KR102177181B1 - 트레포네마 파지데니스 균주의 배양 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 함유된 휘발성 지방산(VFA) 함량의 1.5 내지 2.5배 더 포함하는 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주의 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 트레포네마 파지데니스 배양 및 분리 배지에 관한 것으로, 본 발명에 따른 배지에 의하여 트레포네마 파지데니스 균주를 비표적 미생물로부터 선택적으로 배양 및 분리할 수 있다.
Description
본 발명은 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 배양하고 분리하기 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 트레포네마 파지데니스 균주 배양 및 분리용 배지에 관한 것이다.
트레포네마 파지데니스(T. phagedenis)는 소 발굽질병을 유발하는 원인균으로서, 건강한 조직의 계면에서의 지속적 생존이 가능하여 질병 발병에 주요 작용제로 간주되고 있다. 트레포네마 파지데니스는 처음에 스피로헤타 파지데니스(Spirocahaeta phagedenis)로 명명되었으며, 침식성(phagedenic) 병변이 있는 여성의 외부 생식기와 독일에서 소 발굽으로부터 분리될 때까지, 트레포네마 파지데니스는 16s rRNA 유전자 서열에 기초한 인간 균주와 유전적으로 관련되어 있다고 보았다. 이러한 트레포네마 파지데니스는 처음 발견된지 100년이 지난 지금도 이 종에 관한 연구가 충분히 이루어지지 않고 있어 다양한 정보가 공개되어 있지 않은 상태이다.
트레포네마 파지데니스에 대한 연구가 충분히 이루어지지 않는 이유 중 하나는 트레포네마 종의 까다로운 특성으로 인해 혐기성 물질을 시험관 내에서 배양하여 이를 분리하는 것이 매우 어렵기 때문이다. 구체적으로 배양 및 분리가 어려운 이유로는, (i) 트레포네마는 까다로운 성질과 복잡한 영양 및 배양 조건을 가지고 있으며, (ii) 발굽 피부에는 트레포네마 외의 다른 공생 미생물의 존재하고, (iii) 발굽 조직 샘플에는 트레포네마의 성장을 능가하여 빠르게 성장하는 다른 미생물의 영양 성분인 배성물, 토양물질, 배양 배지 등이 포함되어 있으며, 및 (iv) 상기 다른 미생물이 길항제를 생성하여 트레포네마의 성장을 억제할 수 있는 가능성 등이 있기 때문이다.
한편, 소 발굽질병이란 발굽에 질병이 발생한 상태를 말하는 것으로, 발굽각질 및 발꿈치 부위가 썩어 들어가거나, 발굽 사이 및 발꿈치 사이에 이상조직이 자라나는 등 소가 절뚝거리는 특징을 보이는 질병이다. 이러한 발굽질병이 나타나는 소는 동물의 복지 감소와 우유 생산 감소, 조기 도태 및 생식 능력 저하에 따른 경제적 영향으로 인해 심각한 문제를 야기한다. 따라서, 소 발굽질병을 예방 또는 치료하기 위하여 이를 유발하는 트레포네마 파지데니스를 선택적으로 배양 및 분리하기 위한 새로운 배지에 대한 연구가 필요한 실정이다.
경구 트레포네마 농축배양액(Oral Treponeme Enrichment Broth, OTEB)는 트레포네마 속의 모든 종을 배양 및 분리하기 위한 배지이다. 상기와 같은 농축배양액은 트레포네마 속의 모든 종을 배양 및 분리하기 때문에 본 발명에서 분리하고자 하는 트레포네마 파지데니스 종만을 선택적으로 배양 및 분리하는데 적합하지 못하므로, 트레포네마 파지데니스 종만을 선택적으로 분리하기 위한 새로운 배지가 필요한 실정이다.
