表示的抑制大来计算协同作用。在其它实施例中，协同作用可以定义为展现抑制大于独立地测量的各构成细菌的均二聚体或均三聚体的最大对数抑制的组合物的特性。如本文所用，“协同作用”或“协同相互作用”指的是两种或更多种微生物产生大于其独立作用的总和的组合效应的相互作用或合作。

“孢子”或“孢子”种群包括细菌(或其它单细胞生物体)，其总体上是活的，与同一细菌的营养形式相比对环境影响(例如热和杀菌剂)更具抗性，并且通常能够萌发和长出。孢子的特征为在其对导致萌发的特异性环境信号起反应之前不存在活性代谢。“孢子形成体”或“能够形成孢子”的细菌是含有在适合环境条件下产生孢子的基因和其它必需能力的那些细菌。

“孢子种群”指的是组合物中存在的多种孢子。本文所用的同义术语包括孢子组合物、孢子制剂、乙醇处理的孢子部分和孢子生态。孢子种群可以例如经乙醇或热处理，或密度梯度分离或本文所述的方法的任何组合从粪便捐赠物纯化，提高样品中孢子的纯度、效能和/或浓度。或者，孢子种群可以使用经分离的孢子形成体物质或孢子形成体OTU或此类物质的混合物(营养形式或孢子形式)作为起始物质经培养方法获得。

在一个实施例中，孢子制剂包含孢子形成物质，其中残余非孢子形成物质已经通过化学或物理处理(包括乙醇、清洁剂、热、超声处理等)不活化；或其中非孢子形成物质已经通过分离步骤(包括密度梯度、离心、过滤和/或色谱)从孢子制剂去除；或其中不活化和分离方法组合以制备孢子制剂。在另一实施例中，孢子制剂包含孢子形成物质，其增浓有活力的非孢子形成体或孢子形成体的营养形式。在这一实施例中，孢子相较于细菌的全部营养形式增浓2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或超过10,000倍。在另一实施例中，孢子制剂中的孢子在处理和配制期间经历部分萌发，使得最终组合物包含孢子和源自孢子形成物质的营养细菌。

“孢子形成诱发剂”是能够在宿主生物体中和/或体外直接或间接诱发细菌中孢子形成的物质或物理-化学过程。

“增加细菌孢子的制造”包括活性或孢子形成诱发剂。“制造”包括将营养细菌细胞转换成孢子并且增加此类转换的速率，以及减少孢子形式的细菌的萌发、降低体内或离体孢子衰变速率，或增加总孢子输出(例如通过增加粪便材料的体积输出)。

“个体”指的是任何动物个体，包括人类、实验动物(例如非人类灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡以及鸡)以及家庭宠物(例如狗、猫以及啮齿动物)。个体可能患有菌群失调，这造成或引起分类为糖尿病或前期糖尿病的病状，包括(但不限于)例如代谢性内毒素血症、初级胆酸代谢改变、免疫系统活化或短链脂肪酸(包括丁酸、丙酸、乙酸)和分支链脂肪酸的不平衡或产量降低。

“三聚体”指的是包含三种OTU的细菌的组合。描述“均三聚体”和“杂三聚体”指的是全部三种OTU分别相同或不同的组合。“半-杂三聚体”指的是两种组分相同并且第三种不同的组合。

如本文所用，术语“维生素”应理解为包括多种脂溶性或水溶性有机物质中的任一种，(非限制性实例包括维生素A、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸或烟碱酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺，或吡哆醇盐酸盐)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)以及维生素B12(多种钴胺素；通常维生素补充剂中的氰钴维生素)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、K1以及K2(即MK-4、MK-7)、叶酸和生物素)，其对于身体正常生长和活动以微量必需并且从植物和动物食品天然获得或以合成方式制造(维生素原、衍生物、类似物)。

“V1-V9区”或“16S V1-V9区”指的是16S rDNA基因中用于对细菌样品进行遗传分型的第一到第九高变区。细菌中的这些区域分别由核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294以及1435-1465使用基于大肠杆菌系统命名法的编号定义(Brosius等人,1978.来自大肠杆菌的16S核糖体RNA基因的完整核苷酸序列,《美国国家科学院院刊》USA 75(10):4801-4805)。在一些实施例中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8以及V9区中的至少一个用于表征OTU。在一个实施例中，V1、V2以及V3区用于表征OTU。在另一实施例中，V3、V4以及V5区用于表征OTU。在另一实施例中，V4区用于表征OTU。所属领域普通技术人员能通过比较所讨论的候选序列与参考序列并且基于与参考高变区的相似性来鉴别高变区来鉴别候选16S rDNA的特异性高变区，或者，可以采用全基因组鸟枪(WGS)序列表征微生物或微生物群落。

详细描述

申请人已发现细菌的组合当存在时与个体(例如患有菌群失调的个体，例如与艰难梭菌有关的菌群失调)的微生物组中的改良有关。另外，已鉴别出微生物的组合与健康微生物组有关的生物体的移入和/或扩增有关。申请人也已鉴别出适用于治疗抗生素耐药性或其它病原性细菌条件的微生物的组合。在一些实施例中，此类组合物的微生物含量包含生物体，在其它实施例中，组合物的微生物含量基本上由生物体组成，并且在其它实施例中，组合物的微生物含量由生物体组成。在所有情况下，组合物可包括非微生物组分。在一些情况下，如本文所述，组合物包含至少两种生物体(例如三种生物体)或更多。

细菌中出现抗生素耐药性

抗生素耐药性是新兴的公众健康问题(Carlet等人,2011.社会无法保护珍贵资源:抗生素(Society's failure to protect a precious resource:antibiotics).《柳叶刀(Lancet)》378:369-371)。许多细菌属存在对抗生素产生耐药性的种。这些包括(但不限于)万古霉素耐药性肠球菌(VRE)和卡巴盘尼姆耐药性克雷伯氏菌(CRKp)。克雷伯氏肺炎杆菌和大肠杆菌菌株对卡巴盘尼姆变得具有耐药性并且需要使用特征为高毒性的旧式抗生素，例如粘菌素(Cantón等人.2012.卡巴盘尼姆酶在肠杆菌科中快速逸出和扩散(Rapidevolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae),《欧洲临床微生物感染(Europe.Clin Microbiol Infect)》18:413-431)。临床上观测到包括绿脓杆菌、肠杆菌属和不动杆菌属的额外多种耐药性菌株，包括对头孢他啶(ceftazidime)、卡巴盘尼姆(carbapenem)以及喹诺酮(quinolone)高度耐药的分离株(欧洲疾病防控中心(EuropeanCentre for Disease Prevention and Control):EARSS网站数据库.http://ecdc.europa.eu.)。疾病防控中心在2013年发布引用许多细菌感染威胁的威胁报告(http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/)，包括艰难梭菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、多药耐药性不动杆菌属、耐药性弯曲杆菌(Campylobacter)、产生超广谱β-内酰胺的肠球菌(ESBL)、万古霉素耐药性肠球菌(VRE)、多药耐药性绿脓杆菌、耐药性性非伤寒沙门菌(non-typhoidal Salmonella)、耐药性伤寒沙门菌(drug-resistantSalmonella typhi)、耐药性志贺杆菌、甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、耐药性肺炎链球菌(drug-resistantStreptococcus pneumoniae)、万古霉素耐药性金黄色酿脓葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus，VRSA)、红霉素耐药性A组链球菌以及克林达霉素耐药性B组链球菌(clindamycin-resistant Group B Streptococcus)。由于耐药性微生物增多引起的抗生素失效增加需要治疗细菌感染的新颖疗法。投予微生物组治疗性细菌组合物提供此类疗法的可能性。

申请人已发现患有复发性艰难梭菌相关腹泻(CDAD)的个体通常具有抗生素耐药性革兰氏阴性细菌，具体来说肠杆菌科，并且用细菌组合物治疗可有效治疗CDAD并且减少抗生素耐药性革兰氏阴性细菌。胃肠道表明可以作为许多这些生物体的储集器，这些生物体包括VRE、MRSA、绿脓杆菌、不动杆菌以及假丝酵母(yeast Candida)(Donskey,临床传染性疾病(Clinical Infectious Diseases)2004 39:214,肠道作为医院内病原体的储集器和传播源的作用(The Role of the Intestinal Tract as a Reservoir and Source forTransmission of Nosocomial Pathogens))，并且因此为医院感染的来源。抗生素治疗和其它消除污染程序属于用于减少这些生物体在易感个体(包括免疫抑制的那些个体)中的定殖的工具。基于细菌的疗法将提供用于消除定殖的新颖工具，关键益处在于不像抗生素疗法一样促进抗生素耐药性。

细菌组合物

所提供的是能够在投予哺乳动物宿主时有意义地提供健康微生物丛功能或催化驻留微生物组扩增的人类肠道微生物丛的细菌和细菌组合。具体来说，提供协同组合，其治疗、预防、延迟或减轻与菌群失调相关的疾病、病症和病况的症状。适用于用如本文所述的组合物和方法治疗的与菌群失调潜在相关的代表性疾病、病症和病况提供在表3中。不受特定机制限制，认为此类组合物抑制有害性微生物群生态位中的一种或多种病原性细菌的生长、增殖和/或定殖，使得健康、多样和保护性的微生物丛定植且填充肠道内腔，从而建立或重新建立对病原体或潜在病原体(例如一些细菌仅在存在于有害性环境中时才是病原性细菌)的生态控制。病原体的抑制包括例如艰难梭菌、沙门氏菌属、肠病原体大肠杆菌、多药耐药性细菌(例如克雷伯氏菌和大肠杆菌)、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)和万古霉素耐药性肠球菌(VRE)的那些病原体。

制造本文所提供的细菌组合物，且证实其抑制病原性细菌方面的功效，如本文中进一步详细提供。

具体来说，为了表征与哺乳动物肠道生境的动态相关的肠道共生体之间的那些拮抗关系，提供基于体外微量板的筛选系统，其展示那些细菌组合物的功效，包括抑制(或拮抗)细菌病原体或病生菌(通常是胃肠微生物)的生长的能力。这些方法提供能够在体内恢复或增强对重要肠道病原体或病生菌的生态控制的肠道微生物丛种群和OTU的新颖组合。

细菌组合物可包含两种类型的细菌(称为“二元组合”或“二元对”)或超过两种类型的细菌。包含三种类型细菌的细菌组合物称为“三元组合”。举例来说，细菌组合物可包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种或至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39种或至少40种、至少50种或超过50种类型的细菌，如通过种或操作分类单位(OTU)所定义或另外如本文所提供。在一个实施例中，组合物包含至少两种类型的选自表1的细菌。

在另一实施例中，细菌组合物中所存在的细菌类型的数目是已知值或低于已知值。举例来说，在此类实施例中，细菌组合物包含50种或更少类型的细菌，例如49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10种或更少，或9种或更少类型的细菌、8种或更少类型的细菌、7种或更少类型的细菌、6种或更少类型的细菌、5种或更少类型的细菌、4种或更少类型的细菌、或3种或更少类型的细菌。在另一实施例中，细菌组合物包含2种到不超过40种、2种到不超过30种、2种到不超过20种、2种到不超过15种、2种到不超过10种、或2种到不超过5种类型的细菌。

在一些实施例中，细菌组合物具备排除病原性细菌的能力。证实示范性细菌组合物降低一种病原体艰难梭菌的生长速率，如实例中所提供，其中细菌组合物的能力通过使用体外分析评估OTU或菌株的组合对既定病原体的拮抗活性来证实。

在一些实施例中，使用估算人类微生物丛内组分的生态控制系数(ECF)的方法来开发能够持久地排除艰难梭菌的细菌组合物。ECF通过使用体外分析法评估既定共生菌株或菌株组合对既定病原体的拮抗活性来测定，得到在不同浓度的所添加的共生菌株下观察到的生态控制水平。共生菌株或菌株组合的ECF有点类似于在抗生素评估中使用的长期存在的最低抑制浓度(MIC)评估。ECF允许对共生菌株和菌株组合拮抗胃肠道病原体能力的相对效能进行评估和评级。共生菌株或菌株组合的ECF可通过在体外分析中评估能够介导对目标病原体的既定抑制百分比(例如至少10％、20％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的所述组合物的浓度来计算。本文提供了能够在体外分析中显著降低胃肠道病原体复制速率的人类微生物丛内菌株或OTU的组合。这些组合物能够提供影响此类细菌病原体的生长、复制和疾病严重程度的安全且有效的手段。

可制备包含至少两种类型的经分离细菌的细菌组合物，其中第一类型和第二类型独立地选自表1中列出的种或OTU。含有二元对的具有至少两种类型的经分离细菌的细菌组合物的某些实施例反映在表4中。另外，可以制备包含至少两种类型的经分离细菌的细菌组合物，其中第一OTU和第二OTU独立地特征为即与表1中列出的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或包括100％序列一致性。一般来说，第一细菌和第二细菌不是相同的OTU。针对表1中的OTU的测序列表文件中提供的序列是完整16S序列。因此，在一个实施例中，第一和/或第二OTU的特征可在于表1中列出的完整16S序列。在另一实施例中，第一和/或第二OTU的特征可在于16S序列的一个或多个可变区(V1-V9)。使用基于大肠杆菌系统命名法的编号，分别通过核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294以及1435-1465定义细菌中的这些区。(参看例如，Brosius等人,来自大肠杆菌的16S核糖体RNA基因的完整核苷酸序列,《美国国家科学院院刊》75(10):4801-4805(1978))。在一些实施例中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8以及V9区中的至少一个用于表征OTU。在一个实施例中，V1、V2以及V3区用于表征OTU。在另一实施例中，V3、V4以及V5区用于表征OTU。在另一实施例中，V4区用于表征OTU。

通过种描述的细菌组合物

在一些实施例中，组合物中包括由种界定的组合物。所属领域中已知鉴别种的方法。

操作分类单位(OTU)描述的细菌组合物

OTU可通过rDNA基因的完整16S测序、通过这一基因的特异性高变区(即V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8或V9)的测序、或通过来自这一基因的高变区的任何组合(例如V1-3或V3-5)的测序进行定义。细菌16S rDNA的长度是约1500个核苷酸，且用于使用系统发生方法重建一种细菌分离物与另一种细菌分离物的进化关系和序列相似性。16S序列用于系统发生重建，因为其总体上高度保守，但含有特异性高变区，所述特异性高变区具有足够的核苷酸多样性来区分大部分微生物的属和种。使用众所周知的技术，为了测定完整16S序列或16S序列的任何高变区的序列，从细菌样品提取基因组DNA，使用聚合酶链反应(PCR)扩增16SrDNA(完整区或特异性高变区)，清洁PCR产物，且描绘核苷酸序列以测定16S基因或基因子域的遗传组成。如果进行完整16S测序，那么所用测序方法可以是(但不限于)桑格测序(Sanger sequencing)。如果使用一个或多个高变区，例如V4区，那么测序可以(但不限于)使用桑格法或使用下一代测序方法(例如使用允许多重反应的条形码引物的Illumina(边合成边测序)方法)进行。

排除某些细菌种或菌株的细菌组合物

在一个实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(此前被称为粪链球菌(Streptococcus faecalis))、无害梭菌(Clostridiuminnocuum)、多枝梭菌(Clostridium ramosum)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaoiotaomicron)、大肠杆菌(1109和1108-1)、双酶梭菌(Clostridum bifermentans)和尾叶布劳特氏菌(Blautiaproducta)(此前被称为产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus))。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：肠道氨基酸球菌(Acidaminococcus intestinalis)、卵形拟杆菌、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)的两个种、龙根双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的两个种、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、长链多尔氏菌(Dorea longicatena)的两个种、大肠杆菌、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)的四个种、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosumi)、普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、狄氏副拟杆菌(Paracateroides distasonis)、拉乌尔菌属(Raoultella sp.)、罗斯氏菌(Roseburia)的一个种(选自粪罗斯氏菌(Roseburiafaecalis)或粪便罗斯氏菌(Roseburia faecis))、肠道罗斯氏菌(Roseburiaintestinalis)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的两个种以及轻型链球菌(Streptococcus mitis)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：人肠道巴恩斯氏菌(Barnesiella intestinihominis)；洛德乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；被表征为希氏肠球菌(Enterococcus hirae)、屎肠球菌(Enterococus faecium)或耐久肠球菌(Enterococcus durans)中的一个的种；被表征为粪厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)或吲哚梭菌(Clostridium indolis)中的一个的种；被表征为瓦氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)或巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)中的一个的种；以及阿德扎气球菌(Adlercreutzia equolifaciens)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：不同梭菌(Clostridiumabsonum)、阿根廷梭菌(Clostridium argentinense)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)、双酶梭菌、肉毒梭菌、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、尸毒梭菌(Clostridiumcadaveris)、肉梭菌(Clostridiumcamis)、隐藏梭菌(Clostridium celatum)、气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)、梭状梭菌(Clostridium clostridioforme)、匙形梭菌(Clostridium cochlearium)、艰难梭菌、谲诈梭菌(Clostridium fallax)、费新尼亚梭菌(Clostridium felsineum)、戈氏梭菌(Clostridium ghonii)、乙二醇梭菌(Clostridiumglycolicum)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、矛形梭菌(Clostridiumhastiforme)、溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)、吲哚梭菌、无害梭菌、不规则梭菌(Clostridium irregulare)、粘液梭菌(Clostridium limosum)、恶名梭菌(Clostridiummalenominatum)、诺维梭菌(Clostridium novyi)、乳清酸梭菌(Clostridiumoroticum)、副腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、产气荚膜梭菌、毛状梭菌(Clostridium piliforme)、腐化梭菌(Clostridium putrefaciens)、腐败梭菌(Clostridium putrificum)、多枝梭菌、撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense)、煎盘梭菌(Clostridium sartagoforme)、闪烁梭菌(Clostridium scindens)、败毒梭菌(Clostridium septicum)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、楔形梭菌(Clostridiumsphenoides)、螺状梭菌(Clostridium spiroforme)、产芽胞梭菌(Clostridiumsporogenes)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)、第三梭菌(Clostridium tertium)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、韦氏梭菌(Clostridium welchii)以及绒毛梭菌(Clostridium villosum)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：无害梭菌、双酶梭菌、丁酸梭菌、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、多形拟杆菌、单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)、大肠杆菌的三种菌株以及乳杆菌属(Lactobacillus sp.)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：双酶梭菌、无害梭菌、丁酸梭菌、大肠杆菌的三种菌株、拟杆菌的三种菌株以及尾叶布劳特氏菌(此前被称为产生消化链球菌)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：拟杆菌属(Bacteroidessp.)、大肠杆菌以及非病原性梭菌属(包括无害梭菌、双酶梭菌和多枝梭菌)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：一种以上拟杆菌种、大肠杆菌以及非病原性梭菌属(例如丁酸梭菌、双酶梭菌和无害梭菌)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：粪拟杆菌(Bacteroidescaccae)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、凝固拟杆菌(Bacteroides coagulans)、狄氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、福塞斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、脆弱拟杆菌、赖氏脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis-ryhm)、纤维拟杆菌(Bacteroides gracilis)、利氏拟杆菌(Bacteroides levii)、猕猴拟杆菌(Bacteroides macacae)、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、卵形拟杆菌、侵肺拟杆菌(Bacteroides pneumosintes)、腐败拟杆菌(Bacteroides putredinis)、酿脓拟杆菌(Bacteroides pyogenes)、内脏拟杆菌(Bacteroides splanchnicus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、隐蔽拟杆菌(Bacteroides tectum)、多形拟杆菌、单形拟杆菌、解脲拟杆菌(Bacteroides ureolyticus)以及普通拟杆菌。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：拟杆菌(Bacteroides)、真细菌(Eubacteria)、梭杆菌(Fusobacteria)、丙酸杆菌(Propionibacteria)、乳杆菌(Lactobacilli)、厌氧球菌(anaerobic cocci)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、大肠杆菌、芽殖菌(Gemmiger)、脱硫单胞菌(Desulfomonas)以及消化链球菌(Peptostreptococcus)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：脆弱拟杆菌普通亚种(Bacteroides fragilis ss.Vulgatus)、产气真杆菌(Eubacterium aerofaciens)、脆弱拟杆菌多形亚种(Bacteroides fragilis ss.Thetaiotaomicron)、尾叶布劳特氏菌(此前被称为产生消化链球菌II)、脆弱拟杆菌狄氏亚种(Bacteroides fragilis ss.Distasonis)、普氏梭杆菌(Fusobacterium prausnitzii)、一致粪球菌(Coprococcus eutactus)、产气真杆菌III、尾叶布劳特氏菌(此前被称为产生消化链球菌I)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)、青春双歧杆菌、甲酸芽殖菌(Gemmiger formicilis)、龙根双歧杆菌、惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)、扭链瘤胃球菌、直肠真杆菌III-H、直肠真杆菌IV、挑剔真杆菌、埃氏拟杆菌、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、脆弱拟杆菌A亚种(Bacteroides fragilisss.A)、两形真杆菌(Eubacterium biforme)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、直肠真杆菌III-F、陪伴粪球菌(Coprococcus comes)、多毛拟杆菌、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、产甲酸真杆菌(Eubacterium formicigenerans)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、凸腹真杆菌I、拉氏梭杆菌(Fusobacterium russii)、卵瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)、直肠真杆菌II、多枝梭菌I、赖氏乳杆菌(Lactobacillusleichmanii)、伶俐瘤胃球菌(Ruminococcus cailidus)、穗状丁酸弧菌(Butyrivibriocrossotus)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、凸腹真杆菌、脆弱拟杆菌脆弱亚种(Bacteroides fragilis ss.fragilis)、拟杆菌AR(Bacteroides AR)、灵巧粪球菌(Coprococcus catus)、庞大真杆菌(Eubacterium hadrum)、圆柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、反刍真杆菌(Eubacterium ruminantium)、真细菌CH-1、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、消化链球菌BL、淤泥真杆菌、锐利拟杆菌(Bacteroides praeacutus)、拟杆菌L(Bacteroides L)、死亡梭杆菌I(Fusobacteriummortiferum I)、舟形梭杆菌(Fusobacterium naviforme)、无害梭菌、多枝梭菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、瘤胃球菌AT、消化球菌AU-1；真细菌AG、-AK、-AL、-AL-1、-AN；脆弱拟杆菌卵形亚种、d亚种、f亚种(Bacteroides fragilis ss.ovatus,-ss.d,-ss.f)；拟杆菌L-1、L-5；具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、死亡梭杆菌、大肠杆菌、麻疹链球菌(Streptococcusmorbiliorum)、大消化球菌(Peptococcus magnus)；消化球菌G、AU-2；中间链球菌(Streptococcus intermedius)、酸奶瘤胃球菌(Ruminococcus lactaris)、瘤胃球菌CO、芽殖菌X；粪球菌BH、-CC；纤细真杆菌(Eubacterium tenue)、细枝真杆菌(Eubacteriumramulus)；真细菌AE、-AG-H、-AG-M、-AJ、-BN-1；梭形拟杆菌梭形亚种(Bacteroidesclostridiiformis ss.clostridliformis)、凝固拟杆菌、口腔拟杆菌(Bacteroidesorails)；栖瘤胃拟杆菌短亚种、栖瘤胃亚种(Bacteroides ruminicola ss.brevis,-ss.ruminicola)；内脏拟杆菌、惰性脱硫弧菌(Desuifomonas pigra)；拟杆菌L-4、-N-i；梭杆菌H、乳杆菌G以及琥珀酸弧菌A(Succinivibrio A.)