한편, 배양 조건이 까다로운 트레포네마를 배양하기 위한 배양 시스템에 대한 기술이 선행문헌에 개시되어 있다. 구체적으로, 미국공개특허 제2020-0032201호는 트레포네마 필라듐(T. pallidum)과 같은 트레포네마 종을 시험관 내에서 배양하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 트레포네마 종을 호기성 조건 및 산 염기, 뉴클레오사이드, 코카르복실라제, 코엔자임 A, 플라빈아데닌디뉴클레오티드, NAD, NADP, 나트륨 아세테이트, 나트륨 글루코로 네이트, 지방산 혼합물 및 트윈 80으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지를 이용하여 트레포네마를 배양하고 있다. 그러나, 상기 선행문헌에 개시된 배양 시스템은 트레포네마 파지데니스(T.phagedenis)를 배양 및 분리하기 위한 것은 아니며, 이를 배양 및 분리하기 위한 방법 및 조건 또한 본원발명과 차이가 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하고, 소 발굽질병을 유발하는 트레포네마 파지데니스 균주만을 배양 및 분리하기 위한 다양한 배지 조성을 연구 노력한 결과, 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 배지 조성물의 경우, 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 배양 및 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주만을 선택적으로 배양 및 분리하기 위한 트레포네마 파지데니스 균주 배양 및 분리용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 트레포네마 파지데니스 균주 배양 및 분리용 배지 조성물을 이용한 트레포네마 파지데니스 균주 배양 및 분리용 배지를 제공하는 데 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 함유된 휘발성지방산(VFA) 함량의 1.5 내지 2.5배 더 포함하는 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주의 배양용 배지 조성물을 제공한다.
트레포네마 파지데니스는 소 발굽질병을 일으키는 원인균으로서, 건강한 조직의 계면에서의 지속적 생존이 가능하여 질병 발병에 주요 작용제로 간주되고 있으나, 트레포네마 속의 까다로운 성질 및 배양 조건으로 인해 소 발굽질병을 유발하는 트레포네마 파지데니스를 분리 및 동정하기 어려워 트레포네마 파지데니스에 대한 연구가 충분히 이루어지지 못하고 있다.
트레포네마 속의 다양한 종들을 분리하기 위한 배지인 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)은 하기 표 1과 같이 휘발성지방산 및 소태아혈청을 포함하여 많은 성분들을 포함하고 있으나, 상기 설명한 바와 같이 경구 트레포네마 농축배양액은 트레포네마 속의 다양한 종들을 분리하기 위한 배지이기 때문에 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 분리하는데 한계가 있다.
| 성분 | 함량 |
| 프로테오스 펩톤 (Proteose peptone) | 5.0 g |
| Heart Infusion Broth | 5.0 g |
| 효모 추출물 (Yeast Extract) | 5.0 g |
| 인산 칼슘(dibasic) (Potassium phosphate) | 2.0 g |
| 염화나트륨 (Sodium chloride) | 5.0 g |
| 황산 마그네슘 (Magnesium sulfate heptahydrate) | 0.2 g |
| 휘발성 지방산 (Volatile fatty acid) | 3 mL |
| 비타민 K1 (1% solution) (Vitamin K1) | 1.0 mL |
| L-시스테인 (25% solution) (L-cysteine solution) | 2.0 mL |
| 소태아혈성 (Fetal bovine serum) | 100 mL |
| Sugar Stock solution* | 100 mL |
| 탈이온수 (Deionized water) | 800 mL |
상기 당저장용액(Sugar stock solution)은 글루코스 8g, 프룩토오스 8g, 수크로스 8g, 말토스 8g, 리보스 8g, 자일로스 8g, 펙틴 8g, 가뇽성 녹말(soluble starch) 8g, 피부르산 나트륨(sodium pyruvate) 8g, 티아민피로인산(thiamine pyrophosphate) 750ug, 및 탈이온수(deionized water) 1000 L로 이루어져 있다.
이에, 본 발명자들은 배양, 분리 및 동정이 어려운 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 배양 및 분리하기 위한 배지의 다양한 성분을 조정 및 변경하고자 하였으며, 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)의 휘발성지방산(VFA) 함량을 조절할 경우 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 배양하고 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
구체적으로, 본 발명의 배지 조성물에 있어서, 상기 휘발성 지방산(VFA)은 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB), 특히 상기 표 1의 조성을 갖는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 함유된 휘발성 지방산(VFA)의 총 함량에 비하여 1.5 내지 2.5배, 바람직하게는 1.8 내지 2.2배, 보다 바람직하게는 1.9 내지 2.1배, 가장 바람직하게는 2배 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 배지 조성물에 휘발성 지방산이 1.5배 미만으로 포함될 경우 트레포네마 파지데니스 균주 외의 비표적 미생물의 번식이 일어나 오히려 트레포네마 파지데니스 균주의 성장을 억제하게 되므로 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 분리하기 어려우며, 휘발성 지방산이 2.5배 초과하여 포함될 경우 트레포네마 파지데니스 균주의 성장이 지연되어 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 분리하기 어려운 문제가 있다.
본 발명의 배지 조성물에 있어서, 상기 휘발성 지방산(VFA)은 바람직하게 빙초산(Glacial acetic acid), 프로피온산(Propionic acid), 뷰티르산(Butyric acid), 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid)으로 구성된 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 예로, 본 발명의 배지 조성물에 함유된 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 상기 빙초산(Glacial acetic acid)은 50 내지 55 vol%, 바람직하게는 51 내지 54 vol%, 보다 바람직하게는 52 내지 54 vol%, 가장 바람직하게는 53 내지 54 vol%로 포함된다.
다른 하나의 구체적 예로, 본 발명의 배지 조성물에 함유된 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 상기 프로피온산(Propionic acid)은 18 내지 22 vol%, 바람직하게는 19 내지 21 vol%, 보다 바람직하게는 19.5 내지 20.5 vol%, 가장 바람직하게는 19.8 내지 20.2 vol%로 포함된다.
또 다른 하나의 구체적 예로, 본 발명의 배지 조성물에 함유된 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 상기 뷰티르산(Butyric acid)은 10 내지 15 vol%, 바람직하게는 11 내지 14 vol%, 보다 바람직하게는 12 내지 14 vol%, 가장 바람직하게는 13 내지 14 vol%로 포함된다.
또 다른 하나의 구체적 예로, 본 발명의 배지 조성물에 함유된 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 상기 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid) 각각은 3 내지 4 vol%, 바람직하게는 3.1 내지 3.8 vol%, 보다 바람직하게는 3.1 내지 3.6 vol%, 가장 바람직하게는 3.2 내지 3.4 vol%로 포함된다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 배지 조성물은 상기 휘발성 지방산을 더 포함하는 것 이외에 소태아혈청(FBS)을 상기 표 1의 조성으로 구성된 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 함유된 소태아혈청 함량의 1.5 내지 2.5배, 바람직하게는 1.8 내지 2.2배, 보다 바람직하게는 1.9 내지 2.1배, 가장 바람직하게는 2배 더 포함할 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에 소태아혈청을 더 포함하는 경우 종래의 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 비하여 트레포네마 파지데니스 균주를 선택적으로 분리하는데 더 효율적이다. 상기 추가로 포함된 소태아혈청의 함량이 1.5배 미만인 경우 트레포네마 파지데니스 균주를 배양 및 분리하는데 비효율적이며, 2.5배 초과인 경우 함량 대비 트레포네마 파지데니스 균주의 배양 및 분리가 효율적이지 않다.
또 하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 배지 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있다. 상기 항생제는 트레포네마 파지데니스 균주 외의 비표적 미생물의 번식을 억제하기 위한 어떠한 항생제도 포함할 수 있으나, 바람직하게는 리팜피신(rifampicin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 또는 리팜피신과 엔로플록사신 모두를 포함한다. 상기 항생제는 본 발명의 배지 조성물의 1ml 함량을 기준으로 18 내지 22ug, 바람직하게는 19 내지 21ug, 보다 바람직하게는 20ug으로 사용한다. 상기 항생제 함량이 18ug 미만인 경우 트레포네마 외의 비표적 미생물의 번식 증가로 인하여 트레포네마의 생존율이 낮아질 수 있으며, 22ug 초과인 경우 트레포네마의 사멸로 인하여 트레포네마의 생존율이 낮아질 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 트레포네마 파지데니스 균주 배양 및 분리용 배지 조성물과 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지 조성물이 혼합된 트레포네마 파지데니스 균주 분리용 배지를 제공한다.