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：两岐双岐杆菌W23(Bifidobacterium bifidum W23)、乳酸双歧杆菌W18(Bifidobacterium lactis W18)、长双歧杆菌W51(Bifidobacterium longum W51)、屎肠球菌W54(Enterococcus faeciumW54)、植物乳杆菌W62(Lactobacillus plantarum W62)、鼠李糖乳杆菌W71(Lactobacillusrhamnosus W71)、嗜酸乳杆菌W37(Lactobacillus acidophilus W37)、嗜酸乳杆菌W55(Lactobacillus acidophilus W55)、副干酪乳杆菌W20(Lactobacillus paracasei W20)以及唾液乳杆菌W24(Lactobacillus salivarius W24)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：科利霍米尼斯厌氧杆菌DSM 17241(Anaerotruncus colihominis DSM 17241)、尾叶布劳特氏菌JCM 1471、梭菌目细菌1 7 47FAA、阿斯巴伐梭菌DSM 15981(Clostridium asparagiforme DSM 15981)、梭菌属细菌JC13、鲍氏梭菌ATCC BAA 613(Clostridium bolteae ATCC BAA 613)、哈瑟维梭菌DSM 13479(Clostridium hathewayi DSM 13479)、吲哚梭菌CM971(Clostridium indolisCM971)、多枝梭菌DSM 1402(Clostridium ramosum DSM 1402)、沙卡氏梭菌SDG Mt85 3Db(Clostridium saccharogumia SDG Mt85 3Db)、闪烁梭菌VP 12708(Clostridiumscindens VP 12708)、梭菌属7 3 54FAA(Clostridium sp 7 3 54FAA)、扭曲真杆菌DSM3982(Eubacterium contortum DSM 3982)、毛螺菌科细菌3 157FAA CT1(Lachnospiraceaebacterium 3 1 57FAA CT1)、毛螺旋菌科细菌7 1 58FAA(Lachnospiraceae bacterium 71 58FAA)以及瘤胃球菌属ID8(Ruminococcus sp ID8)。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：科利霍米尼斯厌氧杆菌DSM17241、尾叶布劳特氏菌JCM 1471、梭菌目细菌1 7 47FAA、阿斯巴伐梭菌DSM 15981、梭菌属细菌JC13、鲍氏梭菌ATCC BAA 613、哈瑟维梭菌DSM 13479、吲哚梭菌CM971、多枝梭菌DSM 1402、萨卡呱梭菌SDG Mt85 3Db、闪烁梭菌VP 12708、梭菌属7 3 54FAA、扭曲真杆菌DSM 3982、毛螺菌科细菌3 1 57FAA CT1、毛螺旋菌科细菌7 1 58FAA、颤螺菌科细菌NML061048(Oscillospiraceae bacterium NML 061048)以及瘤胃球菌属ID8。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：多枝梭菌DSM 1402、萨卡呱梭菌SDG Mt85 3Db和毛螺菌科细菌7 1 58FAA。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：哈瑟维梭菌DSM 13479、萨卡呱梭菌SDG Mt85 3Db、梭菌属7 3 54FAA和毛螺菌科细菌3 1 57FAA CT1。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：科利霍米尼斯厌氧杆菌DSM17241、尾叶布劳特氏菌JCM 1471、梭菌属细菌JC13、闪烁梭菌VP 12708和瘤胃球菌spID8。

在另一实施例中，细菌组合物不包含以下中的至少一个：梭菌目细菌1 7 47FAA、阿斯巴伐梭菌DSM 15981、鲍氏梭菌ATCC BAA 613、吲哚梭菌CM971和毛螺菌科细菌7 158FAA。

细菌病原体的抑制

细菌组合物提供针对一种或多种所关注的GI病原体(其中一些列于表3中)的保护性或治疗性效果。

在一些实施例中，所述病原性细菌选自由以下各者组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

在一些实施例中，这些病原体包括(但不限于)嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、肠聚集性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠毒性大肠杆菌(例如(但不限于)LT和/或ST)、大肠杆菌0157:H7、镰孢菌属(Fusarium spp.)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、单核细胞增生李斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)、摩根氏菌属(Morganella spp.)、类志贺邻单胞菌、变形菌属(Proteus spp.)、普罗威登斯菌属(Providencia spp.)、沙门氏菌属、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、志贺杆菌属、葡萄球菌属、金黄色酿脓葡萄球菌、万古霉素耐药性肠球菌属、弧菌属、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)以及小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。

在一个实施例中，所关注的病原体是至少一种选自以下的病原体：艰难梭菌、沙门氏菌属、病原性大肠杆菌、万古霉素耐药性肠球菌属以及超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)。

证实细菌组合物的保护性作用的体外分析

在一个实施例中，提供利用细菌组合物或其子集与艰难梭菌之间的竞争的体外分析。本文和实例中提供分析法的示范性实施例。

在另一实施例中，提供利用10％(重量/体积)无菌过滤粪便(SFS)的体外分析。提供测试细菌组合物的保护性作用并且体外筛选会抑制病原体生长的微生物组合的体外分析。分析可以自动化高通量或人工模式操作。在任一系统下，人类或动物粪便可再悬浮于厌氧缓冲溶液(如预还原PBS或其它适合的缓冲剂)中，通过离心移除微粒，并且过滤灭菌。这一10％无菌过滤粪便物质充当体外分析的基础培养基。为了测试细菌组合物，研究者可将其添加到无菌过滤的粪便物质中持续第一培育时间，并且接着可用所关注的病原体接种所培育的微生物溶液持续第二培育时间。病原体的所得效价可通过任何数目的方法(例如下文所述的那些)定量，并且将病原体的量的变化与包括在不存在细菌组合物的情况下培育的病原体的标准对照相比。分析使用至少一种对照进行。来自健康个体的粪便可用作阳性对照。经抗生素处理的粪便或经热处理的粪便可用作阴性对照。可在这一物质中测试各种细菌组合物，并且将细菌组合物任选地与阳性和/或阴性对照相比。抑制病原体生长的能力可通过将培育的物质接种在艰难梭菌选择性培养基上并且计数菌落来测量。在细菌组合物与艰难梭菌之间的竞争后，将体外分析板的每一孔十倍连续稀释六次，并且接种在选择性培养基(例如(但不限于)环丝氨酸头孢西丁甘露糖醇琼脂(cycloserine cefoxitinmannitol agar，CCMA)或环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂(cycloserine cefoxitin fructoseagar，CCFA))上，并培育。接着，计数艰难梭菌的菌落以计算在竞争结束时每一孔中的活细胞浓度。艰难梭菌的菌落通过其特有的弥漫性菌落边缘形态以及在UV光下的荧光来证实。

在另一实施例中，体外分析使用经抗生素处理的粪便。在一个替代实施例中，并且代替使用10％无菌过滤的粪便，人类或动物粪便可再悬浮在厌氧缓冲溶液(例如预还原PBS或其它适合的缓冲液)中。再悬浮的粪便用抗生素(例如克林霉素(clindamycin))或若干抗生素的混合液处理，以便降低来自健康个体的粪便抑制艰难梭菌生长的能力；这一物质称为经抗生素处理的基质。虽然不受任何机制束缚，但相信健康个体中的有益细菌通过竞争过艰难梭菌来保护其免于感染。用抗生素处理粪便会杀死或减少那些有益细菌群体，使艰难梭菌在这一分析基质中生长。除了克林霉素之外抑制正常菌群的抗生素包括头孢曲松(ceftriaxone)和哌拉西林-三唑巴坦(piperacillin-tazobactam)并且可取代克林霉素。将经抗生素处理的基质离心，去除清液层，并且将集结的物质再悬浮在经过滤器灭菌、稀释的粪便中，以便去除任何残留抗生素。这一洗过的经抗生素处理的基质可代替10％无菌过滤的粪便用于上文所述的体外分析。

还提供利用细菌组合物或其子集与万古霉素耐药性屎肠球菌之间的竞争的体外分析。本文和实例中提供这一分析的示范性实施例。

还提供利用细菌组合物或其子集与摩氏摩根菌之间的竞争的体外分析。本文和实例中提供这一分析的示范性实施例。

还提供利用细菌组合物或其子集与克雷伯氏肺炎杆菌之间的竞争的体外分析。本文和实例中提供这一分析的示范性实施例。

或者，抑制病原体生长的能力可通过定量PCR(qPCR)测量。可遵照标准技术来生成所关注的病原体的标准曲线。可根据制造商的说明书使用可商购的试剂盒从样品提取基因组DNA，例如Mo Bio

-htp 96孔土壤DNA分离试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室(Mo Bio Laboratories,Carlsbad,CA))、Mo Bio/>

DNA分离试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)或QIAamp DNA粪便微型试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(QIAGEN,Valencia,CA))。qPCR可使用HotMasterMix(马里兰州盖瑟斯堡的5普莱姆公司(5PRIME,Gaithersburg,MD))和对所关注的病原体具有特异性的引物进行，并且可在具有条形码的/>

快速光学96孔反应培养板(0.1mL)(纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY))上进行，且在装备有CFX96^TM实时系统(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,CA))与FAM和ROX通道的荧光读数的BioRadC1000^TM热循环仪上进行。FAM通道上每一孔的Cq值通过CFX Manager^TM软件2.1版测定。每一实验样品的log₁₀(cfu/ml)通过以下方式计算：将既定样品的Cq值输入到由标准曲线产生的线性回归模型中，比较标准曲线孔的Cq值与那些样品的已知log₁₀(cfu/ml)。熟练的业内人士可采用替代性qPCR模式。

确定细菌组合物的保护性作用的体内分析法.

提供测试细菌组合物针对艰难梭菌的保护性作用的体内小鼠模型。在这一模型(基于Chen等人,艰难梭菌相关疾病的小鼠模型(A mouse model of Clostridiumdifficile associated disease),《胃肠病学(Gastroenterology)》135(6):1984-1992(2008))中，通过用经饮用水传递的5到7种抗生素(包括卡那霉素(kanamycin)、粘菌素(colistin)、庆大霉素(gentamycin)、甲硝哒唑(metronidazole)和万古霉素(vancomycin)且任选地包括安比西林(ampicillin)和环丙沙星(ciprofloxacin))处理7天(实验的第-12到-5天)使小鼠对艰难梭菌易感，接着在第-3天使用克林霉素的单一剂量，接着三天后在第0天借助经口管饲(即口-胃灌洗)用10⁴个芽孢的艰难梭菌攻击。细菌组合物可在艰难梭菌管饲之前(预防性处理)或之后(治疗性处理)给予。另外，细菌组合物可在(任选的)万古霉素处理(参见下文)之后给予以评估其预防复发且因此在体内抑制病原体的能力。从第-1天到第6天每天的结果评估(或除此之外，预防复发)为体重、临床征象、死亡率以及粪便中艰难梭菌的排出。在无处理的情况下通常观察到体重减轻、疾病的临床征象以及艰难梭菌排出。在第-1天到第4天通过经口管饲提供的万古霉素保护免于这些结果且充当阳性对照。临床征象是主观的，且每天由同一位有经验的观察者评分。对体重损失大于或等于25％的动物施以安乐死，并且计为感染相关的死亡数。每天从小鼠笼子(每个笼子5只小鼠)收集粪便，并且使用如上文针对体外分析法所述的选择性接种分析法或经如本文所述的针对毒素基因的qPCR检测粪便中艰难梭菌孢子的排出。包括人类粪便(作为阳性对照)、细菌组合物或PBS(作为阴性媒剂对照)的10％悬浮液的测试物质的作用通过以下方式测定：将0.2mL体积的测试物品借助经口管饲在第-1天(艰难梭菌攻击前一天)引入小鼠，在第1、2和3天作为处理或在第5、6、7和8天进行万古霉素后处理。如上文所述的万古霉素在第1天到第4天作为另一阳性对照给予。可采用替代性给药时程和投予途径(例如经直肠)，包括多个剂量的测试物品，且可传递10³到10¹⁰个既定生物体或组合物。

制备用于投予个体的细菌组合物的方法

制造细菌组合物的方法可包括三个主要加工步骤以及一个或多个混合步骤。所述步骤是：生物体储备、生物体产生以及保存

对于储备来说，细菌组合物中所包括的菌株可(1)从样本直接分离或从库存储备液获取，(2)任选地培养在支持生长以产生活生物质的营养琼脂或培养液上，以及(3)为任选地以多个等分试样形式保存在长期储存装置中的生物质。

在使用培养步骤的实施例中，琼脂或培养液可含有营养物，所述营养物提供使能够生长的必要元素和特定因子。一个实例将为由以下组成的培养基：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L大豆蛋白胨、2g/L柠檬酸、1.5g/L磷酸二氢钠、100mg/L柠檬酸铁铵、80mg/L硫酸镁、10mg/L氯化血晶素、2mg/L氯化钙、1mg/L甲萘醌。多种微生物培养基和变化为所属领域中众所周知的(例如R.M.Atlas,微生物培养基手册(Handbook of MicrobiologicalMedia)(2010)CRC出版社)。培养基可在开始时添加到培养物中，可在培养期间添加，或可间歇地/连续地流经培养物。细菌组合物中的菌株可作为细菌组合物的子组或作为包含细菌组合物的全部集合单独培育。举例来说，第一菌株可与第二菌株一起在混合连续培养物中培育，稀释率低于任一细胞的最大生长速率以防止培养物从培育物中洗出。

接种的培养物在有利的条件下培育足以建立生物质的一段时间。对于供人类使用的细菌组合物来说，这一条件通常是在37℃温度、值与正常人类生态位类似的pH以及其它参数下。环境可经主动控制、被动控制(例如借助缓冲液)或使其变动。举例来说，对于厌氧细菌组合物(例如肠道微生物群)来说，可使用缺氧性/还原性环境。这可通过向培养液中添加还原剂(例如半胱氨酸)和/或将其除氧来实现。举例来说，细菌组合物的培养物可在37℃、pH 7下在用1g/L半胱氨酸盐酸盐预还原的上述培养基中生长。

当培养物已产生足够的生物质时，可将其保存以便储备。可将生物体置放到会保护免于冷冻(添加‘低温保护剂’)、干燥(‘冻干保护剂’)和/或渗透休克(‘渗透保护剂’)的化学环境中，分配到多个(任选地同一)容器中以形成均一库，且接着处理培养物以便保存。容器总体上是不可渗透的且具有确保与环境隔离的密封件。低温保存处理通过在超低温度(例如处于或低于-80℃)下冷冻液体来实现。干燥保存通过蒸发(在喷雾干燥或‘冷却干燥’的情况下)或通过升华(例如用于冷冻干燥、喷雾冷冻干燥)从培养物中去除水。去除水会提高在升高高于低温的温度下的长期细菌组合物储存稳定性。如果细菌组合物包含芽孢形成物质且引起芽孢产生，那么最终组合物可通过例如密度梯度离心的其它手段纯化，使用上文所述技术保存。细菌组合物储备可通过单独地培养且保存菌株来进行，或通过将菌株混合在一起以形成合并库来进行。作为低温保存的一个实例，细菌组合物培养物可通过离心以使来自培养基的细胞集结来收集，倾析清液层，并且用含有15％丙三醇的新鲜培养液替换。培养物接着可等分到1mL冷冻管中，密封，并且置于-80℃下以便长期保持活力。这一程序在从冷冻储存恢复之后实现可接受的存活率。

生物体制造可使用用于储备的类似培养步骤进行，包括培养基组成和培养条件。其可在更大操作规模(尤其对于临床开发或商业制造来说)下进行。在较大规模下，在最终培育之前可存在细菌组合物的若干次传代培养。在培育结束时，采集培养物以使能够进一步配制成供投予的剂型。这可涉及浓度，去除非所需培养基组分和/或引入到保持细菌组合物且使得其对于借助所选途径投予可接受的化学环境中。举例来说，细菌组合物可培育到10¹⁰个CFU/mL的浓度，接着通过切线流微过滤浓缩20倍；用过的培养基可通过透滤用由2％明胶、100mM海藻糖和10mM磷酸钠缓冲剂组成的保存培养基更换。悬浮液接着可冻干成粉末且滴定。

在干燥之后，粉末可被掺合到适当效力，且为了坚实度和处置容易性与其它培养物和/或填充剂(例如微晶纤维素)混合，且配制细菌组合物如本文所提供。

配制品

提供用于向有需要的人类和其它个体投予的配制品。总体来说，细菌组合物与另外的活性和/或非活性物质组合产生最终产品，所述最终产品可呈单个剂量单元和多剂量形式。

在一些实施例中，组合物包含至少一种碳水化合物。“碳水化合物”指的是糖或糖的聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可以互换使用。大部分碳水化合物是具有许多羟基的醛或酮，通常分子的每一个碳原子上有一个羟基。碳水化合物通常具有分子式C_nH_2nO_n。碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。大部分基础碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是两个接合在一起的单糖。示范性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，寡糖包括介于三到六个之间的单糖单元(例如棉籽糖、水苏糖)，且多糖包括六个或更多个单糖单元。示范性多糖包括淀粉、肝糖和纤维素。碳水化合物可含有改性的糖单元，例如羟基被去除的2'-脱氧核糖，羟基经氟置换的2'-氟核糖，或N-乙酰葡糖胺，即葡萄糖的含氮形式(例如2'-氟核糖、脱氧核糖和己糖)。碳水化合物可以许多不同形式存在，例如构象异构体、环状形式、非环状形式、立体异构体、互变异构体和异构体。

在一些实施例中，组合物包含至少一种脂质。如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、甘油三酯、胆固醇、磷脂、呈任何形式的脂肪酸(包括游离脂肪酸)。脂肪、油和脂肪酸可为饱和、不饱和(顺式或反式)或部分不饱和(顺式或反式)。在一些实施例中，脂质包含至少一种选自以下的脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、十七烷酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(EPA)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(DHA)和二十四烷酸(24:0)。在一些实施例中，组合物包含至少一种改性的脂质，例如已通过烹调改性的脂质。

在一些实施例中，组合物包含至少一种补充矿物质或矿物质来源。矿物质的实例包括(但不限于)氯、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾和硒。前述矿物质中的任一个的适合形式包括可溶性矿物质盐、微溶性矿物质盐、不溶性矿物质盐、螯合矿物质、矿物质络合物、非反应性矿物质(例如羰基矿物质)和还原性矿物质以及其组合。

在一些实施例中，组合物包含至少一种补充维生素。至少一种维生素可为脂溶性或水溶性维生素。适合维生素包括(但不限于)维生素C、维生素A、维生素E、维生素B12、维生素K、核黄素、烟碱酸、维生素D、维生素B6、叶酸、吡哆醇、硫胺、泛酸以及生物素。前述中的任一个的适合形式是维生素的盐、维生素的衍生物、具有相同或相似维生素活性的化合物以及维生素的代谢物。

在一些实施例中，组合物包含赋形剂。适合赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、致密剂、润滑剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂以及着色剂。

在一些实施例中，赋形剂是缓冲剂。适合的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙以及碳酸氢钙。

在一些实施例中，赋形剂包含防腐剂。适合的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂(例如α-生育酚和抗坏血酸盐)和抗微生物剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚)。

在一些实施例中，组合物包含粘合剂作为赋形剂。适合粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C₁₂-C₁₈脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖以及其组合。

在一些实施例中，组合物包含润滑剂作为赋形剂。适合润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、史托特(sterotex)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁以及轻矿物油。

在一些实施例中，组合物包含分散增强剂作为赋形剂。适合分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶(guar gum)、高岭土、膨润土、经纯化木纤维素、乙醇酸淀粉钠、异非晶形硅酸盐以及微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。

在一些实施例中，组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施例中，崩解剂是非泡腾崩解剂。适合非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶凝和改性淀粉)、甜味剂、粘土(例如膨润土)、微晶纤维素、海藻酸盐、乙醇酸淀粉钠、胶(例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶(locust bean)、卡拉牙胶(karaya)、果胶以及黄芪胶(tragacanth))。在一些实施例中，崩解剂是泡腾崩解剂。适合泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在一些实施例中，赋形剂包含调味剂。调味剂可选自合成调味油和调味芳香族物；天然油；来自植物、叶子、花和果实的提取物；以及其组合。在一些实施例中，调味剂选自肉桂油；冬青油；胡椒薄荷油；三叶草油；干草油；大茴香油；桉树；香草；柑橘油，例如柠檬油、橙油、葡萄和葡萄柚油；以及果实香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝以及杏。

在一些实施例中，赋形剂包含甜味剂。适合甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖以及其混合物(在不用作载剂时)；糖精和其各种盐，例如钠盐；二肽甜味剂，例如阿斯巴甜(aspartame)；二氢查耳酮化合物、甘草素；甜菊(SteviaRebaudiana)(甜菊苷(Stevioside))；蔗糖的氯衍生物，例如蔗糖素；以及糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。还涵盖氢化淀粉水解产物和合成甜味剂3,6-二氢-6-甲基-1,2,3-噁噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，具体来说是其钾盐(乙酰舒泛-K(acesulfame-K))和钠盐和钙盐。

在一些实施例中，组合物包含着色剂。适合着色剂的非限制性实例包括食品、药品和化妆品颜色(FD&C)、药品和化妆品颜色(D&C)以及外用药品和化妆品颜色(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应色淀。

赋形剂或赋形剂组合在配制品中的重量分率通常是组合物总重量的约99％或更低，例如约95％或更低，约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、50％或更低、约45％或更低、约40％或更低、约35％或更低、约30％或更低、约25％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、约2％或更低，或约1％或更低。

本文中所公开的细菌组合物可配制成多种形式并且通过许多不同手段投予。组合物可以按需要含有常规可接受的载体、佐剂和媒剂的配制品形式经口、经直肠或肠胃外投予。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、或胸骨内注射或输注技术。在一个示范性实施例中，细菌组合物经口投予。

用于经口投予的固体剂型包括胶囊、片剂、囊片、丸剂、糖衣片、口含片、粉末和颗粒。胶囊通常包含芯材料(包含细菌组合物)和包封芯材料的壳壁。在一些实施例中，芯材料包含固体、液体和乳液中的至少一个。在一些实施例中，壳壁材料包含软明胶、硬明胶和聚合物中的至少一个。适合聚合物包括(但不限于)：纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙酸纤维素偏苯三酸酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、丁二酸羟丙基甲基纤维素以及羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，例如由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、铵基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯形成的那些(例如以商标名“Eudragit”销售的那些共聚物)；乙烯基聚合物和共聚物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、乙酸乙烯酯丁烯酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；和虫胶(经纯化紫胶)。在一些实施例中，至少一种聚合物充当味道掩蔽剂。

片剂、丸剂等可经压制、多次压制、多次分层和/或包衣。包衣可为单个或多个。在一个实施例中，包衣材料包含从植物、真菌和微生物中的至少一个提取的糖、多糖和糖蛋白中的至少一个。非限制性实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、纤维素、半纤维素、葡聚糖、麦芽糊精、环糊精、菊粉、果胶、甘露聚糖、阿拉伯胶、刺槐豆胶、牧豆胶(mesquite gum)、瓜尔胶、卡拉牙胶、印度树胶(gum ghatti)、黄芪胶、海萝(funori)、角叉菜胶、琼脂、海藻酸盐、壳聚糖或结冷胶(gellan gum)。在一些实施例中，包衣材料包含蛋白质。在一些实施例中，包衣材料包含脂肪和油中的至少一个。在一些实施例中，脂肪和油中的至少一个是高温熔融的。在一些实施例中，脂肪和油中的至少一个经氢化或部分氢化。在一些实施例中，脂肪和油中的至少一个来源于植物。在一些实施例中，脂肪和油中的至少一个包含甘油酯、游离脂肪酸和脂肪酸酯中的至少一个。在一些实施例中，包衣材料包含至少一种可食用蜡。可食用蜡可来源于动物、昆虫或植物。非限制性实例包括蜂蜡、羊毛脂、杨梅蜡、巴西棕榈蜡以及米糠蜡。片剂和丸剂可另外用肠溶衣制备。

或者，包含本文中所公开的细菌组合物的粉末或颗粒可并入到食品产品中。在一些实施例中，食品产品是用于经口投予的饮料。适合饮料的非限制性实例包括果汁、果饮、人工调味饮料、人工甜化饮料、碳酸化饮料、运动饮料、液体乳制品、沙冰、酒精饮料、含咖啡因饮料、婴儿配方食品等。用于经口投予的其它适合方式包括水性和非水性溶液、乳液、悬浮液和从非泡腾颗粒复水的溶液和/或悬浮液，含有适合溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、着色剂以及调味剂中的至少一个。

在一些实施例中，食物产品是固体食品。固体食品的适合实例包括(但不限于)食物棒、点心棒、小甜饼、布朗尼(brownie)、松饼、脆饼、冰淇淋棒、冷冻酸奶棒等。

在一些实施例中，本文中所公开的组合物并入到治疗性食品中。在一些实施例中，治疗性食品是即用食品，其任选地含有一些或所有必需的大量营养素和微量营养素。在一些实施例中，本文中所公开的组合物并入到经设计掺合到现有膳食中的补充食品中。在一些实施例中，补充食品含有一些或所有必需的大量营养素和微量营养素。在一些实施例中，本文中所公开的细菌组合物与现有食品掺合或添加到现有食品中以强化食品的蛋白质营养。实例包括食品主食(谷物、盐、糖、厨用油、人造奶油)、饮料(咖啡、茶、汽水、啤酒、白酒、运动饮料)、点心、甜食以及其它食品。

在一个实施例中，配制品填充到明胶胶囊中以便经口投予。适当胶囊的一个实例是250mg明胶胶囊，其含有10mg(最多100mg)冻干粉末(10⁸到10¹¹个细菌)、160mg微晶纤维素、77.5mg明胶以及2.5mg硬脂酸镁。在一个替代实施例中，可以使用10⁵到10¹²个、10⁵到10⁷个、10⁶到10⁷个或10⁸到10¹⁰个细菌，视需要伴随赋形剂的调整。在一个替代实施例中，可以使用肠溶衣胶囊或片剂或缓冲性或保护性组合物。

在一个实施例中，每一类型的细菌数量可以相同量或不同量存在。举例来说，在具有两种类型细菌的细菌组合物中，细菌可以1:10,000比率到1:1比率、1:10,000比率到1:1,000比率、1:1,000比率到1:100比率、1:100比率到1:50比率、1:50比率到1:20比率、1:20比率到1:10比率、1:10比率到1:1比率存在。对于包含至少三种类型细菌的细菌组合物来说，细菌类型的比率可从具有两种类型细菌的细菌组合物中成对选择。举例来说，在包含细菌A、B和C的细菌组合物中，细菌A与B之间的比率、细菌B与C之间的比率、以及细菌A与C之间的比率中的至少一个可从上述成对组合中独立地选择。

治疗个体的方法

在一些实施例中，将本文中所公开的蛋白质和组合物投予个体或使用者(有时统称为“个体”)。如本文所用，“投予(administer)和(administration)”涵盖一个人引导另一个人以特定方式和/或出于特定目的食用细菌组合物的实施例，并且还涵盖其中使用者与从第二人得到的任何指令无关地或有差异地以特定方式和/或出于特定目的使用细菌组合物的情形。一个人引导另一个人以特定方式和/或出于特定目的食用细菌组合物的实施例的非限制性实例包括当医师向患者开出处理和/或治疗的疗程时，当父母命令未成年使用者(例如儿童)食用细菌组合物时，当教练员建议使用者(例如运动员)准找处理和/或治疗的特定疗程时，以及当制造商、分销商或营销商向最终使用者推荐使用条件(例如经广告或者包装上或所提供的与产品销售或营销有关的其它材料上的标记)时。

细菌组合物提供针对由一种或多种所关注的GI病原体引起的感染的保护性和/或治疗性作用，且由此可在急性感染情况已解决之后投予以便防止复发，在急性感染情况期间作为抗生素疗法的补充投予(在细菌组合物并不对与GI病原体相同的抗生素敏感时)，或经投予以预防感染或减少来自疾病载体的传染。这些病原体包括(但不限于)嗜水气单胞菌、胎儿弯曲杆菌、类志贺邻单胞菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、肠聚集性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌(LT和/或ST)、大肠杆菌0157:H7、幽门螺旋杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、类志贺邻单胞菌、沙门氏菌属、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌属、葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药性肠球菌属、弧菌属、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌以及小肠结肠炎耶尔森氏菌。

在一个实施例中，病原体可以是艰难梭菌、沙门氏菌属、病原性大肠杆菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。在另一实施例中，病原体可以是艰难梭菌。

本发明细菌组合物可适用于多种临床情形。举例来说，细菌组合物可在个体患有急性感染(为了在急性感染已消退之后减少复发的风险)时或在个体将非常接近于患有严重胃肠道感染或处于严重胃肠道感染风险下的其它人(医生、护士、医院工作人员、生病或住院的那些人的家庭成员)时作为抗生素的补充治疗投予。

本发明的细菌组合物可投予动物，包括人类、实验动物(例如灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡、鸡)以及家庭宠物(例如狗、猫、啮齿动物等)。

在本发明方法中，细菌组合物经肠道投予，换句话说通过进入胃肠道的途径投予。这包括经口投予、经直肠投予(包括灌肠、栓剂或结肠镜检查)、通过经口或经鼻管(鼻胃管、鼻空肠管、口胃管或口空肠管)进行，如本文中更充分详述。

已报告GI菌群失调与糖尿病有关(Qin等人,2012.《自然(Nature)》490:55)。在一些实施例中，本文提供的组合物可用于改变患有糖尿病或易受糖尿病影响的个体的微生物丛。通常，此类组合物提供所属领域中鉴别为与胰岛素敏感性或与糖尿病(例如2型或1型糖尿病)有关的其它病征或症状的改良有关的至少一种、两种或三种OTU。在一些实施例中，组合物与糖尿病的至少一种病征或症状的改良有关的至少一种、两种或三种OTU的移入和/或扩增的增加有关。

预处理方案

在投予细菌组合物之前，个体可任选地进行使胃肠道准备好接收细菌组合物的预处理方案。在某些实施例中，预处理方案是可取的，例如当个体经高复原性病原体急性感染时。在其它实施例中，预处理方案是完全任选的，例如当引起感染的病原体并非复原性时或个体的急性感染已经成功治疗但医师担心感染可能复发时。在这些情况下，预处理方案可增强细菌组合物影响个体的微生物组的能力。

作为使个体准备好投予微生物生态系统的一种方式，可投予至少一种抗生素以改变个体中的细菌。作为使个体准备好投予微生物生态系统的另一种方式，可向个体投予标准结肠清洁制剂以大体上排空结肠内容物，例如用于使个体为结肠镜检查做准备。本申请案中“基本上排空结肠内容物”意思是去除普通结肠内容物体积的至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或约100％的内容物。抗生素治疗可先于结肠清洁方案。

在一个实施例中，如果患者已接受用于治疗感染的抗生素，或者如果患者已接受抗生素作为特定预处理方案的一部分，那么抗生素应停止足够的时间以允许在投予细菌组合物之前抗生素在消化道中的浓度基本上降低。在一个实施例中，抗生素可在投予细菌组合物之前停止1、2或3天。在一个实施例中，抗生素可在投予细菌组合物之前停止3、4、5、6或7个抗生素半衰期。在另一实施例中，可选择抗生素以使细菌组合物中的组分的MIC50高于消化道中的抗生素浓度。

细菌组合物或组合物中的成分的MIC50可通过所属领域中熟知的方法测定。Reller等人,抗微生物易感性测试：通则和当代实践的综述(AntimicrobialSusceptibility Testing:A Review of General Principles and ContemporaryPractices),《临床传染性疾病(Clinical Infectious Diseases)》49(11):1749-1755(2009)。在此类实施例中，投予抗生素与投予细菌组合物之间的额外时间并非是必需的。如果预处理方案是急性感染治疗的一部分，那么可选择抗生素使得所述感染对所述抗生素敏感，但细菌组合物中的组分对所述抗生素不敏感。

投予途径

本发明的细菌组合物适于投予有需要的哺乳动物和非哺乳动物。在某些实施例中，哺乳动物个体是具有菌群失调的一种或多种症状的人类个体。

当哺乳动物个体患有特征在于异常微生物群的疾病、病症或病况时，本文所述的细菌组合物适用于其治疗。在一些实施例中，哺乳动物个体在用细菌组合物治疗之前尚未接受抗生素。举例来说，哺乳动物个体在投予治疗性组合物前一周内尚未被投予至少两个剂量的万古霉素、甲硝哒唑和/或类似抗生素化合物。在其它实施例中，哺乳动物个体在投予治疗性组合物前一个月内尚未预先接受抗生素化合物。在其它实施例中，哺乳动物个体已接受使用一种或多种不同抗生素化合物的一种或多种处理，且所述处理不引起症状的改进或恶化。

在一些实施例中，胃肠道疾病、病症或病况是由艰难梭菌造成的腹泻，包括复发性艰难梭菌感染、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)或肠激躁疾病。有益的是，在改进疾病、病症或病况之前，治疗性组合物仅投予一次。在一些实施例中，治疗性组合物以大于两天(例如每三、四、五或六天一次、或每周一次或比每周一次更不频繁)的时间间隔投予。或者，可根据设定的时程间歇地投予制剂，例如一天一次、每周一次或每月一次，或当个体从初次疾病复发时。在另一实施例中，制剂可在长期的基础上投予处于经这些病原体感染的风险下或可能是这些病原体的携带者的个体，包括将具有侵入性医疗程序(例如手术)的个体，将住院的个体，生活在长期照护或康复设施中的个体，通过其职业暴露于病原体的个体(家畜和动物加工工人)，或可能是病原体携带者的个体(包括医院工作人员，例如医生、护士和其它医疗保健专业人士)。

在实施例中，细菌组合物经肠投予。这优选地包括经口投予，或通过经口或经鼻管(包括鼻胃管、鼻空肠管、口胃管或口空肠管)进行。在其它实施例中，投予包括经直肠投予(包括灌肠、栓剂或结肠镜检查)。细菌组合物可投予胃肠道的至少一个区域，包括口腔、食道、胃、小肠、大肠和直肠。在一些实施例中，其投予胃肠道中的所有区域。细菌组合物可以例如粉末、胶囊、片剂、凝胶或液体的药物形式经口投予。细菌组合物还可以凝胶或液体形式通过经口途径或经由鼻胃管投予，或以凝胶或液体形式通过经直肠途径投予，通过经由结肠镜灌肠或滴注投予或通过栓剂投予。

如果组合物经结肠镜投予并且任选地如果细菌组合物通过其它经直肠途径投予(例如灌肠或栓剂)，或甚至如果个体进行经口投予，那么所述个体可使用结肠清洁制剂。结肠清洁制剂可促进结肠镜或其它投予装置的适当使用，但甚至当其不提供机械目的时，其也可使细菌组合物的比例相对于预先驻留在个体胃肠道中的其它生物体最大化。任何通常可接受的结肠清洁制剂都可使用，例如当个体进行结肠镜检查时通常提供的那些。

投予的剂量和时程

在一些实施例中，细菌和细菌组合物以剂型形式提供。在一些实施例中，剂型经设计用于投予本文中所公开的至少一种OTU或其组合，其中所投予的细菌组合物的总量选自0.1ng到10g、10ng到1g、100ng到0.1g、0.1mg到500mg、1mg到100mg或10-15mg。在一些实施例中，细菌组合物以每天0.1ng到10g、每天10ng到1g、每天100ng到0.1g、每天0.1mg到500mg、每天1mg到100mg或每天10-15mg或更高的速率消耗。

在一些实施例中，治疗时间是至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年。在一些实施例中，治疗时间是1天到1周、1周到4周、1个月到3个月、3个月到6个月、6个月到1年、或超过一年。

在一个实施例中，可以指定剂型向个体投予总共10⁵到10¹²个微生物。在一种模式中，有效量可以每毫升或每克10⁷到10¹¹个细菌的1到500ml或1到500克细菌组合物提供，或以具有10⁷到10¹¹个细菌的1mg到1000mg冻干粉末的胶囊、片剂或栓剂提供。接受急性治疗的那些人与接受长期投予的那些人(例如医院工作人员或许可进入长期照护设施的那些人)相比可能接受更高剂量。

本文所述的任何制剂可在单个场合或多个场合投予一次，例如一天一次持续若干天，或在投予当天超过一天一次(包括每天两次、每天三次或每天最多五次)。或者，可根据设定的时程间歇地投予制剂，例如每周一次、每月一次，或当个体从初次疾病复发时。在另一实施例中，制剂可在长期的基础上投予处于经这些病原体感染的风险下或可能是这些病原体的携带者的个体，包括将进行侵入性医疗程序(例如手术)的个体，将住院的个体，生活在长期照护或康复设施中的个体，通过其职业暴露于病原体的个体(家畜和动物加工工人)，或可能是病原体携带者的个体(包括医院工作人员，例如医生、护士和其它医疗保健专业人士)。

个体选择

可针对个别个体或为具有特定特征的个体选择具体细菌组合物。举例来说，可为指定患者进行16S测序以鉴别他或她的微生物丛中存在的细菌。所述测序可使用16S测序描绘个体的全部微生物组(达到科、属或种层面)，使用16S测序描绘个体的微生物组的一部分，或者其可用于检测作为健康或特定疾病病况的生物标记物(例如有关的多药耐药性生物体或特定属(例如埃希氏杆菌属(Escherichia))的标记物)的特定候选细菌的存在或不存在。基于生物标记物数据，可选择具体组合物来投予患者，从而补充或补足个体的微生物丛，以便恢复健康或者治疗或预防疾病。在另一实施例中，可筛选个体以测定其微生物丛的组成，从而测定成功治疗的可能性。

组合疗法

细菌组合物可与其它药剂一起以组合疗法模式投予，包括抗微生物剂和益生元。投予可以是在数小时或数天的时间段内依序或同时进行。

在一个实施例中，组合疗法中包括细菌组合物与一种或多种抗微生物剂，所述抗微生物剂包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗寄生虫剂。

抗细菌剂包括头孢菌素抗生素(头孢力新(cephalexin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟胺苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、先锋霉素(cephalothin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁、头孢丙烯(cefprozil)和头孢吡普(ceftobiprole))；氟喹诺酮抗生素(环丙沙星(cipro)、左氧氟沙星(Levaquin)、氧氟沙星(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)和诺氟沙星(norflox))；四环素抗生素(四环素(tetracycline)、二甲胺四环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)和多西环素(doxycycline))；青霉素抗生素(阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、青霉素V(penicillin V)、双氯西林(dicloxacillin)、卡本西林(carbenicillin)、万古霉素和甲氧西林(methicillin))；和卡巴盘尼姆类抗生素(厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)/西司他汀(cilastatin)和美罗培南(meropenem))。

抗病毒剂包括阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦(Adefovir)、安普那韦(Amprenavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、西多福韦(Cidofovir)、地瑞那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、地达诺新(Didanosine)、多可沙诺(Docosanol)、依法韦仑(Efavirenz)、埃替格韦(Elvitegravir)、恩曲他滨(Emtricitabine)、恩夫韦地(Enfuvirtide)、依曲韦林(Etravirine)、泛昔洛韦(Famciclovir)、膦甲酸(Foscarnet)、福米韦生(Fomivirsen)、苷昔洛韦(Ganciclovir)、茚地那韦(Indinavir)、碘苷(Idoxuridine)、拉米夫定(Lamivudine)、洛匹那韦(Lopinavir)、马拉维若(Maraviroc)、MK-2048、奈非那韦(Nelfinavir)、奈韦拉平(Nevirapine)、喷昔洛韦(Penciclovir)、雷特格韦(Raltegravir)、利匹韦林(Rilpivirine)、利托那韦(Ritonavir)、沙奎那韦(Saquinavir)、司他夫定(Stavudine)、替诺福韦(Tenofovir)、曲氟尿苷(Trifluridine)、伐昔洛韦(Valaciclovir)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)、阿糖腺苷(Vidarabine)、伊巴他滨(Ibacitabine)、金刚胺(Amantadine)、奥司他韦(Oseltamivir)、里曼替定(Rimantidine)、替拉那韦(Tipranavir)、扎西他滨(Zalcitabine)、扎那米韦(Zanamivir)和齐多夫定(Zidovudine)。

抗真菌化合物的实例包括(但不限于)多烯抗真菌剂，例如游霉素(natamycin)、龟裂杀菌素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、耐丝他汀(nystatin)、两性霉素B(amphotericin B)、坎底辛(candicin)以及哈霉素(hamycin)；咪唑抗真菌剂，例如咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、奥莫康唑(omoconazole)、联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)和噻康唑(tioconazole)；三唑抗真菌剂，例如氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、拉夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特康唑(terconazole)和阿巴康唑(albaconazole)；噻唑抗真菌剂，例如阿巴真菌素(abafungin)；烯丙胺抗真菌剂，例如特比萘芬(terbinafine)、萘替芬(naftifine)和布替萘芬(butenafine)；和棘白菌素(echinocandin)抗真菌剂，例如阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)和米卡芬净(micafungin)。具有抗真菌特性的其它化合物包括(但不限于)水蓼辣素(polygodial)、苯甲酸、环吡酮(ciclopirox)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)和卤普罗近(haloprogin)。

在一个实施例中，细菌组合物包括于与以下中的一个或多个的组合疗法中：皮质类固醇、美沙拉嗪、美沙拉明、柳氮磺胺吡啶、柳氮磺胺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A、巯嘌呤、硫唑嘌呤、强的松、甲氨蝶呤、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、用于鼻炎的抗胆碱能药物、抗胆碱能解充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗IgE抗体、疫苗以及其组合。

益生元是选择性发酵的成分，其允许为宿主康乐和健康赋予益处的胃肠道微生物群的组成和/或活性两方面的特定变化。益生元可包括复杂碳水化合物、氨基酸、肽或用于细菌组合物存活的其它必需营养组分。益生元包括(但不限于)氨基酸、生物素、果寡糖、半乳寡糖、菊塘、乳果糖、甘露寡糖、富果寡糖菊塘、果寡糖、寡右旋糖、塔格糖、反式半乳寡糖和木寡糖。

表征细菌组合物的方法

在某些实施例中，提供测试细菌组合物的某些特征的方法举例来说，测定细菌组合物对某些环境变量的敏感性，例如以便选择指定组合物、配制品和/或用途中的具体所需特征。举例来说，可测试细菌组合物中的组分的pH抗性、胆酸抗性和/或抗生素敏感性，个别地在逐个组分的基础上测试，或共同作为包含多个细菌组分的细菌组合物(在这一部分中统称为细菌组合物)测试。

pH敏感性测试.如果细菌组合物将投予除结肠或直肠之外的地方(即通过例如(但不限于)经口途径)，那么任选地测试pH抗性会增强对细菌组合物的选择，所述细菌组合物将贯穿胃肠道的不同区域的不同pH环境始终以可能的最高产率存活。理解细菌组合物对胃肠道的pH会如何反应也有助于配制，使得剂型中的细菌数目可在有益时升高和/或使得组合物可以肠包衣胶囊或片剂形式或与缓冲性或保护性组合物一起投予。由于胃的pH可在高蛋白膳食之后下降到1到2的pH持续较短时间，随后生理机制将其调节到3到4的pH，并且通常处在4到5的静息pH，并且由于小肠的pH可在6到7.4的pH范围内变化，因此可制备会经受住这些不同pH范围的细菌组合物(具体来说，其中至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多达100％的细菌可经各种pH范围经受住肠道运送时间)。这可以通过将细菌组合物暴露于不同pH范围以便通过那些pH范围持续预期的肠道运送时间来测试。因此，仅作为一个非限制性实例，细菌组合物的18小时培养物可以在标准培养基中生长，例如肠道微生物群培养基(“GMM”，参见Goodman等人,在限菌小鼠中表征和操纵的广泛个人的人类肠道微生物丛培养收集物(Extensive personal human gutmicrobiota culture collections characterized and manipulated in gnotobioticmice),《美国国家科学院院刊》108(15):6252-6257(2011))或另一不含动物产物的培养基，且添加pH调节剂以实现1到2的pH持续30分钟，3到4的pH持续1小时，4到5的pH持续1到2小时，以及6到7.4的pH持续2.5到3小时。一种测试酸稳定性的替代性方法描述于美国专利第4,839,281号中。细菌的存活可以通过在适当选择性或非选择性培养基上培养细菌且计数菌落来测定。

胆酸敏感性测试.另外，在一些实施例中，对胆酸抗性的测试会提高细菌组合物的选择，所选细菌组合物将在通过胃肠道运送期间经受住胆酸暴露。胆酸分泌到小肠中且可像pH一样影响细菌组合物的存活。这可以通过使细菌组合物暴露于胆酸持续预期的肠道胆酸暴露时间来测试。举例来说，可使用pH 9的0.05mM Tris作为溶剂制备所需浓度的胆酸溶液。在胆酸溶解之后，可用10％HCl将溶液的pH调整到7.2。细菌组合物可以在2.2ml模拟个体胆酸浓度和类型的胆酸组合物、1.0ml 10％无菌过滤的粪便培养基和0.1ml指定细菌菌株的18小时培养物中培养。培育可进行2.5到3小时或更长时间。一种测试胆酸稳定性的替代性方法描述于美国专利第4,839,281号中。细菌的存活可以通过在适当选择性或非选择性培养基上培养细菌且计数菌落来测定。

抗生素敏感性测试.作为另一任选的敏感性测试，可测试细菌组合物对抗生素的敏感性。在一个实施例中，可选择细菌组合物以使细菌组分对抗生素敏感，使得必要时其可通过靶向所述细菌组合物的至少一种抗生素从个体的胃肠道消除或实质上减少。

对胃肠道细胞的粘附.可任选地测试细菌组合物粘附于胃肠道细胞的能力。一种测试对胃肠道细胞的粘附的方法描述于美国专利第4,839,281号中。

根据本说明书内所引用的参考文献的教示最彻底地理解本说明书。本说明书内的实施例提供实施例的说明且不应理解为限制范围。熟练的业内人士容易认识到涵盖许多其它实施例。本发明中所引用的所有公开案和专利都以其全文引用的方式并入。以引用的方式并入的材料达到与本说明书矛盾或不一致的程度时，本说明书将取代任何此类材料。对本文中任何参考文献的引用都并非承认所述参考文献是现有技术。

除非另外指明，否则本说明书(包括权利要求书)中所用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非指出为相反，否则数字参数是近似值且可取决于致力于获得的所需性质而变化。最低限度地，并且不打算限制将等效物原则应用于权利要求书的范围，应根据有效数字的数值和一般四舍五入法来理解每一数值参数。

除非另外指明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指所述系列中的每个元素。

实例

以下为执行本发明的特定实施例的实例。实例仅出于说明性目的提供，并且不打算以任何方式限制本发明的范围。已作出努力以确保关于所使用的数字的准确度(例如量、温度等)，但当然允许一些实验性误差和偏差。本文关于治疗性组合物所述的技术和方案的实例可见于例如《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第16版,Osol,A.(编),1980。

实例1.在高通量96孔形式/培养板制备中构建二元对

细菌对用于鉴别适用于抑制艰难梭菌的二元对。为了制备用于二元对的高产量筛选分析法的培养板，将-80℃丙三醇原料细菌库的小瓶解冻并且稀释到1e8CFU/mL。每一菌株接着10×稀释(达到每一菌株1e7CFU/mL的最终浓度)到96孔培养板孔中的200μL PBS+15％丙三醇中。接着在-80℃下冷冻培养板。在需要时，当在CivSim分析中与艰难梭菌一起测试时，将培养板从-80℃移出并且在室温下在厌氧条件下解冻。

实例2.在高通量96孔形式中构建三元组合

使用细菌的三重组合鉴别适用于抑制艰难梭菌的三元组合。为了制备用于高产量筛选三元组合的培养板，将-80℃丙三醇原料细菌库的小瓶解冻并且稀释到1e8CFU/mL。每一菌株接着10×稀释(达到每一菌株1e7CFU/mL的最终浓度)到96孔板孔中的200μL PBS+15％丙三醇中。接着在-80℃下冷冻板。在分析需要时，当在CivSim分析中与艰难梭菌一起测试时，将培养板从-80℃移出并且在室温下在厌氧条件下解冻。