본 발명의 상기 FAA 배지는 전체 FAA 배지의 100 중량부를 기준으로 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood) 4 내지 6 중량부, 바람직하게는 6 중량부; 소태아혈청 8 내지 12 중량부, 바람직하게는 10 중량부; 항생제 0.8 내지 1.2 중량부, 바람직하게는 1 중량부; 및 휘발성 지방산(VFA) 0.08 내지 0.12 중량부, 바람직하게 0.1 중량부를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood)은 목적하는 미생물의 분리 및 배양은 물론 용혈능력과 색소생성을 동시에 관찰함으로써 그람 양성세균의 여러 가지 동정에 유용하게 사용 할 수 있다.
상기 휘발성 지방산은 상술한 휘발성 지방산과 동일하게 빙초산(Glacial acetic acid), 프로피온산(Propionic acid), 뷰티르산(Butyric acid), 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid)으로 구성된다.
상기 휘발성 지방산을 구성하는 성분은 상술한 바와 같이 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 상기 빙초산(Glacial acetic acid)은 50 내지 55 vol%, 바람직하게는 51 내지 54 vol%, 보다 바람직하게는 52 내지 54 vol%, 가장 바람직하게는 53 내지 54 vol%로 포함된다.
또한, 상기 프로피온산(Propionic acid)은 상기 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 18 내지 22 vol%, 바람직하게는 19 내지 21 vol%, 보다 바람직하게는 19.5 내지 20.5 vol%, 가장 바람직하게는 19.8 내지 20.2 vol%로 포함된다.
또한, 상기 뷰티르산(Butyric acid)은 상기 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 상기 뷰티르산(Butyric acid)은 10 내지 15 vol%, 바람직하게는 11 내지 14 vol%, 보다 바람직하게는 12 내지 14 vol%, 가장 바람직하게는 13 내지 14 vol%로 포함된다.
상기 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid) 각각은 상기 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 3 내지 4 vol%, 바람직하게는 3.1 내지 3.8 vol%, 보다 바람직하게는 3.1 내지 3.6 vol%, 가장 바람직하게는 3.2 내지 3.4 vol%로 포함된다.
상기 항생제는 트레포네마 파지데니스 균주 외의 비표적 미생물의 번식을 억제하기 위한 어떠한 항생제도 포함할 수 있으나, 바람직하게는 리팜피신(rifampicin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 또는 리팜피신과 엔로플록사신 모두를 포함한다.
본 발명에 따른 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주의 배양용 배지 조성물 및 이를 이용하여 제조된 배지는 트레포네마 파지데니스 균주만을 비표적 미생물로부터 선택적으로 배양 및 분리할 수 있다.
도 1은 갓 분쇄된 샘플에서 생존한 트레포네마 종을 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(풀 프레임)에서 확인한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비교예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 6일 동안 배양한 후 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(풀 프레임)에서 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 6일 동안 배양한 후 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(자른 프레임)로 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 배양한 후 그 배양물을 본 발명에 따른 FAA 배지상에 접종하고 배양한 후 트레포네마 파지데니스만이 배양 및 분리된 상태를 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(자른 프레임)로 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 배양한 후 그 배양물을 본 발명에 따른 FAA 배지상에 접종하고 배양한 후 트레포네마 파지데니스만이 배양 및 분리된 상태의 플레이트를 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비교예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 6일 동안 배양한 후 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(풀 프레임)에서 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 6일 동안 배양한 후 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(자른 프레임)로 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 배양한 후 그 배양물을 본 발명에 따른 FAA 배지상에 접종하고 배양한 후 트레포네마 파지데니스만이 배양 및 분리된 상태를 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(자른 프레임)로 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 배지 조성물에 소의 족지간 샘플을 접종하고 배양한 후 그 배양물을 본 발명에 따른 FAA 배지상에 접종하고 배양한 후 트레포네마 파지데니스만이 배양 및 분리된 상태의 플레이트를 촬영한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1 및 2: 트레포네마 파지데니스 분리를 위한 배지
하기 표 2와 같은 조성에 따라 트레포네마 파지데니스를 분리하기 위한 경구 트레포네마 배양액(OTEB)을 제조하였다.