实例3.构建筛选抑制艰难梭菌生长的细菌组合物的CivSim分析

使用竞争分析法(CivSim分析法)鉴别可抑制艰难梭菌生长的组合物。简单来说，艰难梭菌的隔夜培养物在厌氧条件下在SweetB-FosIn中生长，以使艰难梭菌生长。在一些情况下，可使用其它适合培养基。SweetB-FosIn是补充有如下若干组分的BHI(RemelR452472)型式：每升的组分：37g BHI粉末(Remel R452472)，补充有5g酵母提取物UF(Difco210929)、1g半胱氨酸-HCl(Spectrum C1473)、1g纤维二糖(Sigma C7252)、1g麦芽糖(Spectrum MA155)、1.5ml血晶素溶液、1g可溶性淀粉(Sigma-Aldrich S9765)、1g低聚果糖/菊糖(Jarrow Formulas 103025)以及50mL 1M MOPS/KOH pH 7。为了制备血晶素溶液，将血晶素(Sigma 51280)溶解于0.1M NaOH中制备10mg/mL原料。

生长24小时后，将培养物在复合培养基SweetB-FosIn中稀释100,000倍。在一些实施例中，选择可生长全部所要生物体的培养基，即所述培养基适于生长多种厌氧细菌物种，并且在一些情况下兼性厌氧细菌物种。稀释的艰难梭菌混合物接着等分到96孔培养板的孔中(每孔180μL)。接着向各孔中添加20μL细菌组合物，每种或两种或三种物种的最终浓度为1e6CFU/mL。或者，分析可用不同初始浓度(1e9CFU/mL、1e8CFU/mL、1e7CFU/mL、1e5CFU/mL、1e4CFU/mL、1e3CFU/mL、1e2CFU/mL)的二元对测试。包括仅用艰难梭菌接种的对照孔以供与无抑制的艰难梭菌生长比较。另外的孔用于抑制或不抑制艰难梭菌生长的对照。抑制生长的阳性对照的一个实例是尾叶布劳特氏菌、双酶梭菌和大肠杆菌的组合。展示艰难梭菌生长抑制减少的对照的一个实例是多形拟杆菌、卵形拟杆菌和普通拟杆菌的组合。培养板用石蜡膜包裹，并且在37℃下在厌氧条件下培育24小时。在24小时之后，将含有单独艰难梭菌的孔连续稀释并且接种以测定效价。96孔培养板接着在-80℃下冷冻，随后通过qPCR分析法定量艰难梭菌(参看实例6)。在这一分析法中抑制艰难梭菌的实验组合适用于预防或治疗艰难梭菌感染的组合物中。

实例4.构建使用过滤器插入物筛选产生会抑制艰难梭菌生长的可扩散产品的细菌组合物的CivSim分析

为了鉴别可产生抑制艰难梭菌的可扩散产品的细菌组合物，设计改良的CivSim分析。在这一实验中，上文所述的CivSim分析通过以下方式改良：在96孔型式中使用0.22μM过滤器插入物(Millipore^TM MultiScreen^TM96孔分析培养板-项目MAGVS2210)以使用物理方式分离艰难梭菌与细菌组合物。将艰难梭菌等分到96孔培养板中，同时将细菌组合物等分到过滤器覆叠片上的培养基中。营养/生长培养基与0.22μM过滤器的两侧接触，允许营养物、小分子和许多大分子(例如细菌素、细胞表面蛋白或多糖)通过扩散交换。在这一实施例中，在24小时培育之后，移出含有细菌组合物的过滤器插入物。接着，将含有艰难梭菌的培养板转移到适用于在600nm下测量光密度(OD)的96孔培养板读取器。基于OD测量值比较在不同细菌组合物存在下的艰难梭菌的生长。这些实验的结果证明可以鉴别出在不允许组合物中的细菌与艰难梭菌接触的条件下在共用培养基中生长时可抑制艰难梭菌的组合物。此类组合物是产生可扩散产品的候选物，所述候选物有效处理艰难梭菌感染并且可用作分离此类可扩散产品的方法的部分(例如用于处理感染)。

实例5.构建使用用于定量的艰难梭菌选择性培养基筛选抑制艰难梭菌生长的细菌组合物的CivSim分析

可改良上文所述的CivSim分析，从而通过连续稀释且接种到艰难梭菌选择性培养基(Bloedt等人2009)(例如CCFA(环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂，厌氧生物系统公司(Anaerobe Systems))、CDSA(艰难梭菌选择性琼脂，其为环丝氨酸头孢西丁甘露糖醇琼脂，百克顿-迪金森公司(Becton Dickinson)))来测定最终艰难梭菌效价。

实例6.使用定量PCR(qPCR)定量艰难梭菌

A.标准曲线制备

为了定量艰难梭菌，例如CivSim分析中，从各分析板上仅含有在如本文所提供的SweetB+FosIn培养基中生长的病原性艰难梭菌的孔产生标准曲线并且通过选择性点接种定量。在无菌磷酸盐缓冲盐水中进行培养物的连续稀释。与其它孔一起从标准曲线样品提取基因组DNA。

B.基因组DNA提取

使用稀释、冷冻/解冻和热溶解方案从5μl各样品提取基因组DNA。将5μL解冻的样品添加到45μL超纯水(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中并且通过吸液混合。将培养板与稀释的样品一起在-20℃下冷冻，直到用于qPCR，所述qPCR包括在扩增之前的加热溶解步骤。或者，可根据制造商说明书使用Mo Bio

-htp 96孔土壤DNA分离试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)、MoBio />

DNA分离试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)或QIAamp DNA粪便微型试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司)分离基因组DNA。

C.qPCR组合物和条件

qPCR反应混合物含有1×SsoAdvanced通用探针超混合液(Universal ProbesSupermix)、900nM Wr-tcdB-F引物(AGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTG，爱荷华州考若维尔的IDT公司(IDT,Coralville,IA))、900nM Wr-tcdB-R引物(CATGCTTTTTTAGTTTCTGGATTGAA，爱荷华州考若维尔的IDT公司)、250nM Wr-tcdB-P探针(6FAM-CATCCAGTCTCAATTGTATATGTTTCTCCA-MGB，纽约州格兰德岛的生命技术公司)以及分子生物学等级水(Molecular Biology Grade Water，加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)达到18μl(引物由弗罗布莱夫斯基D.(Wroblewski,D.)等人,艰难梭菌的快速分子表征和粪便样本中的艰难梭菌群体评估(Rapid Molecular Characterization ofClostridium difficile and Assessment of Populations of C.difficile in StoolSpecimens),《临床微生物学杂志(Journal of Clinical Microbiology)》47:2142-2148(2009)调适)。将这一反应混合物等分到硬壳低剖面薄壁96孔带缘PCR培养板(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司)的孔中。向这一反应混合物中，添加2μl经稀释、冷冻以及解冻的样品，且用Microseal‘B’粘合密封胶(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司)密封培养板。在装备有CFX96^TM实时系统的BioRad C1000^TM热循环仪(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司)上进行qPCR。热循环条件是95℃持续15分钟，接着是95℃持续5秒、60℃持续30秒的45个循环，且对FAM通道荧光读数。或者，qPCR可与所属领域的技术人员已知的其它标准方法一起进行。

D.数据分析

FAM通道上每一孔的Cq值通过CFX Manager^TM软件3.0版测定。艰难梭菌每一实验样品的log₁₀(cfu/mL)通过以下方式计算：将指定样品的Cq值输入到由标准曲线产生的线性回归模型中，比较标准曲线孔的Cq值与那些样品的已知log₁₀(cfu/mL)。每一样品的对数抑制通过以下方式计算：从未添加额外细菌的用于产生标准曲线的每一分析板上的样品中的艰难梭菌的log₁₀(cfu/mL)中减去样品中的艰难梭菌的log₁₀(cfu/mL)。计算每一组合物的所有重复的平均对数抑制。

绘制每一组合物的范围和标准偏差的直方图。将与总体分布不同的对数抑制的范围或标准偏差检查为可能的离群值。如果从在直方图中鉴别的二元对中的一个去除单个对数抑制数据将使范围或标准偏差符合大部分样品的范围或标准偏差，那么将所述数据作为离群值去除，并且重新计算平均对数抑制。

将在分析中评估的所有样品的合并方差估计为利用样品自由度加权的样品方差平均值。接着，合并标准误差按合并方差的平方根除以样品数量的平方根计算。零假设的置信区间利用将合并标准误差乘以对应于既定阈值百分比的z分数来测定。置信区间之外的平均对数抑制被视为抑制性(如果为正数)或刺激性(如果为负数)，并且置信度百分比对应于所用区间。零假设的平均对数抑制大于99％置信区间(C.I)的样品报告为++++，95％<C.I.<99％的那些为+++，90％<C.I.<95％的那些为++，80％<C.I.<90％的那些为+，而零假设的平均对数抑制小于99％置信区间(C.I)的样品报告为----，95％<C.I.<99％的那些为---，90％<C.I.<95％的那些为--，80％<C.I.<90％的那些为-。

实例7.通过细菌组合物抑制艰难梭菌生长

使用本文所述的方法，鉴别可抑制艰难梭菌的二元对(参看表4)。989个组合中的622个展示出抑制，且置信区间>80％；989个中的545个的C.I.>90％；989个中的507个C.I.>95％；989个中的430个的C.I.>99％。非限制性但示范性二元对包括平均对数下降值大于0.366的那些，例如与尾叶布劳特氏菌、哈思韦梭菌(Clostridium hathaweyi)或产气柯林斯菌(Colinsella aerofaciens)成对的沙氏另枝菌(Allistipes shahii)，或与无害梭菌(C.innocuum)、第三梭菌(C.tertium)、产气柯林斯菌成对的马犹姆贝梭菌(Clostidiummayombei)，或表4中所示的其它424个组合中的任一个。同样重要的，CivSim分析描述不有效抑制艰难梭菌的二元对。989个组合中的188个促进生长，>80％置信度；989个中的52个显示缺乏抑制，>90％可信度；989个中的22个显示缺乏抑制，>95％可信度；989个中的3个(包括与灵巧粪球菌组合的尾叶布劳特氏菌、与多尔氏产甲酸菌组合的莎氏另枝菌(Alistipesshahii)以及与肠道罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)组合的直肠真杆菌(Eubacteriumrectale))显示缺乏抑制，>99％可信度。989个组合中的249个在分析中是中性的，意味着其既不促进也不抑制艰难梭菌生长到测量限值。

零假设的平均对数抑制大于99％置信区间(C.I)的三元组合报告为++++，95％<C.I.<99％的那些为+++，90％<C.I.<95％的那些为++，80％<C.I.<90％的那些为+，而零假设的平均对数抑制小于99％置信区间(C.I)的样品报告为----，95％<C.I.<99％的那些为---，90％<C.I.<95％的那些为--，80％<C.I.<90％的那些为-。

CivSim分析结果证明许多三元组合可抑制艰难梭菌(表4)。632个三元组合中的516个展示出抑制，且置信区间>80％；632个中的507个的C.I.>90％；632个中的496个C.I.>95％；632个中的469个的C.I.>99％。非限制性但示范性三元组合包括评分为++++的那些，例如产气柯林斯菌、陪伴粪球菌和尾叶布劳特氏菌。CivSim分析还描述不有效抑制艰难梭菌的三元组合。632个组合中的76个促进生长，>80％置信度；632个中的67个促进生长，>90％置信度；632个中的61个促进生长，>95％置信度；以及632个组合中的49个(例如(但不限于)奥比赛登梭菌、陪伴粪球菌和普氏粪杆菌)促进生长，>99％置信度。632个组合中的40个在分析中是中性的，意味着其既不促进也不抑制艰难梭菌生长到置信度限值。

>99％置信度的抑制艰难梭菌的三元组合中，有效抑制艰难梭菌的那些可以通过比较其平均对数抑制与所测试的全部三元组合的全部结果的分布来鉴别。高于第75百分位的那些可以认为有效抑制艰难梭菌。或者，高于第50百分位、第60百分位、第70百分位、第80百分位、第90百分位、第95百分位或第99百分位的那些可以视为有效抑制艰难梭菌。高于第75百分位的非限制性但示范性三元组合包括尾叶布劳特氏菌、第三梭菌和活泼瘤胃球菌以及直肠真杆菌、马犹姆贝梭菌和布氏瘤胃球菌。

除了证明许多二元和三元组合抑制艰难梭菌以外，CivSim证明许多这些组合协同抑制艰难梭菌。证明抑制艰难梭菌生长的协同作用的示范性三元组合包括(但不限于)尾叶布劳特氏菌、无害梭菌、奥比赛登梭菌以及产气柯林斯菌、尾叶布劳特氏菌和直肠真杆菌。例如表4a、4b和14-21通篇提供额外适用组合。

在CivSim分析中测试两种高阶细菌组合物对艰难梭菌的抑制。N1962(也称为S030和N1952)是一种15元组合物，其将艰难梭菌抑制平均2.73log10CFU/mL，标准差0.58log10CFU/mL，而N1984(也称为S075)是一种9元组合物，其将艰难梭菌抑制平均1.42log10CFU/mL，标准差0.45log10CFU/mL。

这些数据共同证明CivSim分析可用于鉴别含有有效抑制生物体(例如病原性生物体，例如艰难梭菌)的生长、促进其生长或对其生长不起作用的多个物种的组合物。

实例8.体内验证三元组合在艰难梭菌感染的鼠类模型中的功效.

为了测试细菌组合物(例如(但不限于)孢子群)的治疗可能性，使用艰难梭菌感染的预防性小鼠模型(模型基于Chen等人.2008.艰难梭菌相关疾病的小鼠模型(A mousemodel of Clostridium difficile-associated disease).《胃肠病学(Gastroenterology)》135:1984-1992)。简单来说，实验的每个组测试两笼小鼠，每笼五只。在第-14天到第-5天，全部小鼠在其饮用水中接收由以下组成的抗生素混合物：10％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5U/ml)、甲硝哒唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、安比西林(0.1mg/ml)以及万古霉素(0.056mg/ml，并且在第-3天通过经口管饲接收10mg/kg剂量的克林达霉素。在第-1天，测试组合物在12,100rcf下旋转5分钟，去除其清液层，并且将剩余团粒再悬浮于无菌PBS中，如果细菌组合物不是孢子形式，那么预还原，并且通过经口管饲传递。在第0天，通过经口管饲投予约4.5log10 cfu艰难梭菌(ATCC 43255)或无菌PBS(针对未处理组)攻击小鼠。基于通过组合外观评分(基于正常、缩成一团、竖毛或昏睡0-2点)与临床征象(基于正常、湿尾症、摸起来冷或与其它动物隔离0-2点)的0-4标度，死亡的情况下评分为4，从第-2天到第6天每天评定艰难梭菌症状的死亡率、体重和临床评分。计算相对于第-1天的平均最小体重和平均最大临床评分以及平均累计死亡率。使用相对于媒剂对照物降低的死亡率、相对于第-1天增加的平均最小体重以及指配评分4的死亡的降低的平均最大临床评分来评定测试组合物抑制艰难梭菌感染的能力。

在上文所述的鼠类模型中在每种菌株1e9CFU/mL下测试三元组合。结果显示于表5中。数据表明CivSim分析结果高度预测组合抑制艰难梭菌感染引起的体重减轻的能力。这一模型中的体重减轻一般认为是疾病的指示。

在一个实施例中，可以通过功能性度量标准对组合物分级来选择筛选体内功效的组合物，例如(但不限于)体外生长抑制评分；分级≥第75百分位的组合物可以视为有效抑制生长并且选择用于体内验证功能性表型。在其它实施例中，高于第50百分位、第60百分位、第70百分位、第80百分位、第90百分位、第95百分位或第99百分位的组合物可以认为是最佳候选物。在另一实施例中，选择零假设的平均对数抑制大于99％信赖区间(C.I)的组合。在其它实施例中，选择大于95％、90％、85％或80％信赖区间(C.I.)的组合物。在另一实施例中，选择被证实具有协同抑制的组合物(参看实例7)在上文所述的体内模型中进行测试。

还可以使用生长抑制度量标准的组合对选用于在体内模型中进行功效筛选的组合物进行选择。在非限制性实例中：(i)基于对数抑制大于零假设的99％信赖区间(C.I.)选择组合物，(ii)组合物的所选亚群经进一步选择来表示组合物中在全部抑制评分的分布中分级≥第75百分位的那些，(iii)接着基于证明协同抑制的组合物进一步选择(ii)的亚群。在一些实施例中，使用不同置信区间(C.I.)和百分位数建立组合物子群，例如参看表4b。

所选十二种示范性三元组合中，全部证实在CivSim分析中以>99％置信度抑制艰难梭菌(参看实例6)。十二种组合物中的十种与媒剂对照物比较平均最小相对体重时证实保护性作用。全部十二种组合物的平均最大临床评分超过媒剂，而十二种组合物中的十一种的累计死亡率超过媒剂对照物。非限制性但示范性三元组合产气柯林斯菌、丁酸梭菌和活泼瘤胃球菌对艰难梭菌感染的症状具有保护性，产生平均最小相对体重0.96，平均最大临床评分0.2以及累计死亡率0％，相比之下，媒剂对照物分别为0.82、2.6和30％。这些结果证明体外CivSim分析可用于鉴别在体内鼠类模型中具有保护性的组合物。这因为体内生物学系统的固有动态性质和体外分析法的固有简化而出人意料；没有预料到体内抑制和功效措施中具有直接体外相关性。这部分因为投予组合物进行治疗的体内系统的复杂性，其中可能已预料到混淆因素将遮蔽或影响认为体外有效的组合物在体内有效的能力。

实例9.使用针对定量和组合物筛选的万古霉素耐药性肠球菌选择性培养基构建筛选抑制万古霉素耐药性肠球菌(VRE)生长的细菌组合物的CivSim分析

为了测定组合物与病原性细菌(例如万古霉素耐药性肠球菌)竞争的能力，开发竞争分析法。在这些实验中，屎肠球菌的万古霉素耐药性菌株的隔夜培养物在SweetB-FosIn中厌氧生长24小时。细菌组合物的丙三醇原料从-80℃解冻并且在96孔培养板的适当孔中在SweetB-FosIn中稀释到每菌株1e6CFU/mL。培养板在37℃下厌氧培育1小时以使事先冷冻的细菌恢复。1小时初始培育后，将VRE以1e2或1e3CFU/mL目标浓度接种到适当孔中。各孔也在无细菌组合物的情况下用单独VRE接种。培养板在37℃下厌氧培育24小时。在15小时和24小时去除等分试样并且测定VRE效价。在每个时间点，孔内容物连续稀释并且接种到对VRE具有选择性的琼脂板(Enterococcosel Agar+8μg/mL万古霉素盐酸盐)(EnterococcoselAgar来自BBL212205，万古霉素盐酸盐来自94747)。选择性培养板在37℃下好氧培育24小时，随后计数菌落以测定CivSim培养板的各孔中的最终VRE效价。通过从含有单独VRE的孔的最终效价减去竞争孔的最终效价来测定VRE的对数抑制。测试VRE和细菌组合物的多个起始浓度比率使导致最大信号的条件最佳。15小时竞争时间、1e2CFU/mL的VRE起始浓度和1e6CFU/mL的N1962(也称为S030和N1952)起始浓度显示与对照组相比最大的生长抑制。

使用上文所述的条件，在分析法中测试15元并且44种异源测试细菌组合物。测试的44种异源三聚组合物中，43种以置信度抑制VRE，41种以>95％置信度抑制VRE并且39种以>99％置信度抑制VRE。测试的一种三元组合物不证明以>80％置信度抑制或诱导。

以>99％置信度抑制VRE的三元组合中，有效抑制VRE的那些可以通过与所测试的全部三元组合的全部结果比较平均对数抑制来鉴别。高于第75百分位的那些可以认为有效抑制VRE。或者，高于第50百分位、第60百分位、第70百分位、第80百分位、第90百分位、第95百分位或第99百分位的那些可以视为有效抑制VRE。以>99％置信度和高于第75百分位抑制VRE的非限制性但示范性三元组合包括尾叶布劳特氏菌、无害梭菌和活泼瘤胃球菌以及尾叶布劳特氏菌、丁酸梭菌和同型丙酸梭菌。

15元组合物N1962(也称为S030和N1952)在所测试的所有条件下将VRE抑制至少0.7log10CFU/mL并且表明在最佳条件中抑制5.7log10CFU/mL。

这些数据表明鉴别适用于预防和治疗VRE感染的组合物的方法。

实例10.构建使用用于定量的克雷伯氏菌选择性培养基筛选抑制克雷伯氏肺炎杆菌生长的细菌组合物的CivSim分析.

为了测定组合物与病原性细菌(例如克雷伯氏肺炎杆菌)竞争的能力，开发竞争分析法。在这些实验中，克雷伯氏肺炎杆菌的万古霉素耐药性菌株的隔夜培养物在SweetB-FosIn中厌氧生长24小时。细菌组合物(N1962)的丙三醇原料从-80℃解冻并且在96孔培养板的适当井中在SweetB-FosIn中稀释到每菌株1e6CFU/mL。培养板在37℃下厌氧培育1小时以使事先冷冻的细菌恢复。1小时初始培育后，将克雷伯氏肺炎杆菌以1e2或1e3CFU/mL的目标浓度接种到适当孔中。各孔也在无细菌组合物的情况下用单独克雷伯氏肺炎杆菌接种。培养板在37℃下厌氧培育24小时。在15小时和24小时去除等分试样以在竞争结束时滴定克雷伯氏肺炎杆菌的最终浓度。在每个时间点，各孔连续稀释并且接种到对克雷伯氏肺炎杆菌具有选择性的琼脂板(麦康凯乳糖琼脂(MacConkey Lactose Agar),天惠华M0149(Teknova M0149))。选择性培养板在37℃下好氧培育24小时，随后计数菌落以测定CivSim培养板的各孔中的最终克雷伯氏肺炎杆菌效价。通过从含有单独克雷伯氏肺炎杆菌的孔的最终效价减去竞争孔的最终效价来测定克雷伯氏肺炎杆菌的对数抑制。测试克雷伯氏肺炎杆菌和细菌组合物的多个起始浓度比率以使获得最大信号的条件最佳。分析结果提供于表7中。15小时竞争时间、1e2CFU/mL的克雷伯氏肺炎杆菌起始浓度和1e6CFU/mL的N1962(也称为S030和N1952)起始浓度显示与对照组相比最大的生长抑制。N1962(也称为S030和N1952)在所测试的条件下将克雷伯氏肺炎杆菌抑制0.1-4.2log10CFU/mL。

实例11.构建使用用于定量的摩根氏菌属选择性培养基筛选抑制摩氏摩根菌生长的细菌组合物的CivSim分析.