| 성분 | 실시예 １ |
| 프로테오스 펩톤 (Proteose peptone) | 5.0 g |
| Heart Infusion Broth | 5.0 g |
| 효모 추출물 (Yeast Extract) | 5.0 g |
| 인산 칼슘(dibasic) (Potassium phosphate) | 2.0 g |
| 염화나트륨 (Sodium chloride) | 5.0 g |
| 황산 마그네슘 (Magnesium sulfate heptahydrate) | 0.2 g |
| 빙초산 (Glacial acetic acid) | 3.2 mL |
| 프로피온산 (Propionic acid) | 1.2 mL |
| 뷰티르산 (Butyric acid) | 0.8 mL |
| 발레르산 (Valeric acid) | 0.2 mL |
| 아이소발레르산 (Isovaleric acid) | 0.2 mL |
| 아이소뷰티르산 (Isobutyric acid) | 0.2 mL |
| 메틸뷰티르산 (Methylbutyric acid) | 0.2 mL |
| 비타민 K1 (1% solution) (Vitamin K1) | 1.0 mL |
| L-시스테인 (25% solution) (L-cysteine solution) | 2.0 mL |
| 소태아혈청 (Fetal bovine serum) | 200 mL |
| 당저장용액(Sugar Stock solution)* | 100 mL |
| 탈이온수 (Deionized water) | 800 mL |
* 당저장용액(Sugar stock solution): 글루코스 8g, 프룩토오스 8g, 수크로스 8g, 말토스 8g, 리보스 8g, 자일로스 8g, 펙틴 8g, 가뇽성 녹말(soluble starch) 8g, 피부르산 나트륨(sodium pyruvate) 8g, 티아민피로인산(thiamine pyrophosphate) 750ug, 및 탈이온수(deionized water) 1000 L
비교예 1 내지 2: 트레포네마 파지데니스 분리를 위한 배지 조성물
하기 표 3과 같은 조성(상기 표 1과 동일한 조성임)에 따라 트레포네마 파지데니스를 분리하기 위한 경구 트레포네마 배양액(OTEB)을 제조하였다. 하기 비교예 1은 종래 문헌(Evans, N. J., J. M. Brown, I. Demirkan, R. D. Murray, W. D. Vink, R. W.Blowey, C. A. Hart, and S. D. Carter. 2008. Three unique groups of spirochetes isolated from digital dermatitis lesions in UK cattle. Veterinary Microbiology. 130:141-150.)에 개시된 배양액이며, 비교예 2는 종래 문헌에 개시된 배양액(비교예 1)에서 휘발성지방산 함량을 2배로 포함하도록 한 배양액이다.
| 성분 | 비교예 1 |
| 프로테오스 펩톤 (Proteose peptone) | 5.0 g |
| Heart Infusion Broth | 5.0 g |
| 효모 추출물 (Yeast Extract) | 5.0 g |
| 인산 칼슘(dibasic) (Potassium phosphate) | 2.0 g |
| 염화나트륨 (Sodium chloride) | 5.0 g |
| 황산 마그네슘 (Magnesium sulfate heptahydrate) | 0.2 g |
| 빙초산 (Glacial acetic acid) | 1.6 mL |
| 프로피온산 (Propionic acid) | 0.6 mL |
| 뷰티르산 (Butyric acid) | 0.4 mL |
| 발레르산 (Valeric acid) | 0.1 mL |
| 아이소발레르산 (Isovaleric acid) | 0.1 mL |
| 아이소뷰티르산 (Isobutyric acid) | 0.1 mL |
| 메틸뷰티르산 (Methylbutyric acid) | 0.1 mL |
| 비타민 K1 (1% solution) (Vitamin K1) | 1.0 mL |
| L-시스테인 (25% solution) (L-cysteine solution) | 2.0 mL |
| 소태아혈청 (Fetal bovine serum) | 100 mL |
| 당저장용액(Sugar Stock solution)* | 100 mL |
| 탈이온수 (Deionized water) | 800 mL |
* 당저장용액(Sugar stock solution): 글루코스 8g, 프룩토오스 8g, 수크로스 8g, 말토스 8g, 리보스 8g, 자일로스 8g, 펙틴 8g, 가뇽성 녹말(soluble starch) 8g, 피부르산 나트륨(sodium pyruvate) 8g, 티아민피로인산(thiamine pyrophosphate) 750ug, 및 탈이온수(deionized water) 1000 L
실험예 1: 트레포네마 파지데니스의 분리
상기 실시예 1 및 비교예 1에 따른 배지 조성물을 포함하는 배지를 이용하여 아래와 같은 방법으로 소 발굽질병을 유발하는 트레포네마 파지데니스 균주를 분리 및 동정하였다.
(1) 샘플 수집
소의 족지간(interdigital space)에서 생검(Biopsy) 샘플을 채취하였다. 구체적으로, 소의 발 표면을 세척한 후, 펀치 생검(Punch biopsy)을 병변의 중심으로부터 채취하고, 멸균 PBS로 꼼꼼히 세척하였다. 그 다음, 상기 채취한 샘플을 코니칼 튜브에 넣고, 샘플이 담긴 코니칼 튜브를 아이스에 담근 상태로 실험실로 옮겼다.
(2) 배양
실험실로 옮긴 생검 샘플을 멸균 식염수 용액으로 꼼꼼히 세척한 후, 생검 샘플의 바깥 부분의 돌기, 즉 소의 털과 같은 이물질을 무균적으로 제거하였다. 상기 돌기가 제거된 조직을 70% 에탄올로 세척한 다음 0.85 % 멸균 식염수로 1차 세척하고 조직에 남은 용액을 닦아내었다. 1차 세척이 끝난 조직을 약 2-3mm3 크기의 작은 조각으로 자르고, 빠르게 70% 에탄올로 세척하였다. 남은 에탄올을 제거하기 위해 0.85 % 멸균 식염수로 세척하고, 조직에 남은 용액은 티슈 페이퍼로 제거하였다. 그 후, 상기 샘플을 혐기성 캐비넷 내부에서 멸균된 막자사발 및 막자를 사용하여 분쇄하고, 실시예 1 및 비교예 1에 따른 각각의 배지 조성물에 항생제(리팜피신(rifampicin) 10μg/ml 및 엔로플록사신(enrofloxacin) 10μg/ml)를 추가하여 접종한 후, 36.5±1℃에서 혐기성 배양하였다. 도 1에 갓 분쇄된 샘플에서 생존한 트레포네마 종을 400x 배율(풀 프레임)에서 암시야 현미경법을 이용하여 관찰한 결과를 나타내었다.
(3) 분리 및 정제
트레포네마에 양성인 상기 (2)의 배양물을 5% 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood), 10% 소태아혈청(FBS), 1% 리팜피신 및 엔로플록사신, 및 0.1% 휘발성지방산(VFA) 용액(표 1의 실시예 1에서 휘발성지방산 성분 함량으로 구성됨)이 보충된 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지 플레이트 상에 접종하여 배양하였다. 플레이트를 Anaerocult®과 함께 혐기성 컨테이너에 넣은 다음, 이를 37℃의 혐기성 챔버 인큐베이터 내부에 넣었다. 박테리아 콜로니가 관찰될 때까지 플레이트를 21일 동안 매일 관찰 하였다. 동일한 보충제를 포함하는 FAA에 후속 접종하여 콜로니를 정제하였다. 그리고 표면에서 성장하는 단리된 콜로니를 실시예 1 및 비교예 1에 따른 배지 조성물에 항생제(항생제(리팜피신(rifampicin) 10μg/ml 및 엔로플록사신(enrofloxacin) 10μg/ml)를 추가된 배양액에 계대 배양하고, 혐기성 캐비닛에서 배양 하였다.