为了测定组合物与病原性细菌(例如摩氏摩根菌)竞争的能力，开发竞争分析法。在这一实验中，摩氏摩根菌的万古霉素耐药性菌株的隔夜培养物在SweetB-FosIn中厌氧生长24小时。细菌组合物N1962的丙三醇原料从-80℃解冻并且在96孔培养板的适当井中在SweetB-FosIn中稀释到每菌株1e6CFU/mL。培养板在37℃下厌氧培育1小时以使事先冷冻的细菌恢复。1小时初始培育后，将摩氏摩根菌以1e2或1e3CFU/mL目标浓度接种到适当孔中。各孔也在无细菌组合物的情况下用单独摩氏摩根菌接种。培养板在37℃下厌氧培育24小时。在15小时和24小时去除等分试样以在竞争结束时滴定摩氏摩根菌的最终浓度。在每个时间点，各孔连续稀释并且接种到对摩氏摩根菌具有选择性的琼脂板(麦康凯乳糖琼脂,天惠华M0149)。选择性培养板在37℃下好氧培育24小时，随后计数菌落以测定CivSim培养板的各孔中的最终摩氏摩根菌效价。通过从含有单独摩氏摩根菌的孔的最终效价减去竞争孔的最终效价来测定摩氏摩根菌的对数抑制。测试摩氏摩根菌和细菌组合物的多个起始浓度比率以使提供最大信号的条件最佳。15小时竞争时间、1e2CFU/mL的摩氏摩根菌起始浓度和1e6CFU/mL的N1962(也称为S030和N1952)起始浓度显示与对照组相比最大的生长抑制。

在分析法中测试15元细菌组合物N1962(也称为S030和N1952)，其结果提供于表8中。N1962(也称为S030和N1952)在所测试的条件下将摩氏摩根菌抑制1.4到5.8log10CFU/mL。

实例12.操作分类单位(OTU)和功能性基因的基于序列的基因组表征

测定16S rDNA基因序列的方法

如上文所述，OTU通过rDNA基因的完整16S测序、通过这一基因的特异性高变区(即V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8或V9)的测序、或通过来自这一基因的高变区的任何组合(例如V1-3或V3-5)的测序进行定义。细菌16S rDNA的长度是约1500个核苷酸，且用于使用系统发生方法重建一种细菌分离物与另一种细菌分离物的进化关系和序列相似性。16S序列用于系统发生重建，因为其总体上高度保守，但含有特异性高变区，所述特异性高变区具有足够的核苷酸多样性来区分大部分微生物的属和种。rDNA基因测序方法适用于分析非增浓样品，还适用于在从微生物组合物或微生物样品增浓所关注的微生物的增浓步骤之后鉴别微生物和/或鉴别具有如下文所述的适当rDNA基因序列的核酸。举例来说，16S rDNA基因表征之前的增浓处理将提高16S以及从微生物纯化的核酸的基于其它分子的表征的灵敏度。

使用所属领域中已知的技术，为了测定完整16S序列或16S rDNA序列的任何高变区的序列，从细菌样品提取基因组DNA，使用聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA(完整区域或特异性高变区)，清洗PCR产物，并且描绘测定16S基因或所述基因的子域的遗传学组成的核苷酸序列。如果进行完整16S测序，那么所用测序方法可以是(但不限于)桑格测序(Sangersequencing)。如果使用一个或多个高变区(例如V4区)，那么测序可以(但不限于)使用桑格方法或使用下一代测序方法(例如使用允许多重反应的条形码引物的Illumina(边合成边测序)方法)进行。

测定18S rDNA和ITS基因序列的方法

可以通过分析18S序列和内部经转录间隔子(ITS)来实现通过遗传学方式分配和鉴别真菌OTU的方法。形成核糖体的核的真菌的rRNA转录成单个基因并且由8S、5.8S和28S区域组成，在8S和5.8S以及5.8S和28S区域之间分别具有ITS4和5。18S和5.8S以及5.8S和28S区域之间的这两个顺反子间区段通过剪接去除并且在如上文所述的条形码目的的物种之间含有显著变化(Schoch等人,作为真菌的通用DNA条码标记物的核核糖体内部转录间隔子(ITS)区域(Nuclear ribosomal internal transcribed spacer(ITS)region as auniversal DNA barcode marker for Fungi).美国国家科学院院刊USA 109:6241-6246.2012)。18S rDNA通常用于系统发生重构，然而ITS可起这一作用，因为其一般高度保守但含有具有充分核苷酸多样性以区别大部分真菌的属和种的高变区。

使用所属领域中已知的技术，为了测定完整18S和ITS序列或这些序列的较小高变区，从微生物样品提取基因组DNA，使用聚合酶链反应(PCR)扩增rDNA，清洗PCR产物，并且描绘测定基因的遗传学组成rDNA基因或子域的核苷酸序列。所用测序方法可以是(但不限于)桑格测序或使用下一代测序方法，例如使用进行多路反应的带条形码的引物的Illumina(边合成边测序)方法。

用于测定其它标记物基因序列的方法

除了16S和18S rDNA基因之外，OTU可以通过对作为指定OTU种或分类组的已知标记物基因的所选基因集合或基因的部分进行测序来定义。这些基因或者可以使用基于PCR的筛选策略分析。举例来说，病原性大肠杆菌的多个菌株可以使用以下区别：来自编码热不稳定(LTI、LTIIa以及LTIIb)和热稳定(STI和STII)毒素的基因的DNA、1型、2型以及2e型志贺样毒素(分别VT1、VT2以及VT2e)、细胞毒性坏死性因子(CNF1和CNF2)、连接和抹去机制(eaeA)、肠聚集性机制(Eagg)以及肠侵袭性机制(Einv)。基于序列的分类鉴别领域的普通技术人员将熟悉通过使用标记物基因分类分配OTU的最佳基因。

基因组DNA提取

可以使用热碱溶解法从纯或增浓微生物培养物提取基因组DNA。举例来说，1μl微生物培养物添加到9μl溶解缓冲液(25mM NaOH，0.2mM EDTA)并且在95℃下培育混合物30分钟。随后，将样品冷却到4℃，且通过添加10μl中和缓冲液(40mM Tris-HCl)来中和，且接着在洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl)中稀释10倍。或者，使用可商购的试剂盒(例如Mo Bio

微生物DNA分离试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室))或通过所属领域技术人员已知的方法从纯微生物培养物中提取基因组DNA。对于真菌样品，可以通过先前描述的通过机械打磨法从真菌子实体产生溶解物的方法(例如参看US20120135127)进行DNA提取。

用于下游桑格测序的16S序列的扩增

为了扩增细菌16S rDNA(例如在图2和图3中)，将2μl提取的gDNA添加到20μl最终体积PCR反应中。对于全长16测序，PCR反应还含有1×

Mix(马里兰州盖瑟斯堡的5普莱姆公司)、250nM 27f(AGRGTTTGATCMTGGCTCAG，爱荷华州考若维尔的IDT公司)以及250nM 1492r(TACGGYTACCTTGTTAYGACTT，爱荷华州考若维尔的IDT公司)，体积的其余部分是PCR水(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)。/>

图2示出了映射到16s序列上的高变区并且序列区域对应于序列图谱上的这些序列。示出了16S rDNA基因的示意图并且图式指示根据本发明的实施例的高变区1-9(V1-V9)的坐标。基于使用由Brosius等人(来自大肠杆菌的16S核糖体RNA基因(16S rRNA)的完整核苷酸序列,《美国国家科学院院刊》USA 75(10):4801-4805.1978)定义的大肠杆菌系统命名法的编号，V1-V9的坐标分别是69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294以及1435-1465。

或者，使用所属领域的技术人员已知的其它通用细菌引物或热稳定聚合酶。举例来说，引物可供所属领域的技术人员用于测序16S rDNA的“V1-V9区”(例如图2)。这些区域指的是用于细菌样品的遗传学分型的16S rDNA基因的第一到第九高变区。使用基于大肠杆菌系统命名法的编号，分别通过核苷酸69-99、137-242、433-497、576-682、822-879、986-1043、1117-1173、1243-1294和1435-1465定义细菌中的这些区。参看上述Brosius等人,1978。在一些实施例中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区中的至少一个用于表征OTU。在一个实施例中，V1、V2和V3区用于表征OTU。在另一实施例中，V3、V4和V5区用于表征OTU。在另一实施例中，V4区用于表征OTU。所属领域的普通技术人员可以通过比较所讨论的候选序列与参考序列(如图3中)并且基于与参考高变区的相似性鉴别高变区来鉴别候选16S rDNA的特异性高变区(例如图2)。图3以粗体突出显示了上文由Brosius等人描述的示范性参考大肠杆菌16S序列中每一高变区的核苷酸序列。

通常在可商购的例如BioRad MyCycler^TM热循环仪(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司)的热循环仪上进行PCR。反应在94℃下进行2分钟，接着是94℃下持续30秒、51℃下持续30秒以及68℃下持续1分30秒的30个循环，接着是在72℃下延伸7分钟，且在4℃下无限期的保持。在PCR之后，一部分反应产物凝胶电泳用于证实约1.5kb产物的成功扩增。

为了从PCR产物中去除核苷酸和寡核苷酸，将2μl HT ExoSap-

(加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞公司(Affymetrix,Santa Clara,CA))添加到5μl PCR产物中，接着在37℃下培育15分钟，且接着在80℃下灭活15分钟。

通过大规模平行测序技术扩增用于下游表征的16S序列

通过例如Illumina的短读取技术针对下游测序进行扩增需要使用所属领域的技术人员已知的引物扩增，所述引物另外包括基于序列的带条形码的标签。举例来说，为了扩增细菌16S rDNA的16s高变区V4区，将2μl提取的gDNA添加到20μl最终体积PCR反应中。PCR反应物还含有1×HotMasterMix(马里兰州盖瑟斯堡的5普莱姆公司)、200nM V4_515f_衔接子(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA，爱荷华州考若维尔的IDT公司)和200nM带条形码的806rbc(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT_12bpGolayBarcode_AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT，爱荷华州考若维尔的IDT公司)，体积的其余部分使用PCR水(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)。在前述引物序列中，非ACTG核苷酸名称指的是所属领域中使用的常规简并密码。这些引物并入带条形码的衔接子以进行Illumina边合成边测序。任选地，可进行相同的一式两份、一式三份或一式四份反应。或者，使用所属领域的技术人员已知的其它通用细菌引物或热稳定聚合酶获得替代测序技术的不同扩增和测序错误率以及结果。

在可商购的例如BioRad MyCycler^TM热循环仪(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司)的热循环仪上进行PCR扩增。反应在94℃下进行3分钟，接着是94℃下持续45秒、50℃下持续1分钟以及72℃下持续1分30秒的25个循环，接着是在72℃下延伸10分钟，且在4℃下无限期的保持。在PCR之后，一部分反应产物凝胶电泳用于证实约1.5kb产物的成功扩增。如上文所述进行PCR清理。

来自纯均质样品的目标扩增子的桑格测序

为了检测各样品的核酸，进行两个测序反应来产生正向和反向测序读数。全长16s测序使用引物27f和1492r。将40ng ExoSap-IT清洁的PCR产物与25pmol测序引物和补足到15μl总体积的莫拜分子生物学等级水(加利福尼亚州卡尔斯巴德的莫拜实验室)混合。将这一反应物提交给商业测序组织以进行桑格测序，例如金唯智公司(Genewiz；新泽西州南普兰菲尔德(South Plainfield,NJ))。

扩增用于下游测序的18S和ITS区

为了扩增18S或ITS区，在30μL最终体积中用15μL AmpliTaq Gold 360Mastermix、PCR引物和水扩增2μL真菌DNA。用于ITS区的PCR的正向和反向引物是5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'并且各自以0.2μM浓度添加。用于18s区的正向和反向引物是5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'和5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'并且各自以0.4μm浓度添加。使用以下方案进行PCR：95℃10分钟；95℃持续15秒，52℃持续30秒，72℃持续1.5秒的35次循环；以及最终72℃持续7分钟，随后在4℃下储存。全部正向引物含有M13F-20测序引物，并且反向引物包括M13R-27测序引物。PCR产物(3μL)进行酶清洗，随后用1μL ExoSap-IT and 1μL Tris EDTA循环测序并且在37℃下培育20分钟，随后在80℃下培育15分钟。循环测序反应含有5μL清洁PCR产物、2μL

Terminator v3.1备用反应混合物、1μL 5×测序缓冲液、1.6pmol所属领域的技术人员设计的适当测序引物，以及最终体积10μL的水。标准循环测序方案为96℃下10秒、50℃下5秒、60℃下4分钟的27个循环，并且保持于4℃下。根据制造商推荐使用10μL体积的BigDye XTerminator纯化试剂盒进行测序清洁。使用所属领域普通技术人员熟悉的方法，使用桑格测序技术或下一代测序技术(例如(但不限于)Illumina)进行所得18S和ITS序列的基因测序。

通过大规模平行测序技术制备用于宏基因组表征的提取的核酸

使用所属领域普通技术人员熟悉的标准方法并且如测序技术的制造商说明书针对文库制备所述，通过下游测序纯化和制备提取的核酸(DNA或RNA)。简单来说，使用标准纯化试剂盒(例如(但不限于)Qiagen's RNeasy试剂盒或Promega's基因组DNA纯化试剂盒)纯化RNA或DNA。对于RNA，将RNA转换成cDNA，随后进行序列文库构建。纯化核酸之后，根据制造商说明使用逆转录技术将RNA转换成cDNA，所述技术例如(但不限于)Nugen

RNA测序系统或Illumina Truseq。提取的DNA或转录的cDNA使用物理(例如Hydroshear)、声波(例如Covaris)或分子(例如Nextera)技术剪切，接着根据测序技术制造商的建议选择尺寸。尺寸选择后，根据针对样品标引和测序衔接子接合的制造商说明使用基因组测序领域普通技术人员熟悉的方法制备用于测序的核酸。

来自非均质样品的目标扩增子的大规模平行测序

DNA定量和文库构建

清洁的PCR扩增产物根据制造商说明使用Quant-iT^TM

dsDNA分析试剂盒(纽约州格兰德岛的生命技术公司)定量。在定量之后，将带条形码的清洁PCR产物合并，使得每一不同PCR产物处于等摩尔浓度比率下以形成制备的Illumina文库。

核酸检测

在具有簇生成的Illumina HiSeq或MiSeq测序仪(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那公司(Illumina,San Diego,CA))上测序所制备的文库，且根据制造商的说明书进行模板杂交、等温扩增、线性化、阻断和变性以及测序引物杂交。16SV4SeqFw(TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA)、16SV4SeqRev(AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT)以及16SV4Index(ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACT)(爱荷华州考若维尔的IDT公司)用于测序。可使用其它测序技术，例如(但不限于)454、Pacific Biosciences、Helicos、Ion Torrent以及Nanopore，其使用作为基因组测序领域的技术人员的标准的方案。

实例13.序列读数注解

主要读数注解

核酸序列经分析和注解以使用序列相似性和系统发生布局方法或所述两种策略的组合界定分类分配。可使用类似方法注解蛋白质名称、蛋白质功能、转录因子名称以及用于核酸序列的任何其它分类纲要。基于序列相似性的方法包括所属领域技术人员熟悉的那些方法，包括(但不限于)BLAST、BLASTx、tBLASTn、tBLASTx、RDP-分类法、DNAclust以及这些算法的多种实施方式(例如Qiime或Mothur)。这些方法依赖于将序列读数映射到参考数据库并且选择与最佳评分和e值的匹配值。共同数据库包括(但不限于)人类微生物组项目、NCBI非冗余数据库、Greengenes、RDP以及用于分类分配的Silva。对于功能性分配，将读数映射到多个功能性数据库，例如(但不限于)COG、KEGG、BioCyc和MetaCyc。进一步功能性注解可以来源于使用例如PICRUST(M.Langille等人,2013.《自然·生物技术(NatureBiotechnology)》31,814-821)的程序的16S分类注解。系统发生方法可与序列相似性方法组合使用以提高注解或分类分配的判读精确度。使用树拓扑和结点结构优化分析的分辨率。在这一方法中，我们使用许多序列相似性方法中的一种并且利用所属领域的技术人员已知的系统发生方法分析核酸序列，包括(但不限于)最大似然系统发生重构(参看例如Liu等人,2011.RAxML和FastTree：比较两种用于大规模最大似然系统发生估算的方法(RAxMLand FastTree:Comparing Two Methods for Large-Scale Maximum LikelihoodPhylogeny Estimation).PLoS ONE 6:e27731；McGuire等人,2001.含有间隙的DNA序列的序列进化模型(Models of sequence evolution for DNA sequences containing gaps).《分子生物与进化(Mol.Biol.Evol)》18:481-490；Wróbel B.2008.通过使用基于模型的方法从分子序列推断系统发生树中分支的不确定性的统计措施(Statistical measures ofuncertainty for branches in phylogenetic trees inferred from molecularsequences by using model-based methods).《遗传应用学报(J.Appl.Genet.)》49:49-67)。序列读数(例如16S、18S或ITS)置于包含适当参考序列的参考系统发生中。基于系统发生树中的读数的布局作出注解。OTU注解的确定性或重要性基于OTU与参考核酸序列的序列相似性以及OTU序列相对于系统发生中一种或多种参考序列的接近度来定义。举例来说，分类分配的特异性以科、属、种或菌株水平的置信度定义，其中置信度基于参考系统发生树中的引导支撑分支相对于所询问的OTU序列的布局的位置测定。核酸序列可以使用上文所述的方法分配功能性注解。

进化枝分配

一般使用16S rDNA和V4的全长序列进行进化枝分配。16S-V4 OTU鉴别根据特异性种分配OTU的能力部分取决于16S基因的16S-V4区针对具体种或种的群的分辨力。树不同区域的可用参考16S序列的密度以及不同种之间16S基因的固有变化性都将决定分类注解的确定性。由于系统发生树的拓扑性质并且树基于序列相似性和潜在进化模型表示OTU彼此之间的分级关系，因此读数的分类注解可以使用基于进化枝的分配程序上卷到较高水平。使用这一方法，基于使用最大似然或系统发生领域普通技术人员熟悉的其它系统发生模型从全长16S序列建构的系统发生树的拓扑结构界定进化枝。建构进化枝以确保指定进化枝中的全部OTU：(i)彼此在引导支撑节点的指定数目内(一般来说1-5个引导)，和(ii)共用定义的相似性百分比(对于16S分子，数据通常设定成95％-97％序列相似性)。同一进化枝内的OTU可以基于16S-V4序列数据根据基因和系统发生学上不同于不同进化枝中的OTU来区别。同一进化枝内的OTU进化上紧密相关并且可以使用或不使用16S-V4序列数据彼此区别。基于进化枝的分析的能力在于同一进化枝的成员由于其进化相互关系而可能在微生物生态(例如人类肠道中存在的微生物生态)中起相似功能性作用。用同一进化枝的一种物种取代另一物种的组合物可能具有保守生态功能并且因此适用于本发明。值得注意的是，除了16S-V4序列之外，基于进化枝的分析可用于分析18S、ITS和其它遗传学序列。

值得注意的是指定OTU的分离物的16S序列以系统发生学方式置于其各别进化枝内，有时与种和属的基于微生物的分配(可能在基于16S的分配之前)有冲突。从文献已知基于微生物特征的分类分配与遗传测序之间存在矛盾。

对于指定网状生态或功能性网状生态，可以从网络的代表性进化枝定义OTU集合。举例来说，如果网络包含进化枝_100和进化枝_102，那么其可以称为包含来自由科伊尔棒杆菌(Corynebacterium coyleae)、产粘棒杆菌(Corynebacterium mucifaciens)和尤科维棒杆菌(Corynebacterium ureicelerivorans)组成的群组的至少一个OTU，以及来自由阑尾棒杆菌(Corynebacterium appendicis)、生殖器棒杆菌(Corynebacteriumgenitalium)、灰绿棒杆菌(Corynebacterium glaucum)、短棒杆菌(Corynebacteriumimitans)、芮氏棒杆菌(Corynebacterium riegelii)、棒杆菌属L_2012475(Corynebacterium sp.L_2012475)、棒杆菌属NML 93_0481、纹带棒杆菌(Corynebacteriumsundsvallense)以及图斯坎棒杆菌(Corynebacterium tuscaniae)组成的群组的至少一个OTU(参看表1)。作为反例，如果网络称为由科伊尔棒杆菌和/或产粘棒杆菌和/或尤科维棒杆菌组成，并且还由阑尾棒杆菌和/或生殖器棒杆菌和/或灰绿棒杆菌和/或短棒杆菌和/或芮氏棒杆菌和/或棒杆菌属L_2012475和/或棒杆菌属NML 93_0481和/或纹带棒杆菌和/或图斯坎棒杆菌组成，那么其可以称为包含进化枝_100和进化枝_102。

申请人可使用上述方法对本文所披露的全部OTU进行进化枝分配并且这些分配报告于表1中。在例如组合物的一些实施例中，网状分析的结果提供进化枝_172经进化枝_172i取代。在另一实施例中，网状分析提供进化枝_198经进化枝_198i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_260经进化枝_260c、进化枝_260g或进化枝_260h取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_262经进化枝_262i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_309经进化枝_309c、进化枝_309e、进化枝_309g、进化枝_309h或进化枝_309i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_313经进化枝_313f取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_325经进化枝_325f取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_335经进化枝_335i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_351经进化枝_351e取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_354经进化枝_354e取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_360经进化枝_360c、进化枝_360g、进化枝_360h或进化枝_360i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_378经进化枝_378e取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_38经进化枝_38e或进化枝_38i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_408经进化枝_408b、进化枝_408d、进化枝_408f、进化枝_408g或进化枝_408h取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_420经进化枝_420f取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_444经进化枝_444i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_478经进化枝_478i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_479经进化枝_479c、进化枝_479g或进化枝_479h取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_481经进化枝_481a、进化枝_481b、进化枝_481e、进化枝_481g、进化枝_481h或进化枝_481i取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_497经进化枝_497e或进化枝_497f取代。在另一实施例中，网状分析允许进化枝_512经进化枝_512i取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_516经进化枝_516c、进化枝_516g或进化枝_516h取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_522经进化枝_522i取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_553经进化枝_553i取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_566经进化枝_566f取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_572经进化枝_572i取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_65经进化枝_65e取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_92经进化枝_92e或进化枝_92i取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_96经进化枝_96g或进化枝_96h取代。在另一实施例中，网状分析允许网状分析允许进化枝_98经进化枝_98i取代。这些允许的进化枝取代描述于表2中。

宏基因组读数注解

宏基因组或全基因组散弹法测序数据如上文所述注解，在注解之前进行序列丛集或装配的额外步骤。在如上文所述表征序列之后，使用标引(即条形码)多路解编序列读数。在多路解编序列读数之后：(i)使用快速丛集演算法(例如(但不限于)UCLUST(http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html))或哈希法(例如VICUNA(Xiao Yang,Patrick Charlebois,Sante Gnerre,Matthew G Coole,Niall J.Lennon,JoshuaZ.Levin,James Qu,Elizabeth M.Ryan,Michael C.Zody和Matthew R.Henn.2012.高度多样性病毒群体的重新装配(De novo assembly of highly diverse viral populations).《BMC基因组学(BMC Genomics)》13:475))丛集。在丛集之后，各簇的代表性读数基于“主要读数注解”鉴别并且如上文在“主要读数注解”中所述分析。主要注解的结果接着应用于指定簇中的全部读数。(ii)宏基因组序列分析的第二策略是基因组装配，随后使用例如(但不限于)以下的平台注解基因组装配件：MetAMOS(Treangen等人.2013基因组生物学(GenomeBiology)14:R2)、HUMAaN(Abubucker等人.2012.宏基因组数据的代谢重建以及其对人类微生物组的应用(Metabolic Reconstruction for Metagenomic Data and ItsApplication to the Human Microbiome)J.A.Eisen编.《PLoS计算生物学(PLoSComputational Biology)》8:e1002358)以及所属领域技术人员熟悉的其它方法。

实例14.使用微生物培养技术OTU鉴别

可以使用多种方式测定从复杂部分生长的细菌物种的一致性。举例来说，个别菌落可以选入96孔型式的液体介质中，生长并且在-80℃下以15％丙三醇储备液形式保存。可以将培养物的等分试样置于细胞溶解缓冲液中并且可以使用菌落PCR方法扩增和测序16SrDNA基因(实例1)。或者，菌落可以在固体培养基上根据纯度划成若干通道。将充分分离的菌落划到相同种类的新鲜培养板上并且在37℃下培育48-72小时。所述过程重复多次以确保纯度。可以通过基于表现型或基于序列的方法分析纯培养物，所述方法包括16S rDNA扩增和如实例1中所述的测序。纯分离物或混合群落(例如培养板刮落物和孢子洗脱份)的序列表征还可以包括全基因组散弹测序。全基因组散弹测序对于测定与孢子形成、抗生素耐药性、致病性和毒性有关的基因的存在有价值。菌落还可以从培养板大批刮落并且使用如实例1中所述的大规模平行测序方法测序，使得可以鉴别复杂混合物中的个别16S标记。任选地，可以在萌发(适当时，使用DNA分离程序从孢子溶解和释放DNA)之前对样品进行测序，从而比较可萌发物种的多样性与孢子样品中的总物种数。作为16S分析的替代或补充方法，还可以使用MALDI-TOF-质谱仪进行物种鉴别(Barreau等人,2013.提高临床微生物学实验室中通过MALDI-TOF质谱对厌氧菌的鉴别(Improving the identification of anaerobesin the clinical microbiology laboratory through MALDI-TOF mass spectrometry).《厌氧生物(Anaerobe)》22:123-125)。

实例15.微生物菌株鉴别方法

可以使用如Wadsworth-KTL厌氧微生物学手册(Jouseimies-Somer等人,2002.Wadsworth-KTL厌氧细菌学手册)和临床微生物学手册(The Manual of ClinicalMicrobiology)(ASM出版社，第10版)中所述的微生物方法鉴别纯细菌分离物。这些方法依赖于菌株表型并且包括进行革兰氏染色以确认细胞被膜的革兰氏阳性或阴性染色特性，观察固体培养基上的菌落形态、在60×或100×放大倍数下观测运动性、细胞形态(包括细菌的内生芽孢和鞭毛)。使用适当选择性和差示琼脂和/或用于鉴别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌和酵母的可商购试剂盒(例如RapID测试(Remel)或API测试(bioMerieux))来进行区别属和种的生物化学测试。还可以使用例如Vitek 2系统(bioMerieux)的仪器进行类似鉴别测试。还可以使用生长和代谢活性检测法(例如Biolog Microbial鉴别微量培养板)进行区别属和种和菌株的表现型测试(例如使用多种碳和氮源的能力)。具体碳源发酵期间短链脂肪酸制造特征也可以用作区别种的方式(Wadsworth-KTL厌氧微生物学手册,Jousimies-Somer等人,2002)。MALDI-TOF-质谱还可以用于种鉴别(如《厌氧生物》22:123中所评述)。

实例16.构建筛选抑制病原性大肠杆菌生长的微生物组合的体外分析.