(4) 동정
약 3uL의 배양액을 깨끗한 슬라이드에 떨어뜨려 암시야현미경(dark-field microscopy)으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다.
도 2는 비교예 1의 배양액을 이용하여 배양한 결과로서 트레포네마 파지데니스 이외의 다른 미생물도 함께 배양된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 배양액을 이용하여 배양한 경우 트레포네마 파지데니스만 배양되었음을 알 수 있었다. 또한, 도 4 및 5는 FAA 배지 플레이트 상에 실시예 1의 배양액을 이용하여 배양된 배양물을 접종한 후 5일 후 관찰한 것으로서 트레포네마 파지데니스만이 배양 및 분리되었음을 명확히 확인할 수 있었다.
한편, 상기 실시예 1의 배양액을 이용하여 배양된 트레포네마 파지데니스의 배양물을 FAA 배지 플레이트상에 접종하고 배양한 후 트레포네마 파지데니스를 동정한 결과 종래 알려지지 않은 신규 트레포네마 파지데니스 균주임을 확인하고, 이를 “트레포네마 파지데니스 KS1”으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 3월 24일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 14157BP를 부여받았다.
Claims (9)
- 하기 표 1의 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 함유된 휘발성 지방산(VFA) 함량보다 휘발성 지방산 함량을 1.5 내지 2.5배 더 포함하는 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주의 배양용 배지 조성물.
표 1
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 휘발성 지방산(VFA)은 빙초산 50 내지 55 vol%, 프로피온산 18 내지 22 vol%, 뷰티르산 10 내지 15 vol%, 아이소뷰티르산 3 내지 4 vol%, 발레르산 3 내지 4 vol%, 아이소발레르산 3 내지 4 vol%, 및 메틸뷰틸르산 3 내지 4 vol%로 이루어진 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물의 소태아혈청은 표 1의 경구 트레포네마 농축배양액에 함유된 소태아혈청의 함량보다 1.5 내지 2.5배 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 리팜피신 및 엔로플록사신으로 이루어진 군으로부터 1종 이상인 항생제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제1항, 제3항, 제5항, 또는 제6항 중 어느 한 항에 따른 배지 조성물을 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지에 보충하여 제조된 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) 균주 분리용 배지로서,
상기 FAA 배지는 전체 FAA 배지의 100 중량부를 기준으로 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood) 4 내지 6 중량부, 소태아혈청 8 내지 12 중량부, 항생제 0.8 내지 1.2 중량부, 및 휘발성 지방산(VFA) 0.08 내지 0.12 중량부를 포함하는 트레포네마 파지데니스 균주 분리용 배지.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 상기 FAA 배지의 휘발성 지방산은 빙초산 50 내지 55 vol%, 프로피온산 18 내지 22 vol%, 뷰티르산 10 내지 15 vol%, 아이소뷰티르산 3 내지 4 vol%, 발레르산 3 내지 4 vol%, 아이소발레르산 3 내지 4 vol%, 및 메틸뷰틸르산 3 내지 4 vol%로 이루어진 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스 균주 분리용 배지.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200057545A KR102177181B1 (ko) | 2020-05-14 | 2020-05-14 | 트레포네마 파지데니스 균주의 배양 조성물 및 이의 용도 |
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| KR1020200057545A KR102177181B1 (ko) | 2020-05-14 | 2020-05-14 | 트레포네마 파지데니스 균주의 배양 조성물 및 이의 용도 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102177181B1 (ko) |
Citations (5)
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| JP2002529063A (ja) * | 1998-11-12 | 2002-09-10 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 乳頭腫症指皮膚炎（ｐｄｄ）に対するワクチン |
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-
2020
- 2020-05-14 KR KR1020200057545A patent/KR102177181B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| https://anaerobesystems.com/wp-content/uploads/2018/09/OTEB-Insert-Rev-1-10-18-17.pdf (2018.09.)* * |
| Vet. Microbiol., Vol.130, pp.141-150(2008.07.27.)* * |
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