本文所述的体外分析法的改良用于筛选抑制大肠杆菌生长的细菌组合。一般来说，通过使用适于生长病原体接种物的培养基改良分析法。举例来说，适合培养基包括加固梭菌培养基(RCM)、脑心浸出培养液(BHI)或卢里亚贝尔塔尼培养液(Luria BertaniBroth，LB)(也称为溶原性培养液)。通过使用对大肠杆菌具有特异性的替代选择性培养基或使用对病原体具有特异性的qPCR探针对大肠杆菌进行定量。举例来说，在麦康凯乳糖培养基上好氧生长选择肠革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌。使用对病原性大肠杆菌的志贺样毒素具有特异性的探针进行qPCR。

一般来说，所述方法可用于体外测试组合物抑制可以培养的任何病原体生长的能力。

实例17.构建筛选抑制万古霉素耐药性肠球菌(VRE)生长的微生物组合的体外分析法

体外分析可用于通过修改用于病原体接种物生长的培养基来筛选抑制万古霉素耐药性肠球菌属(VRE)生长的细菌组合。培养基的若干选择可用于病原体生长，例如强化梭菌培养基(RCM)、脑心浸出培养液(BHI)或卢里亚贝尔塔尼培养液(LB)。通过使用对VRE具有特异性的替代性选择性培养基或使用对病原体具有特异性的qPCR探针对VRE进行定量。举例来说，含有叠氮化钠的滤膜肠球菌琼脂(m-Enterococcus agar)对肠球菌属和少量其它物种具选择性。所属领域中已知的对赋予万古霉素耐药性的van基因具有特异性的探针用于qPCR中或此类探针可以使用所属领域中已知的方法设计。

实例18.筛选抑制沙门氏菌的细菌组合物的体外分析法

本文所述的体外分析法用于通过修饰用于生长病原体接种物的培养基筛选抑制沙门氏菌属生长的细菌组合。培养基的若干选择是用于病原体生长，例如强化梭菌培养基(RCM)、脑心浸出培养液(BHI)或卢里亚贝尔塔尼培养液(LB)。通过使用对沙门氏菌属具有特异性的替代性选择性培养基或使用对病原体具有特异性的qPCR探针对沙门氏菌属进行定量。举例来说，麦康凯琼脂用于选择沙门氏菌属，且invA基因用qPCR探针靶向；这一基因编码由许多病原性沙门氏菌属携带且用于侵入真核细胞的侵袭蛋白。

实例19.体内验证用于预防鼠类模型中的艰难梭菌感染的网状生态细菌组合物的功效

为了测试细菌组合物的治疗可能性，使用艰难梭菌感染的预防性小鼠模型(基于Chen等人,2008.艰难梭菌相关疾病的小鼠模型(A mouse model of Clostridiumdifficile-associated disease).《胃肠病学(Gastroenterology)》135:1984-1992的模型)。实验的每个组测试两笼小鼠，每笼五只。在第-14天到第-5天，全部小鼠在其饮用水中接收由以下组成的抗生素混合物：10％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5U/ml)、甲硝哒唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、安比西林(0.1mg/ml)以及万古霉素(0.056mg/ml，并且在第-3天通过经口管饲接收10mg/kg剂量的克林达霉素。在第-1天，测试物品在12,100rcf下旋转5分钟，去除其清液层，并且将剩余团粒再悬浮于无菌PBS中，如果细菌组合物不是孢子形式，那么预还原，并且通过经口管饲传递。在第0天，通过经口管饲投予约4.5log10 cfu艰难梭菌(ATCC 43255)或无菌PBS(针对未处理组)对其进行攻击。任选地，除了上文所述的抗生素方案和艰难梭菌攻击之外，从第-1天到第3天接收万古霉素的阳性对照组。从笼中收集粪便用于细菌运输分析。基于通过组合外观评分(基于正常、缩成一团、竖毛或昏睡0-2点)与临床征象(基于正常、湿尾症、摸起来冷或与其它动物隔离0-2点)的0-4标度，从第-2天到第6天每天评定艰难梭菌症状的死亡率、体重和临床评分。计算相对于第-1天的平均最小体重和平均最大临床评分(其中死亡指定为临床评分4)以及平均累计死亡率。使用相对于媒剂对照物降低的死亡率、相对于第-1天增加的平均最小体重以及指配评分4的死亡的降低的平均最大临床评分来评定测试组合的成果。

表9和表10报告艰难梭菌感染的预防性小鼠模型中的14个实验结果，其中使用细菌组合物进行处理。在14个实验中，157组测试的网状生态中，测试了86个独特网状生态(表10)。这些实验中组合物(测试物品)的功效标志是测试组合物相对于媒剂对照物的低累计死亡率、至少0.85(例如至少0.90、至少0.95或至少0.97)的平均最小相对体重以及小于1(例如0.9、0.8、0.7、0.5、0.2或0)的平均最大临床评分。157组实验中，136组和73个网状结构与各别实验的媒剂对照物组相比在以下度量标准中的至少一个方面更好：累计死亡率、平均最小相对体重和平均最大临床评分。有效网状结构的实例包括(但不限于)如SP-361中测试的网状结构N1979，其具有0％累计死亡率、0.97平均最小相对体重和0平均最大临床评分，或N2007，其具有10％累计死亡率、0.91平均最小相对体重和0.9平均最大临床评分，两种网状结构都与SP-361中的媒剂对照物相比，所述媒剂对照物具有30％累计死亡率、0.88平均最小相对重量和2.4平均最大临床评分。在SP-376中，N1962不具有累计死亡率，在测试的两种目标剂量下平均最大临床评分为0，针对1e8和1e7CFU/OTU/小鼠的目标剂量的平均最小相对体重分别为0.98和0.95。如使用小鼠模型所证明，这些结果确认包含二元和三元以及其组合的细菌组合物有效。

实例20.体内验证预防性或复发预防仓鼠模型中网状生态细菌组合物功效

使用艰难梭菌的产毒和非产毒菌株的前述仓鼠研究证明仓鼠模型用于检验抗生素处理后复发的效用和用盲肠菌丛预防性处理艰难梭菌感染的作用(Wilson等人,1981.《传染与免疫(Infect Immun)》34:626-628),Wilson等人,1983.《传染病杂志(J InfectDis)》147:733,Borriello等人,1985.《微生物医学杂志(J Med Microbiol)》19:339-350)以及在胃肠传染病中更广泛。因此，为了证明包含特异性操作分类单位的细菌组合物改善艰难梭菌感染的预防性用途，使用以下仓鼠模型。在第-5天向动物投予克林达霉素(10mg/kg s.c.)，在第-3天投予测试组合物或对照物，并且在第0天进行艰难梭菌攻击。在阳性对照组中，接着在第1-5天投予万古霉素(并且在第-3天传递媒剂对照物)。在第-5天、第-4天、第-1天、第1天、第3天、第5天、第7天、第9天收集粪便，并且通过微生物方法评定粪便样品的病原体运输和减少。16S所属领域的技术人员也可利用测序法或其它方法。艰难梭菌攻击后21天每天多次评定死亡率。存活率百分比曲线显示包含显示在体外抑制分析法(参看上述实例)中抑制艰难梭菌的OTU的细菌组合物(N1962)比万古霉素对照物和媒剂对照物更好的保护仓鼠(图5)。

这些数据证明体内组合物功效，以及使用如本文所述的体外抑制方法预测具有体内活性的组合物的效用。

实例21.制备用于投予个体的细菌组合物的方法

包含细菌组合物的两种或更多种菌株独立地培养并且在投予之前混合在一起。两种菌株在37℃、pH 7下在用1g/L半胱氨酸盐酸盐预还原的GMM或其它不含动物产物的培养基中独立地生长。在每一菌株达到足够的生物质之后，通过添加15％丙三醇且接着在1ml冷冻管中在-80℃下冷冻来将其保存以便储备。

接着，将每一菌株培育到10¹⁰个CFU/mL的浓度，接着通过切线流微过滤浓缩20倍；用过的培养基通过透滤用由2％明胶、100mM海藻糖和10mM磷酸钠缓冲剂组成的保存培养基或其它适合的保存培养基交换。将悬浮液冻干成粉末且滴定。

在干燥之后，将粉末与微晶纤维素和硬脂酸镁掺合，且配制成含有10mg冻干粉末(10⁸到10¹¹个细菌)、160mg微晶纤维素、77.5mg明胶和2.5mg硬脂酸镁的250mg明胶胶囊。

可以通过选择性分级分离所要细菌OTU与原料(例如(但不限于)粪便)来产生细菌组合物。举例来说，制备10w/v％人类粪便物质于PBS中的悬浮液，过滤，低速离心，接着将含有孢子的清液层与绝对乙醇以1:1比率混合并且涡旋以混合。在室温下培育悬浮液1小时。培育后，将悬浮液高速离心以将孢子浓缩成含有经纯化的含有孢子的制剂的团粒。丢弃清液层并且将团粒再悬浮于相等质量的丙三醇中，并且将经纯化的孢子制剂置于胶囊中并且在-80℃下储存；这一制剂称为乙醇处理的孢子群。

实例22.用细菌组合物治疗患有复发性艰难梭菌感染的个体的方法

在一个实例中，个体遭受艰难梭菌的复发性发作。在疾病的最近急性期中，用足以改善所述疾病的症状的抗生素治疗个体。为了防止艰难梭菌感染的另一次复发，向个体投予本文所述的细菌组合物。举例来说，以1e10⁷到1e10¹²范围内的剂量，以例如冻干形式，在含有10mg冻干细菌和稳定组分的一个或多个明胶胶囊(例如2、3、4、5、10、15或更多胶囊)中，向个体投予本发明细菌组合物中的一个。胶囊经口投予并且个体在4、8、12或24小时后恢复正常饮食。在另一实施例中，个体可在膳食之前、期间或之后立刻经口服用胶囊。在另一实施例中，个体服用每日剂量持续规定时间段。

在治疗之前和之后从个体收集粪便。在一个实施例中，在投予1天、3天、1周和1个月后收集粪便。发现投予细菌组合物之前的粪便中存在艰难梭菌，但投予之后的粪便收集物如通过qPCR所测量并且适当时如上文所述与健康参考个体微生物组比较，显示粪便中的艰难梭菌含量降低(例如少至少50％、60％、70％、80％、90％或95％)到检测不到艰难梭菌含量。通常，使用从相同量的起始物质(例如粪便)提取的材料进行定量。还可使用用于毒素蛋白的ELISA或传统微生物鉴别技术。有效处理定义为处理后存在的艰难梭菌的量减少。

在一些情况下，有效处理(即对使用本文所披露的组合物的处理起阳性反应)定义为不存在腹泻，其本身定义为每天3次或更多次松软或水样粪便持续至少连续2天，或48小时内8次或更多次松软或水样粪便，或重复(三次)粪便测试艰难梭菌毒素阴性的持久腹泻(由于其它原因)。

治疗失败定义为如通过qPCR测序所测量，艰难梭菌毒素粪便测试阳性或艰难梭菌水平不降低的持续腹泻，。还可使用ELISA或传统微生物鉴别技术。

在一些情况下，通过例如处理后2周、3周、4周、5周、10周、12周、16周、20周或24周内无艰难梭菌感染病征或症状复发来确定处理有效。

实例23.用细菌组合物治疗患有艰难梭菌相关腹泻疾病的个体

用孢子组合物治疗的患者中微生物群移入、扩增和病原体运输减少

使用补充基因组和微生物方法表征用细菌组合物治疗的15名患有复发性艰难梭菌相关疾病(CDAD)个体的微生物丛的组成。这些个体的微生物组经特征化预处理并且最初在处理后高达4周并且进一步达到24周。治疗额外15名个体并且收集那些个体的数据直到治疗后至少8周并且高达治疗后24周。用于治疗的细菌组合物包含孢子形成细菌并且构成源自健康人类粪便的微生物孢子生态。制备此类组合物的方法可见于PCT/US2014/014715中。

初始组合物中鉴别的孢子形成微生物的非限制性示范性OTU和进化枝提供于表11中。在最初治疗的15名个体中的1到15名(表11)和后续治疗的个体中观察到孢子生态处理中的OTU和进化枝。用微生物孢子生态治疗个体使治疗的全部个体中的艰难梭菌相关疾病(CDAD)消退。另外，用微生物孢子组合物处理导致革兰氏(-)和革兰氏(+)病生菌减少或去除，所述病生菌包括(但不限于)具有多重耐药性的病生菌，例如(但不限于)万古霉素耐药性肠球菌(VRE)和卡巴盘尼姆或亚胺培南耐药性细菌。另外，治疗导致个体肠道微生物组的总微生物多样性增加(图6)并且由于使用微生物孢子生态处理形成的所得微生物群落与微生物组预处理不同并且与具有CDAD的个体相比，更紧密展现健康个体(图7)。

使用新颖计算方法，申请人描绘用乙醇处理的孢子制剂治疗的患者中与更多多样性微生物生态的移入和生态扩增和建立有关的细菌OTU(表11)。包含经扩增生态的OTU为治疗之前患者体内低于检测极限的那些和/或以极低频率存在使得其不包含总微生物运输的显著部分并且在细菌组合物中不可通过基因组和/或微生物分析法检测。作为移入和经扩增生态的成员的OTU通过表征如下OTU来鉴别，其相对丰度在处理之后增加并且分别：(i)存在于乙醇处理的孢子制剂中并且在患者预治疗中不可检测(移入OTU)，或(ii)不存在于乙醇处理的孢子制剂中，但由于治疗形成有利生长条件(扩增OTU)，用制剂治疗后的时间内其在患者体内的相对丰度增加。扩增OTU可以在患者中从低频储集器生长或可以从例如饮食的外源性源引入。

值得注意的是，指定OTU的分离物的16S序列以系统发生方式置于其各别进化枝内，但种和属的实际分类分配可能表明其分类学上不同于其所属进化枝的其它成员。从文献已知基于微生物特征的指定OTU的分类名称与遗传测序之间存在矛盾。已知此表中的OTU脚注在分配分类名称的不同方法之间有差异。

治疗性组合物从核生态的合理设计

为了定义潜伏在微生物孢子细菌的显著临床功效下的核生态，进行以下分析。通过16S-V4rDNA测序和实例13的OTU的计算分配来测定微生物孢子生态的OTU组成。检测微生物孢子生态中至少十个序列读数的要求设为保守临界值，以仅定义非常不可能由扩增或测序期间的误差引起的OTU。基于基因组的微生物组表征领域的技术人员通常采用的方法使用0.005％的读数相对丰度临界值(参看例如Bokulich等人.2013.质量过滤极大地提高从伊路米那扩增子测序估算的多样性(Quality-filtering vastly improves diversityestimates from Illumina amplicon sequencing).《自然方法(Nature Methods)》10:57-59)，其将相当于≥2个读数产生针对这一实例中分析的样品获得的测序深度，因为截止值大体上低于这一分析中所用的≥10个读数。如实例13中所述针对各OTU进行全部分类和进化枝分配。所得孢子制剂中OTU、进化枝分配和检测频率的列表显示于表11中。

在一个实施例中，包含微生物孢子生态、经扩增生态或移植生态的“核心”细菌组合物的OTU可以经观测到其的总个体百分比界定；这一百分比越大，其越可能成为负责催化离开有害性生态的变换的核心生态的部分。在一个实施例中，通过鉴别所评估最大数目个体中出现的OTU，合理地设计治疗性细菌组合物。在一个实施例中，100％个体中存在的OTU定义治疗性细菌组合物。在其它实施例中，定义成在≥90％、≥80％、≥70％、≥60％或≥50％所评估个体中存在的OTU包含治疗性细菌组合物。在另一实施例中，100％、≥90％、≥80％、≥70％、≥60％或≥50％中的OTU经进一步细化以使用系统发生参数或其它特征合理设计治疗性细菌组合物，所述特征例如(但不限于)其代谢次级胆酸、禁止TH17免疫信号传导或产生短链脂肪酸的能力。

在另一实施例中，生态中的主导OTU可以使用若干方法鉴别，包括(但不限于)定义在经扩增或经移植生态中具有最大相对丰度的OTU以及界定总相对丰度临界值。举例来说，通过界定具有最大相对丰度的OTU来鉴别患者-1的经扩增生态中的主导OTU，在处理之后第25天，其总共占这一患者的经扩增生态中微生物运输的60％。

在另一实施例中，OTU指配成细菌组合物的核心生态的成员，所述OTU必须显示为移入患者。出于至少两个原因，移入是重要的。首先，认为移入是重塑微生物组和消除艰难梭菌定殖机制的必要条件。以较高频率移入的OTU非常可能是孢子制剂或广义来说细菌组合物集合的核心生态的组分。其次，通过测序细菌组合物检测的OTU可包括与组合物无关的无活性细胞或其它污染DNA分子。OTU必须显示移入患者的要求消除代表无活性细胞或污染序列的OTU。以细菌组合物(例如所分析的乙醇孢子制剂)的大百分比存在并且大量移入患者的OTU代表核心生态的亚群，其非常可能催化从有害性疾病生态变换成健康微生物组。界定产生移入的OTU的此类治疗性细菌组合物的OTU标示于表11中。

施加第三晶体以将发现进一步优化成细菌组合物的核心生态(例如微生物孢子生态)。基于计算的网络分析已经使能够描述存在于广泛健康个体群的微生物丛中的微生物生态。这些网状生态包含多个OTU，其中一些定义为根本OTU。根本OTU以计算方式定义以下OTU，其以大百分比运算网状结构存在并且满足其所存在的网状结构在所评估个体群中高度盛行。根本OTU形成存在所述OTU的微生物生态的基础，并且因此对健康个体中网状生态的功能非常重要。与健康个体相关的微生物生态有关的根本OTU在患有疾病的个体中通常遗失或以降低的含量存在。根本OTU可以低、中等或高丰度存在于个体中。

这些数据存在若干重要发现。在来自6名供体和10名捐赠者的全部孢子制剂中检测到相对较少数目的物种，总共11种。这是出人意料的，因为HMP数据库(www.hmpdacc.org)描述健康个体之间共生物种的巨大变化性。少数一致OTU的存在支持核心生态和骨干网状结构的概念。移入数据进一步支持这一结论。

在另一实施例中，三个因素(细菌组合物(例如(但不限于)孢子制剂中的发生率、移入频率以及作为根本OTU的标示)使能够形成“核心生态评分”(CES)以将个别OTU评级。CES如下定义：

·孢子制剂中OTU的存在占40％权重

ο在1-3个孢子制剂中存在乘以1

ο在4-8个孢子制剂中存在乘以2.5

ο在≥9个孢子制剂中存在乘以5

·患者中的移入占40％权重

ο1-4名患者中的移入乘以1

ο5-6名患者中的移入乘以2.5

ο≥7名患者中的移入乘以5

·根本OTU占20％权重

ο根本OTU乘以1

ο非根本OTU乘以0

使用这一指南，CES具有最大可能评分5和最小可能评分0.8。举例来说，一种OTU存在于10种细菌组合物(例如(但不限于)移植3名患者中的孢子制剂)中的8种中并且是根本OTU，其将根据CES分配：

CES＝(0.4×2.5)+(0.4×1)+(0.2×1)＝1.6

表11提供通过CES的OTU评级。使用CES评分合理设计的细菌组合物非常可能催化从有害性疾病生态变换成健康微生物组。在额外实施例中，CES评分可以与其它因素组合以优化治疗性细菌组合物的合理设计。此类因素包括(但不限于)：使用系统发生参数或其它特征，例如(但不限于)其代谢次级胆酸、禁止TH17免疫信号传导或产生短链脂肪酸的能力。在另一实施例中，可以通过鉴别在经扩增或经移入生态中具有最大相对丰度的OTU并且界定总相对丰度临界值来进行优化。

人类胃肠道中的生物体数目以及健康个体之间的多样性指示健康肠道微生物组生态的功能性冗余(参看人类微生物组联盟.2012.健康人类微生物组的结构、功能和多样性.自然486:207-214)。这一冗余造成核心生态的亚群非常可能描述细菌组合物的治疗性有益组分，所述细菌组合物例如(但不限于)乙醇处理的孢子制剂，并且此类亚群本身可以是适用于填充胃肠道以及用于处理艰难梭菌感染产生生态功能特征的组合物。使用CES以及如上文所定义的其它关键度量标准，个别OTU可以优先级排序评估成核心生态的有效亚群。

功能性冗余的另一方面在于进化相关生物体(即在系统发生树上彼此接近的那些，例如分组到单个进化枝中的那些)也将是核心生态或其用于处理艰难梭菌的亚群中的有效替代。

对于所属领域技术人员，选择适当OTU亚群进行体外或体内测试是简单明了的。可以通过从表11挑选任何2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个OTU来选择亚群，通常选择具有较高CES的那些。另外，使用上文实例13和表11中定义的进化枝关系，可以选择相关OTU作为具有可接受CES值的OTU的替代。这些生物体可以使用适当培养基体外厌氧培养，接着以所要比率组合。小鼠艰难梭菌模型中的典型实验利用组合物中各微生物的至少104个并且优选地至少105、106、107、108、109或超过109个菌落形成单位。在一些组合物中，生物体以不相等比率组合，例如由于培养物产量的变化，例如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:100,000或超过1:100,000。这些组合物中重要的在于各菌株以最小量提供使得菌株对核心生态亚群功效的贡献治疗上有效，并且在一些情况下可测量。使用此处所述的原理和说明，所属领域的技术人员进行基于进化枝的取代以测试核心生态亚群的功效。表11和表2描述可以进行此类取代的各OTU的进化枝。

通过整合体外和临床微生物组数据来合理设计治疗性组合物

在一个实施例中，通过合理询问界定处理微生物孢子生态的有效亚群以及处理后个体的微生物生态亚群，并且这些生态关于组合物的组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或一些更大数目的OTU。在一个实施例中，已在体外病原体抑制分析法中证实功效并且另外鉴别为处理本身的生态和/或个体的100％、≥90％、≥80％、≥70％、≥60％或≥50％的微生物生态的组分的细菌组合物可以由所属领域普通技术人员针对功能性筛选区分优先级。功能性筛选可包括(但不限于)使用多种病原体或非病原体模型(举例来说，鼠类模型、仓鼠模型、灵长类动物模型或人类)的体内筛选。表12提供如平均对数抑制大于零假设的99％信赖区间(C.I)所测量针对艰难梭菌展现抑制(参看实例6，++++)并且在至少一个孢子生态处理或处理后个体中鉴别的细菌组合物。在另一实施例中，选择在95％、90％或80％置信区间(C.I.)并且在处理和处理后生态中存在的组合物。在其它实施例中，选择细菌组合物通过选择处理或处理后生态中存在的OTU来筛选治疗潜力，并且所述组合物的所测量生长抑制分级≥全部生长抑制评分的第75百分位。在其它实施例中，选择分级≥第50百分位、第60百分位、第70百分位、第80百分位、第90百分位、第95百分位或第99百分位的组合物。在另一实施例中，选择证实具有协同抑制的组合物(参看实例7)。在另一实施例中，使用生长抑制度量标准的组合选择筛选在体内模型中的功效的组合物。作为非限制性实例：(i)首先基于对数抑制大于零假设的99％信赖区间(C.I.)选择组合物，(ii)接着组合物的这一亚群经进一步选择来表示组合物中在全部抑制评分的分布中分级≥第75百分位的那些，(iii)接着基于证明协同抑制的组合物进一步选择这一亚群。在一些实施例中，不同置信区间(C.I.)和百分位用于将组合物分成亚群并且合理地选择组合物。在另一实施例中，细菌组合物针对其治疗潜力使用系统发生准则进一步合理定义，例如(但不限于)存在具体系统发生进化枝，或例如(但不限于)其代谢次级胆酸、禁止TH17免疫信号传导或产生短链脂肪酸的能力的其它特征。

在一相关实施例中，定义使用100％剂量孢子生态中存在的OTU用电子杂交方式描绘的全部特有细菌组合物；示范性细菌组合物标示于表13中。在其它实施例中，组合物为存在于≥90％、≥80％、≥70％、≥60％或≥50％剂量孢子生态或个体的处理后生态中的衍生形式的OTU。所属领域普通技术人员可询问所得细菌组合物并且使用多种度量标准，包括(但不限于)孢子形成体百分比、根本OTU的存在、系统发生组合物或OTU代谢次级胆酸的能力或产生短链脂肪酸的能力，以合理地界定怀疑功效和适用于进一步筛选的细菌组合物。

实例24.所投予孢子生态剂量组合物的计算分析，以及投予孢子生态剂量之后的扩增和移入.

实例23中所述的临床试验入选15名额外个体。对回应于试验中的处理来自全部个体的信息组合数据进行进一步分析(30名个体中29名)。用源自人类粪便的微生物的复杂配制品进行处理。这些结果的分析提供于表14-21中。表22为方便起见提供，并且列出特定生物体的替代名称。通常，在所属领域中已知并且本文中所述的条件下，使用所属领域中已知的方法(例如使用qPCR)，获得OTU的存在。

试验中所用的剂量集合是向至少一名患者提供的剂量的总集。因此，剂量暗含剂量集合的成员。因此，剂量中全部OTU的集合定义为使得各OTU存在于至少一个剂量中的特有OTU集合。

如本文所述，移入OTU是治疗前在患者体内(例如其粪便中)不可检测的OTU，但存在于向个体传递的组合物中并且在来自个体的至少一个处理后样品中在个体中(例如个体的粪便中)检测出来。全部移入OTU的集合定义为至少一名个体中存在的特有移入OTU集合。扩增OTU是未移入的个体中检测到的OTU，并且在一些处理后时间点的丰度是治疗前丰度的十倍。全部扩增OTU的集合是至少一名个体中存在的特有扩增OTU集合。全部扩增和移入OTU的集合定义为扩增或移入至少一名个体中的特有OTU集合。

全部特有三元组合的集合可以通过考虑OTU的全部组合从以实验方式衍生的OTU集合产生，使得1)三元的各OTU不同以及2)三个OTU事先未一起使用。可以使用计算机程序来产生此类组合。

表14从全部扩增和移入OTU的集合产生并且提供在用组合物治疗后发现在至少一名个体中移入或扩增的OTU。所列每一个三元组合在向个体提供的全部剂量中或在至少一个治疗后时间点在全部患者中一起检测到。通常，适用组合物包括三元组合物中的至少一个。在一些实施例中，三元组合物的全部三个成员在至少例如68％、70％、71％、75％、79％、86％、89％、93％或100％个体中移入或扩增。因为分析的全部个体都对治疗有反应，所以表中所列的三元适用于治疗菌群失调的组合物中。

表15提供特有OTU三元组合的列表，所述OTU存在于至少95％剂量中(舍入到最接近的整数)并且移植至少一名个体中。应注意100％剂量中存在的三元组合列于表14中。包括三元组合的组合物适用于用于治疗菌群失调的组合物中。

表16提供扩增OTU的全部特有三元组合的集合，使得在治疗后时间点在至少75％个体中检测到各三元组合。

表17提供全部特有三元组合的集合，所述组合存在于至少75％剂量中并且接收含有所述三元组合的剂量的个体具有以移入或扩增OTU形式存在的梭菌属SM4/1。因此，在一些实施例中，由选自表17的三元组合组成、基本上由选自表17的三元组合组成或包含选自表17的三元组合的组合物适用于增加个体体内的梭菌属SM4/1。

表18提供从剂量中全部OTU的集合产生的全部特有三元组合的集合，使得各三元存在于至少75％剂量中并且接收含有三元组合的剂量的个体在治疗后具有以移入或扩增OTU形式存在的梭菌属SSC/2。因此，在一些实施例中，由选自表18的三元组合组成、基本上由选自表18的三元组合组成或包含选自表18的三元组合的组合物适用于增加个体体内的梭菌属SSC/2。

表19提供从剂量中存在的全部OTU的集合产生的全部特有三元组合的集合，使得各三元存在于至少75％剂量中并且投予含有三元组合的剂量的个体在治疗后具有以移入或扩增OTU形式存在的梭菌属NML 04A032。因此，在一些实施例中，由选自表19的三元组合组成、基本上由选自表19的三元组合组成或包含选自表19的三元组合的组合物适用于增加个体体内的梭菌属NML 04A032。

表20提供从剂量中存在的全部OTU的集合产生的全部特有三元组合的集合，使得三元存在于至少75％剂量中并且投予含有三元的剂量的个体具有以移入或扩增OTU形式存在的梭菌属NML 04A032、酸奶瘤胃球菌和扭链瘤胃球菌。因此，在一些实施例中，由选自表20的三元组合组成、基本上由选自表20的三元组合组成或包含选自表20的三元组合的组合物适用于增加个体体内的梭菌属NML 04A032、酸奶瘤胃球菌和扭链瘤胃球菌。

表21显示从剂量中的全部OTU的集合产生的全部特有三元组合的集合，使得各三元存在于至少75％剂量中并且投予含有三元组合的剂量的个体具有以移入或扩增OTU形式存在的直肠真杆菌、普氏粪杆菌、颤杆菌属G2、酸奶瘤胃球菌和扭链瘤胃球菌。因此，在一些实施例中，由选自表21的三元组合组成、基本上由选自表21的三元组合组成或包含选自表21的三元组合的组合物适用于增加个体体内的直肠真杆菌、普氏粪杆菌、颤杆菌属G2、酸奶瘤胃球菌和扭链瘤胃球菌。

所属领域技术人员根据对本说明书的考量和对实施例的实践将清楚其它实施例。本说明书和实例仅视为示范性的，并且真实范围和精神由随附权利要求书指示。

表格

表1

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

表2

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

表3

适应症

腹腔炎症

犁头霉感染

鲍曼不动杆菌感染

不动杆菌感染

洛菲不动杆菌感染

痤疮

适应症

衣氏放线菌感染

腺病毒感染

成人水痘带状疱疹病毒感染

老化

酒精中毒(及影响)

过敏性结膜炎

过敏性鼻炎

过敏症

肌萎缩侧索硬化症(ALS)

阿尔茨海默氏病

变形虫感染

肛门癌

抗生素治疗

抗生素关联性腹泻

动脉硬化

关节炎

烟曲霉感染

曲霉菌感染

哮喘

动脉粥样硬化

异位性皮炎

先天性/过敏性过敏

孤独症

自体免疫性疾病

炭疽芽孢杆菌感染

芽孢杆菌感染

细菌性心内膜炎

细菌性眼部感染

细菌性感染

细菌性脑膜炎

细菌性肺炎

细菌性呼吸道感染

细菌性皮肤感染

细菌药敏

细菌性尿路感染

细菌性阴道病

粪拟杆菌感染

脆弱拟杆菌感染

拟杆菌感染

多形拟杆菌感染

单行拟杆菌感染

普通拟杆菌感染

杆状巴尔通氏体感染

巴尔通氏体感染

双歧杆菌感染

胆道系统恶性肿瘤

胆汁性肝硬化

胆道疾病

胆道感染

胆道肿瘤

BK病毒感染

适应症

芽生菌感染

骨及关节感染

骨感染

百日咳博德特氏杆菌感染

布氏疏螺旋体感染

回归疏螺旋体感染

布鲁氏菌感染

伯克霍尔德菌感染

恶病质

胎儿弯曲杆菌感染

弯曲杆菌感染

空肠弯曲杆菌感染

癌症

白色念珠菌感染

念珠菌感染

克柔念珠菌

乳糜泻

宫颈感染

化疗相关性腹泻

衣原体感染

肺炎衣原体感染

沙眼衣原体感染

衣原体感染

慢性疲劳综合征

慢性感染

慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病

慢性脊髓灰质炎排出(Chronic Polio Shedders)

生理节律睡眠疾患

肝硬化

柠檬酸杆菌感染

枝孢霉感染

梭菌科感染

肉毒梭菌感染

艰难梭菌感染

梭菌感染

破伤风梭菌感染

球孢子菌感染

结肠炎

结肠癌

结直肠癌

普通感冒

代偿性肝硬化

复杂性皮肤及皮肤结构感染

复杂性尿路感染

便秘

便秘型肠易激综合征

白喉杆菌感染

白喉杆菌感染

考克斯体感染

耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)感染

慢性肠炎

适应症

隐球菌感染

新型隐球菌感染

隐孢子虫感染

皮肤红斑狼疮

囊肿性纤维化

膀胱炎

巨细胞病毒感染

痴呆

登革病毒感染

抑郁症

皮炎

糖尿病

糖尿病并发症

糖尿病足部溃疡

腹泻

腹泻型肠易激综合征

盘状红斑狼疮

憩室炎

DNA病毒感染

十二指肠溃疡

埃博拉病毒感染

痢疾变形虫感染

产气肠杆菌感染

阴沟肠杆菌感染

肠杆菌感染

肠杆菌科感染

粪肠球菌感染

屎肠球菌感染

肠球菌感染

小肠结肠炎

肠病毒71感染

表皮癣菌感染

爱泼斯坦-巴尔二氏病毒感染

产ESBL(超广谱β内酰胺酶)细菌感染

大肠杆菌感染

食道癌

外瓶霉感染

家族性寒冷性自身炎症性疾病综合征

肝片吸虫感染

女性生殖道感染

女性生殖道肿瘤

女性不育症

纤维变性

黄病毒感染

食物变态反应

土拉弗朗西斯菌感染

功能性肠紊乱

真菌感染

真菌性呼吸道感染

真菌性尿路感染

镰孢菌感染

适应症

梭杆菌感染

胃溃疡

胃肠道感染

胃肠道不适

胃肠道溃疡

生殖道感染

泌尿生殖系疾病

泌尿生殖道肿瘤

妊娠糖尿病

兰伯氏贾第鞭毛虫感染

牙龈炎

革兰氏阴性细菌感染

革兰氏阳性细菌感染

埃古普托斯嗜血杆菌感染

杜克雷嗜血杆菌感染

嗜血杆菌感染

流感嗜血杆菌感染

帕拉氏嗜血杆菌感染

汉坦病毒感染

幽门螺旋杆菌感染

蠕虫感染

甲型肝炎病毒感染

乙型肝炎病毒感染

丙型肝炎病毒感染

丁型肝炎病毒感染

戊型肝炎病毒感染

肝炎病毒感染

单纯疱疹病毒感染

疱疹病毒感染

组织胞浆菌感染

HIV感染

HIV-1型感染

HIV-2型感染

HSV-1型感染

HSV-2型感染

人类T细胞白血病病毒1型

高胆固醇血症

高草酸尿症

高血压

感染性关节炎

传染病

传染性心内膜炎

不育症

炎症性肠病

炎性疾病

甲型流感病毒感染

乙型流感病毒感染

流感病毒感染

失眠症

胰岛素依赖型糖尿病

肠道感染

适应症

肠易激综合征

乙型脑炎病毒感染

关节感染

幼年型类风湿性关节炎

肉芽肿克雷伯氏菌

克雷伯氏菌感染

肺炎克雷伯氏菌感染

军团菌感染

嗜肺军团菌感染

巴西利什曼原虫感染

杜氏利什曼原虫感染

利什曼原虫感染

热带利什曼原虫感染

钩端螺旋体科感染

产单核细胞李斯特菌感染

李氏杆菌病

肝硬化

肝纤维化

下呼吸道感染

肺部感染

肺部炎症

红斑狼疮性脂膜炎

狼疮性肾炎

莱姆病

男性不育症

马尔堡病毒感染

麻疹病毒感染

代谢失调

代谢综合征

转移性结肠癌

转移性结直肠癌

转移性食管癌

晚期胃肠道癌

转移性胃癌

微球菌科感染

微球菌感染

小孢子目感染

小孢子菌感染

传染性软疣感染

猴痘病毒感染

卡他莫拉菌感染

莫拉菌感染

摩根菌感染

摩根摩根菌

耐甲氧西林金葡菌(MRSA)感染

毛霉菌感染

多药耐药性感染

多发性硬化症

腮腺炎病毒感染

肌肉骨骼系统炎症

分枝杆菌感染

适应症

麻风分枝杆菌感染

结核分枝杆菌感染

支原体感染

肺炎支原体感染

坏死性小肠结肠炎

坏死性胰腺炎

淋病奈瑟氏菌感染

奈瑟氏菌感染

脑膜炎奈瑟氏菌感染

线虫感染

非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝炎

非胰岛素依赖型糖尿病

肥胖症

眼感染

眼部炎症

炎性眼眶疾病

骨关节炎

耳鼻喉科感染

疼痛

乳头状瘤病毒感染

寄生虫感染

帕金森氏症

小儿水痘带状疱疹病毒

盆腔炎性疾病

消化链球菌感染

常年性变应性鼻炎

关节周炎

急性结膜炎感染

恶性疟原虫感染

疟原虫感染

三日疟原虫感染

间日疟原虫感染

卡氏肺孢子虫感染

脊髓灰质炎病毒感染

多瘤病毒感染

术后细菌外泄

结肠袋炎

普雷沃菌感染

原发性胆汁性肝硬化

原发性硬化性胆管炎

痤疮丙酸杆菌感染

丙酸杆菌感染

前列腺癌

变形菌感染

奇异变形菌感染

原虫感染

普罗威登斯菌感染

铜绿假单胞菌感染

假单胞菌感染

银屑病

适应症

银屑病性关节炎

肺纤维化

狂犬病病毒感染

直肠癌

呼吸道合胞体病毒感染

呼吸道感染

呼吸道炎症

类风湿性关节炎

鼻炎

根毛霉感染

根霉菌感染

立克次体感染

罗斯河病毒感染

轮状病毒感染

风疹病毒感染

沙门氏菌感染

伤寒沙门氏菌感染

肌少症

非典型性肺炎冠状病毒感染

疥疮感染

赛多孢感染

硬皮病

季节性变应性鼻炎

沙雷氏菌感染

粘质沙雷氏菌

鲍氏志贺氏菌

痢疾志贺氏菌

福氏志贺氏菌

志贺氏菌感染

索氏志贺氏菌感染

短肠综合征

皮肤过敏

皮肤癌

皮肤感染

炎症性皮肤病

睡眠障碍症

脊椎关节炎

金黄色葡萄球菌感染

表皮葡萄球菌感染

葡萄球菌感染

腐生葡萄球菌感染

嗜麦芽寡养单胞菌感染

胃癌

胃部感染

胃溃疡

无乳链球菌感染

星座链球菌感染

链球菌感染

中间链球菌感染

缓症链球菌感染

口腔链球菌感染适应症

肺炎链球菌感染

化脓链球菌感染

全身性红斑狼疮

旅游者腹泻

战壕口炎

密螺旋体感染

梅毒密螺旋体感染

毛滴虫感染

毛癣菌感染

布氏锥虫感染

克氏锥虫感染

I型糖尿病

II型糖尿病

溃疡性结肠炎

上呼吸道感染

解脲支原体感染

尿路疾病

尿路感染

尿路肿瘤

泌尿生殖道感染

子宫感染

牛痘病毒感染

阴道感染

水痘带状疱疹病毒感染

天花病毒感染

霍乱弧菌感染

病毒性眼部感染

病毒性感染

病毒性呼吸道感染

草绿色群链球菌感染(Viridans group Streptococcus infection)

耐万古霉素肠球菌感染

消瘦综合征

体重减轻

西尼罗病毒感染

惠普尔病

异生物质代谢

黄热病病毒感染

鼠疫耶尔森氏菌感染

肠胃气胀

肠胃失调

全身性炎症

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

表6

表7

表8

表9

/>

/>

/>

/>

表10

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

表14：治疗后生态

表15：移入OTU

/>

/>

表16：扩增OTU

表17：导致OTU梭菌属SM4/1扩增或移入的所投予孢子生态剂量中的三元OUT组合

/>

/>

/>

/>

表18：导致OTU梭菌属SSC/2扩增或移入的所投予孢子生态剂量中的三元OUT组合

/>

/>

表19：导致OTU梭菌属NML 04A032扩增或移入的所投予孢子生态剂量中的三元OUT组合

/>

表20：导致OTU梭菌属NML 04A032、酸奶瘤胃球菌以及扭链瘤胃球菌扩增或移入的所投予孢子生态剂量中的三元OUT组合

表21：导致OTU直肠真杆菌、普氏粪杆菌、颤杆菌属G2、酸奶瘤胃球菌以及扭链瘤胃球菌扩增和移入的所投予孢子生态剂量中的三元OUT组合

/>

表22：可与替代名称(例如根据NCBI使用的当前名称)一起存在于表格、说明书或所属领域的所选OUT.参考文献1是Kaur等人,“Hungatella effluvia新属，新种，一种从废水处理厂分离出来的绝对好氧细菌，并且将哈瑟维梭菌重新分类成Hungatella hathewayi新属，新组合(Hungatella effluvii gen.nov.,sp.nov.,an obligately anaerobicbacterium isolated from an effluent treatment plant,and reclassification ofClostridium hathewayi as Hungatella hathewayi gen.nov.,comb.nov.)”,《国际微生物分类进化学杂志(Int J Sys Evol Microbiol)》,2014年3月,第64卷,第710页-第718页。参考文献2是Gerritsen等人,“分离自大鼠胃肠道的Romboutsia ilealis新属，新种的表征，并且提议将梭菌属的5个密切相关成员重新分类成属Romboutsia新属、Intestinibacter新属、Terrisporobacter新属和Asaccharospora新属(Characterizationof Romboutsia ilealis gen.nov.,sp.nov.,isolated from the gastro-intestinaltract of a rat,and proposal for the reclassification of five closely relatedmembers of the genus Clostridium into the genera Romboutsia gen.nov.,Intestinibacter gen.nov.,Terrisporobacter gen.nov.and Asaccharosporagen.nov.)”,《国际微生物分类进化学杂志》,2014年5月,第64卷,第1600页-第1616页

本申请还涉及以下项目。

1.一种包含治疗有效量的细菌组合物的组合物，所述组合物至少包含能够形成孢子的第一类型的经分离细菌、能够形成孢子的第二类型的经分离细菌以及任选地能够形成孢子的第三类型的经分离细菌，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的细菌不相同，并且其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少两个可协同降低和/或抑制至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。

2.根据项目1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9、10或15种类型的经分离细菌。

3.根据项目1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9、10或15种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15种可形成孢子。

4.根据项目1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。

5.根据项目1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含：i)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的能够形成孢子的经分离细菌，ii)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的并非已知能够形成孢子的经分离细菌，或iii)i)和ii)的任何组合。

6.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以近似相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

7.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以并非基本上相等的浓度或活动水平或活动水平存在于所述组合物中。

8.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型以至少约150％所述第二类型的浓度存在于所述组合物中，或其中所述第二类型以至少约150％所述第一类型的浓度存在于所述组合物中。

9.根据项目1所述的组合物，其中所述组合物基本上由以下各者组成：i)介于两种与约二十种类型之间的经分离细菌，其中至少两种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子；ii)介于两种与约二十种类型之间的经分离细菌，其中至少两种类型的经分离细菌并非已知能够形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。

10.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌是选自表1。

11.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌、所述第二类型的经分离细菌和所述任选的第三类型的经分离细菌包含操作分类单位(OTU)区别。

12.根据项目11所述的组合物，其中所述OTU区别包含低于约95％一致性的16SrDNA序列相似性。

13.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌独立地包含细菌，所述细菌包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

14.根据项目1所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合为：i)细胞毒性的，ii)细胞生长抑制性的，iii)能够降低病原性细菌的生长，iv)能够抑制所述病原性细菌的生长，v)能够降低所述病原性细菌的定殖，vi)能够抑制所述病原性细菌的定殖，或vii)i)到vi)的任何组合。

15.根据项目14所述的组合物，其中所述组合能够抑制以至少等于所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的浓度存在的病原性细菌的增殖。

16.根据项目14所述的组合物，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约两倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

17.根据项目14所述的组合物，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约十倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

18.根据项目14到17中任一项所述的组合物，其中所述组合能够在存在所述病原性细菌的情况下增殖。

19.根据项目14所述的组合物，其中所述病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌(Yersinia)、弧菌(Vibrio)、密螺旋体(Treponema)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、志贺杆菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、立克次体(Rickettsia)、东方体(Orientia)、假单胞菌(Pseudomonas)、普罗威登斯菌(Providencia)、变形菌(Proteus)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、奈瑟氏菌(Neisseria)、支原体(Mycoplasma)、分枝杆菌(Mycobacterium)、摩根氏菌(Morganella)、李斯特菌(Listeria)、钩端螺旋体(Leptospira)、军团菌(Legionella)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、螺旋杆菌(Helicobacter)、嗜血杆菌(Haemophilus)、梭杆菌(Fusobacterium)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、埃希氏杆菌(Escherichia)、艾利希体(Ehrlichia)、肠球菌(Enterococcus)、考克斯氏体(Coxiella)、棒状杆菌(Corynebacterium)、梭菌(Clostridium)、衣原体(Chlamydia)、嗜衣体(Chlamydophila)、弯曲杆菌(Campylobacter)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、布鲁氏菌(Brucella)、疏螺旋体(Borrelia)、博德特菌(Bordetella)、双叉杆菌(Bifidobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、多药耐药性细菌(multi-drug resistant bacteria)、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

20.根据项目14所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用。

21.根据项目14所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以抑制所述病原性细菌。

22.根据项目1到21中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

23.根据项目22所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

24.根据项目23所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

25.根据项目23所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

26.根据项目22所述的组合物，其中所述组合物包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

27.一种组合物，其包含有效量的细菌组合物，所述细菌组合物包含至少第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中仅一个能够形成孢子，且其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三中的至少一个能够减少至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。

28.一种组合物，其包含有效量的细菌组合物，所述细菌组合物包含至少第一类型的经分离细菌和第二类型的经分离细菌，其中所述第一类型和/或所述第二类型和/或所述任选的第三类型并非孢子或并非已知能够形成孢子，且其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少一个能够减少至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。

29.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少一个能够降低至少一种类型的病原性细菌的生长速率。

30.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少一个对至少一种类型的病原性细菌具有细胞毒性。

31.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少一个对至少一种类型的病原性细菌具有细胞生长抑制性。

32.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型选自表1。

33.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型包含不同物种。

34.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型包含不同属。

35.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型包含不同科。

36.根据项目1、27和28中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型包含不同目。

37.根据项目27到36中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

38.根据项目37所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

39.根据项目38所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

40.根据项目38所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

41.根据项目37所述的组合物，其中所述组合物包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

42.一种包含有效量的细菌组合物的组合物，所述细菌组合物至少包含第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选地第三类型的经分离细菌，其中：

i)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型能够独立地形成孢子；

ii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中仅一个能够形成孢子；或

iii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中任一个都不能形成孢子，

其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型不相同，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型能够功能性填充投予所述组合物的人类个体的胃肠道。

43.根据项目42所述的组合物，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

44.根据项目42所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

45.根据项目44所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

46.根据项目44所述的组合物，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

47.根据项目42所述的组合物，其中所述组合物包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

48.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含预防所述胃肠道菌群失调。

49.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含治疗所述胃肠道菌群失调。

50.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减轻所述胃肠道菌群失调的严重程度。

51.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减轻所述胃肠道菌群失调的一种或多种症状。

52.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含预防病原性细菌在所述胃肠道生长和/或定殖。

53.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减少病原性细菌在所述胃肠道生长和/或定殖。

54.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减少所述胃肠道中的一种或多种类型的病原性细菌的数目。

55.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含增加所述胃肠道中的一种或多种非病原性细菌的数目。

56.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述细菌组合物包含0、1、2、3种或大于3种类型的能够形成孢子的经分离细菌。

57.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的能够形成孢子的经分离细菌。

58.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约7种类型的能够形成孢子的经分离细菌。

59.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以并非基本上相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

60.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以近似相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

61.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述第一类型以至少约150％所述第二类型的浓度存在于所述组合物中。

62.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述第二类型以至少约150％所述第一类型的浓度存在于所述组合物中。

63.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中至少一种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子。

64.根据项目42所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌是选自表1。

65.根据项目42所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌、所述第二类型的经分离细菌和所述任选的第三类型的经分离细菌包含操作分类单位(OTU)区别。

66.根据项目65所述的组合物，其中所述OTU区别包含低于约95％一致性的16SrDNA序列相似性。

67.根据项目42所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌独立地包含细菌，所述细菌包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

68.根据项目42到47中任一项所述的组合物，其中所述第一类型和所述第二类型的组合对所述病原性细菌具有细胞毒性或细胞生长抑制性。

69.根据项目68所述的组合物，其中所述组合能够抑制以至少等于所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的浓度存在的病原性细菌的增殖。

70.根据项目68所述的组合物，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约两倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

71.根据项目68所述的组合物，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约十倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

72.根据项目68到71中任一项所述的组合物，其中所述组合能够在存在所述病原性细菌的情况下增殖。

73.根据项目68所述的组合物，其中所述病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

74.根据项目68所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以对所述病原性细菌具有细胞毒性。

75.根据项目68所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以对所述病原性细菌具有细胞生长抑制性。

76.一种单个剂量单元，其包含根据项目1、27、28或42中任一项所述的组合物。

77.根据项目76所述的剂量单元，其包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的孢子或营养细菌细胞。

78.根据项目76所述的剂量单元，其包含药学上可接受的赋形剂、肠溶包衣或其组合。

79.根据项目76所述的剂量单元，其进一步包含选自以下的药物：皮质类固醇、美沙拉嗪(mesalazine)、美沙拉明(mesalamine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、柳氮磺胺吡啶衍生物、免疫抑制药物、环孢菌素A(cyclosporin A)、巯基嘌呤、硫唑嘌呤、泼尼松(prednisone)、甲胺喋呤(methotrexate)、抗组胺剂、糖皮质激素、肾上腺素、茶碱、色甘酸钠、抗白三烯剂、用于鼻炎的抗胆碱激导性药物、抗胆碱激导性解充血剂、肥大细胞稳定剂、单克隆抗IgE抗体、疫苗以及其组合，其中所述药物以有效调节至少一种病原体的量和/或活性的量存在。

80.根据项目76所述的剂量单元，其经配制用于经口投予、经直肠投予、或经口与经直肠投予的组合。

81.根据项目76所述的剂量单元，其经配制用于局部、经鼻或吸入投予。

82.根据项目76到81中任一项所述的剂量单元，其中所述剂量单元包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

83.根据项目82所述的剂量单元，其中所述剂量单元包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

84.根据项目83所述的剂量单元，其中所述剂量单元包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

85.根据项目83所述的剂量单元，其中所述剂量单元包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

86.根据项目82所述的剂量单元，其中所述剂量单元包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

87.一种试剂盒，其在一个或多个容器中包含：基本上不含活营养细菌细胞的第一类型的细菌孢子的第一经纯化种群；基本上不含活营养细菌细胞的第二类型的细菌孢子的第二经纯化种群；以及任选地基本上不含活营养细菌细胞的第三类型的细菌孢子的第三经纯化种群，其中所述第一类型、所述第二类型以及任选的第三类型的细菌孢子不相同，并且其中所述第一类型、所述第二类型和任选的第三类型的细菌孢子当共存于有需要的人类个体的胃肠道的目标区域中时，能够功能性填充所述胃肠道。

88.根据项目87所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群存在于单一容器中。

89.根据项目87所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和任选的第三经纯化种群存在于两个或任选地三个容器中。

90.根据项目87所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群经冻干或基本上脱水。

91.根据项目87所述的试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中进一步包含有效量的抗细菌剂、有效量的抗病毒剂、有效量的抗真菌剂、有效量的抗寄生虫剂或其于一个或多个容器中的组合。

92.根据项目87所述的试剂盒，其进一步包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

93.根据项目87到92中任一项所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

94.根据项目93所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

95.根据项目94所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

96.根据项目94所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

97.根据项目93所述的试剂盒，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

98.一种药物配制品，其包含有效量的根据项目1、27、28和42中任一项所述的组合物，并且进一步包含有效量的抗细菌剂。

99.一种药物配制品，其包含有效量的根据项目1、27、28和42中任一项所述的组合物，并且进一步包含有效量的抗真菌剂。

100.一种药物配制品，其包含有效量的根据项目1、27、28和42中任一项所述的组合物，并且进一步包含有效量的抗病毒剂。

101.一种药物配制品，其包含有效量的根据项目1、27、28和42中任一项所述的组合物，并且进一步包含有效量的抗寄生虫剂。

102.根据项目98到101中任一项所述的药物配制品，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

103.根据项目102所述的药物配制品，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

104.根据项目103所述的药物配制品，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

105.根据项目103所述的药物配制品，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

106.根据项目102所述的药物配制品，其中所述组合物包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

107.一种可食用产品，其包含第一类型的细菌孢子的第一经纯化种群、第二类型的细菌孢子的第二经纯化种群和任选地第三类型的细菌孢子的第三经纯化种群，其中所述第一类型、所述第二类型和任选的第三类型的细菌孢子不相同，其中所述可食用产品基本上不含活营养细菌细胞，并且其中所述第一类型、所述第二类型和任选的第三类型的细菌孢子当向有需要的人类个体投予时能够功能性填充所述人类个体的胃肠道。

108.根据项目107所述的可食用产品，其包含食品或食品添加剂。

109.根据项目107所述的可食用产品，其包含饮料或饮料添加剂。

110.根据项目107所述的可食用产品，其包含医疗食品。

111.根据项目107所述的可食用产品，其包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的活孢子。

112.根据项目107所述的可食用产品，其中所述第一类型的细菌孢子和所述第二类型的细菌孢子是选自表1。

113.根据项目107所述的可食用产品，其中所述第一类型的细菌孢子和所述第二类型的细菌孢子独立地包含细菌孢子，所述细菌孢子包含与选自表1的细菌中所存在的16SrDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

114.根据项目107到111中任一项所述的可食用产品，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

115.根据项目114所述的可食用产品，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

116.根据项目115所述的可食用产品，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

117.根据项目115所述的可食用产品，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

118.根据项目114所述的可食用产品，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

119.根据项目107到118中任一项所述的可食用产品，其中所述可食用产品富含益生元。

120.一种方法，其包含向有需要的人类个体投予有效量的包含至少第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选地第三类型的经分离细菌的细菌组合物，其中：

i)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型能够独立地形成孢子；

ii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中仅一个能够形成孢子；或

iii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型都不能形成孢子，

其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型不相同，并且其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少一个对所述人类个体的所述胃肠道中存在的病原性细菌发挥抑制性作用，使得所述胃肠道中存在的病原性细菌的数目在一段时间不会可检测地增加或可检测地减少。

121.根据项目120所述的方法，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

122.根据项目121所述的方法，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

123.根据项目122所述的方法，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

124.根据项目122所述的方法，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

125.根据项目121所述的方法，其中所述组合物包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

126.根据项目120到125中任一项所述的方法，其中所述人类个体被诊断为患有所述胃肠道菌群失调。

127.根据项目120到125中任一项所述的方法，其中所述人类个体被诊断为感染有选自由以下组成的群组的病原性细菌：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

128.根据项目127所述的方法，其中所述细菌组合物与i)抗生素、ii)益生元、或iii)i)和ii)的组合同时投予。

129.根据项目127所述的方法，其中所述细菌组合物在投予i)抗生素、ii)益生元、或iii)i)和ii)的组合之前投予。

130.根据项目127所述的方法，其中所述细菌组合物在投予i)抗生素、ii)益生元、或iii)i)和ii)的组合之后投予。

131.根据项目127所述的方法，其中所述人类个体的胃肠道中所存在的或从其中排泄的病原性细菌的数目在投予所述细菌组合物的一个月内、两周内或一周内可检测地降低。

132.根据项目127所述的方法，其中所述人类个体的胃肠道中所存在的或从其中排泄的病原性细菌的数目在投予所述细菌组合物的三天内、两天内或一天内可检测地降低。

133.根据项目127所述的方法，其中所述人类个体在投予所述细菌组合物的一个月内、两周内、一周内、三天内或一天内可检测地不含所述病原性细菌。

134.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌。

135.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌且所述经分离细菌中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种能够形成孢子。

136.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。

137.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含：i)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的能够形成孢子的经分离细菌，ii)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的并非已知能够形成孢子的经分离细菌，或iii)i)和ii)的任何组合。

138.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1种能够形成孢子。

139.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1种不能形成孢子。

140.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌，其中i)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌能够形成孢子，ii)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌不能形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。

141.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以近似相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

142.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以并非基本上相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

143.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述第一类型以至少约150％所述第二类型的浓度存在于所述组合物中，或其中所述第二类型以至少约150％所述第一类型的浓度存在于所述组合物中。

144.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中至少两种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子。

145.根据项目103到125中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中至少两种类型的经分离细菌不能形成孢子。

146.根据项目120所述的方法，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌是选自表1。

147.根据项目120所述的方法，其中所述第一类型的经分离细菌、所述第二类型的经分离细菌和所述任选的第三类型的经分离细菌包含操作分类单位(OTU)区别。

148.根据项目147所述的方法，其中所述OTU区别包含低于约95％一致性的16SrDNA序列相似性。

149.根据项目120所述的方法，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌独立地包含细菌，所述细菌包含与选自表1的细菌中存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

150.根据项目120到125中任一项所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合对所述病原性细菌具有细胞毒性或细胞生长抑制性。

151.根据项目150所述的方法，其中所述组合能够抑制以至少等于所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的浓度存在的病原性细菌的增殖。

152.根据项目150所述的方法，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约两倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

153.根据项目150所述的方法，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约十倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

154.根据项目150到151中任一项所述的方法，其中所述组合能够在存在所述病原性细菌的情况下增殖。

155.根据项目150所述的方法，其中所述病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

156.根据项目150所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以对所述病原性细菌具有细胞毒性。

157.根据项目150所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以对所述病原性细菌具有细胞生长抑制性。

158.一种功能性填充人类个体的胃肠道的方法，其包含向所述个体投予有效量的包含至少第一类型的经分离细菌、第二类型的经分离细菌和任选地第三类型的经分离细菌的细菌组合物，其中：

i)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型能够独立地形成孢子；

ii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中仅一个能够形成孢子；或

iii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型都不能形成孢子，

其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型不相同，其条件是使得所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型功能性填充所述人类个体的胃肠道。

159.根据项目158所述的方法，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

160.根据项目158所述的方法，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

161.根据项目160所述的方法，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

162.根据项目160所述的方法，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

163.根据项目158所述的方法，其中所述组合物包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

164.根据项目158中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物为经口投予、经直肠投予、或经口与经直肠投予的组合。

165.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物为局部或经鼻投予或吸入。

166.根据项目158所述的方法，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌是选自表1。

167.根据项目158中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物基本上由孢子组成，其中所述孢子包含所述第一类型的经分离细菌的孢子、所述第二类型的经分离细菌的孢子和所述任选的第三类型的经分离细菌的孢子。

168.根据项目158所述的方法，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌独立地包含细菌孢子，所述细菌孢子包含与选自表1的细菌中所存在的16SrDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

169.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含预防所述胃肠道菌群失调。

170.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含治疗所述胃肠道菌群失调。

171.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减轻所述胃肠道菌群失调的严重程度。

172.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减轻所述胃肠道菌群失调的一种或多种症状。

173.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含预防病原性细菌在所述胃肠道定殖。

174.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减少病原性细菌在所述胃肠道定殖和/或生长。

175.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含减少所述胃肠道中的一种或多种类型的病原性细菌的数目。

176.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述胃肠道的所述功能性填充包含增加所述胃肠道中的一种或多种非病原性细菌的数目。

177.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约3、5、7或9种类型的能够形成孢子的经分离细菌。

178.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少20％能够形成孢子。

179.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。

180.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌，其中i)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌能够形成孢子，ii)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种类型的经分离细菌不能形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。

181.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以近似相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

182.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以并非基本上相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

183.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述第一类型以至少约150％所述第二类型的浓度存在于所述组合物中，或其中所述第二类型以至少约150％所述第一类型的浓度存在于所述组合物中。

184.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上由介于两种与约十种类型之间的经分离细菌组成，其中i)至少一种类型的经分离细菌能够形成孢子，ii)至少一种类型的经分离细菌不能形成孢子，或iii)i)和ii)的组合。

185.根据项目158到163中任一项所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合对所述病原性细菌具有抑制性。

186.根据项目185所述的方法，其中所述组合降低所述病原性细菌的生长速率。

187.根据项目185所述的方法，其中所述组合对所述病原性细菌具有细胞生长抑制性或细胞毒性。

188.根据项目185所述的方法，其中所述组合能够抑制以至少等于所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的浓度存在的病原性细菌的生长。

189.根据项目185所述的方法，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约两倍的浓度存在的病原性细菌的生长。

190.根据项目185所述的方法，其中所述组合能够抑制以至少为所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的组合的浓度的约十倍的浓度存在的病原性细菌的增殖。

191.根据项目187到190中任一项所述的方法，其中所述组合能够在存在所述病原性细菌的情况下增殖。

192.根据项目185所述的方法，其中所述病原性细菌选自由以下组成的群组：耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

193.根据项目185所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以减少或抑制所述病原性细菌的生长。

194.根据项目185所述的方法，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型协同地相互作用以减少或抑制所述病原性细菌的定殖。

195.根据项目158中任一项所述的方法，其包含向所述人类个体投予包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的活细菌的单个剂量单元。

196.根据项目195所述的方法，其中所述剂量单元包含基本上呈孢子形式的细菌种群。

197.根据项目195所述的方法，其中所述剂量单元包含药学上可接受的赋形剂和/或肠溶包衣。

198.根据项目195所述的方法，其中所述单位剂量经配制用于经口投予、经直肠投予、或经口与经直肠投予的组合。

199.根据项目195所述的方法，其中所述单位剂量经配制用于局部或经鼻投予或用于吸入。

200.一种减少人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目的方法，其包含向所述个体投予有效量的药物配制品，所述药物配制品包含有效量的根据项目1、22到27、27、25、37到41、28或42中任一项所述的组合物，并且进一步包含有效量的抗微生物剂，其条件是使得所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述药物配制品的约一个月内降低。

201.根据项目200所述的方法，其中所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述药物配制品的约两周内降低。

202.根据项目200所述的方法，其中所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述药物配制品的约一周内降低。

203.根据项目200所述的方法，其中所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述药物配制品的约三天内降低。

204.根据项目200所述的方法，其中所述人类个体的胃肠道中所存在的病原性细菌的数目在投予所述药物配制品的约一天内降低。

205.根据项目200所述的方法，其中所述抗微生物剂包含抗细菌剂。

206.根据项目200所述的方法，其中所述抗微生物剂包含抗真菌剂。

207.根据项目200所述的方法，其中所述抗微生物剂包含抗病毒剂。

208.根据项目200所述的方法，其中所述抗微生物剂包含抗寄生虫剂。

209.一种制备可食用产品的方法，其包含使可食用载剂与至少包含第一类型的经分离细菌的第一经纯化种群、至少包含第二类型的经分离细菌的第二经纯化种群以及任选地至少包含第三类型的经分离细菌的第三经纯化种群组合，其中：

i)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型能够独立地形成孢子；

ii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中仅一个能够形成孢子；或

iii)所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型都不能形成孢子，

其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的细菌不相同，其中所述可食用产品基本上不含不可食用材料。

210.根据项目209所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群中的至少一个主要由活孢子组成。

211.根据项目209所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群主要由活孢子组成。

212.根据项目209所述的方法，其中所述可食用产品基本上不含活营养细菌细胞。

213.根据项目211所述的方法，其中所述活孢子在所述可食用产品被有需要的人类个体食用时能够功能性填充所述人类个体的胃肠道。

214.根据项目209所述的方法，其中所述可食用产品包含食品或食品添加剂。

215.根据项目209所述的方法，其中所述可食用产品包含饮料或饮料添加剂。

216.根据项目209所述的方法，其中所述可食用产品包含医疗食品。

217.根据项目209所述的方法，其中所述可食用产品包含至少1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹或大于1×10¹¹菌落形成单位(CFU)的活孢子。

218.根据项目209到217中任一项所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

219.根据项目218所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

220.根据项目219所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

221.根据项目219所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

222.根据项目218所述的方法，其中所述第一经纯化种群、所述第二经纯化种群和所述任选的第三经纯化种群包含表4b的任何行中所述的细菌的组合。

223.根据项目209所述的方法，其中孢子属于选自表1的细菌。

224.根据项目209所述的方法，其中所述第一经纯化种群和所述第二经纯化种群独立地包含细菌孢子，所述细菌孢子包含与选自表1的细菌中所存在的16S rDNA序列至少95％一致的16S rDNA序列。

225.一种降低患者的胃肠道中的病原体的丰度的方法，其包含以治疗有效量投予根据项目1所述的组合物，并且允许所述细菌组合物与所述病原体在患者的胃肠道中竞争。

226.一种治疗腹泻的方法，其包含以治疗有效量投予根据项目1所述的组合物，并且允许所述细菌组合物降低病原体在患者的胃肠道中的腹泻作用。

227.根据项目225或226所述的方法，其中所述病原体为耶尔森氏菌、弧菌、密螺旋体、链球菌、葡萄球菌、志贺杆菌、沙门氏菌、立克次体、东方体、假单胞菌、普罗威登斯菌、变形菌、丙酸杆菌、奈瑟氏菌、支原体、分枝杆菌、摩根氏菌、李斯特菌、钩端螺旋体、军团菌、克雷伯氏菌、螺旋杆菌、嗜血杆菌、梭杆菌、弗朗西斯氏菌、埃希氏杆菌、艾利希体、肠球菌、考克斯氏体、棒杆菌、梭菌、衣原体、嗜衣体、弯曲杆菌、伯克霍尔德菌、布鲁氏菌、疏螺旋体、博德特菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、多药耐药性细菌、卡巴盘尼姆耐药性肠杆菌(CRE)、超广谱β-内酰胺耐药性肠球菌(ESBL)以及万古霉素耐药性肠球菌(VRE)。

228.根据项目225或226所述的方法，其中所述病原体是艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、病原性大肠杆菌(Escherichia coli)或万古霉素耐药性肠球菌属(vancomycin-resistant Enterococcus spp.)。

229.根据项目225或226所述的方法，其中所述病原体是艰难梭菌。

230.根据项目225或226所述的方法，其中所述组合物为经口投予。

231.根据项目225到230中任一项所述的方法，其中所述组合物包含表4a或表4b的任何行中所述的细菌的组合。

232.根据项目231所述的方法，其中所述组合物包含表4a的任何行中所述的细菌的组合。

233.根据项目232所述的方法，其中所述组合物包含表4a的具有++++或+++标示的任何行中所述的细菌的组合。

234.根据项目232所述的方法，其中所述组合物包含表4a的具有75百分位标示的任何行中所述的细菌的组合。

235.根据项目231所述的方法，其中所述组合物包含表4b的任何行中描述的细菌的组合。

236.一种组合物，其包含包含选自表10的网状生态。

237.根据项目236所述的组合物，其中所述网状生态包含网状进化枝。

238.根据项目236所述的组合物，其中所述网状生态包含网状OTU。

239.根据项目236所述的组合物，其中所述组合物包含产生布劳特氏菌(Blautiaproducta)、双孢梭菌(Clostridium disporicum)、无害梭菌(Clostridium innocuum)、马犹姆贝梭菌(Clostridiummayombei)、奥比赛登梭菌(Clostridium orbiscindens)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)以及毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)5_1_57FAA。

240.根据项目236到239中任一项所述的组合物，其中所述组合物有效用于治疗菌群失调的至少一种病征或症状。

241.根据项目236到239中任一项所述的组合物，其中所述组合物有效用于减轻与艰难梭菌、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumonii)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)或万古霉素耐药性肠球菌(VRE)有关的感染的至少一种病征或症状。

242.一种组合物，其包含选自表4a、表4b或表12中鉴别的异三聚体的细菌异三聚体，其中所述异三聚体可在CivSim分析中抑制病生菌生长。

243.一种组合物，其包含选自表14、表15、表16、表17、表17、表18、表19、表20或表21中鉴别的异三聚体的细菌异三聚体，其中所述异三聚体的所述生物体可在人类胃肠道中扩增和/或移入。

244.根据项目243所述的组合物，其中所述移入和/或扩增可在向患有菌群失调的人类投予所述组合物之后发生。

245.根据项目244所述的组合物，其中所述菌群失调与所述人类胃肠道中存在艰难梭菌有关。

Claims (10)

1.一种包含治疗有效量的细菌组合物的组合物，所述组合物至少包含能够形成孢子的第一类型的经分离细菌、能够形成孢子的第二类型的经分离细菌以及任选地能够形成孢子的第三类型的经分离细菌，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型的细菌不相同，并且其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型中的至少两个可协同降低和/或抑制至少一种类型的病原性细菌的生长和/或定殖。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9、10或15种类型的经分离细菌。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约3、4、5、6、7、8、9、10或15种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15种可形成孢子。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含至少约5种类型的经分离细菌，且所述经分离细菌中的至少2种能够形成孢子。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细菌组合物包含：i)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的能够形成孢子的经分离细菌，ii)至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种类型的并非已知能够形成孢子的经分离细菌，或iii)i)和ii)的任何组合。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以近似相等的浓度或活动水平存在于所述组合物中。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一类型、所述第二类型和所述任选的第三类型以并非基本上相等的浓度或活动水平或活动水平存在于所述组合物中。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一类型以至少约150％所述第二类型的浓度存在于所述组合物中，或其中所述第二类型以至少约150％所述第一类型的浓度存在于所述组合物中。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物基本上由以下各者组成：i)介于两种与约二十种类型之间的经分离细菌，其中至少两种类型的经分离细菌能够独立地形成孢子；ii)介于两种与约二十种类型之间的经分离细菌，其中至少两种类型的经分离细菌并非已知能够形成孢子，或iii)i)和ii)的任何组合。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一类型的经分离细菌和所述第二类型的经分离细菌是选自表1。

Images