KR102177180B1 - 신규 트레포네마 파지데니스 균주 및 이의 분리 방법 - Google Patents

신규 트레포네마 파지데니스 균주 및 이의 분리 방법 Download PDF

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조용일
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순천대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 소 발굽질병을 유발하는 신규 미생물 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP) 및 트레포네마 파지데니스를 분리 및 동정하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 소 발굽으로부터 분리한 조직을 에탄올로 세척하고, 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)과 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지를 이용하여 혐기성 배양할 경우, 트레포네마 파지데니스 균주, 특히 신규 미생물인 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP)를 용이하게 분리할 수 있다.

Description

신규 트레포네마 파지데니스 균주 및 이의 분리 방법{Novel Treponema phagedenis and method for isolating the same}
본 발명은 신규 미생물인 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 및 트레포네마 파지데니스의 분리 방법에 관한 것이다.
소는 초식동물로 가축의 하나이다. 소는 사람에게 일찍부터 가축화되면서 소의 경제적 가치가 높아 세계 각지에서 사육되고 있다. 소를 건강하게 사육하기 위해서는 다양한 질병으로부터 소를 보호해야 할 필요가 있다. 소는 사육환경에 의해 소 브루셀라병, 소 호흡기 질병, 소 고창증, 곰팡이성 위장간염, 아스퍼질러스증, 소 장독혈증, 소 콕시듐증, 우결핵, 소 발굽질병(소 발굽피부염 또는 소 우상피부염) 등의 질병에 노출되어 있으며, 최근에는 소 발굽질병에 대한 관심도가 높아지고 있는 추세이다.
소 발굽질병이란 발굽에 질병이 발생한 상태를 말하는 것으로, 발굽각질 및 발꿈치 부위가 썩어 들어가거나, 발굽사이 및 발꿈치 사이에 이상조직이 자라나는 등 소가 절뚝거리는 특징을 보이는 질병이다. 이러한 발굽질병이 나타나는 소는 동물의 복지 감소와 우유 생산 감소, 조기 도태 및 생식 능력 저하에 따른 경제적 영향으로 인해 심각한 문제를 야기한다. 이 질병은 많은 국가에서 풍토병 상태에 도달한 세계 여러 지역에서 보고되었으며, 이 질병으로 인한 심각한 위험성이 이미 보고되고 있지만, 질병의 원인에 대한 이해는 아직까지 명확하지 않다.
상기와 같이 다양한 문제를 야기하는 소 발굽질병은 수많은 박테리아의 감염에 의해 발생하며, 특히 주로 트레포네마(Treponema) 속 균주에 의해 감염되어 나타나는 것으로 알려져 있다. 다양한 트레포네마 속 중에서 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis)는 소 발굽질병을 일으키는 원인균으로서, 건강한 조직의 계면에서의 지속적 생존이 가능하여 질병 발병에 주요 작용제로 간주되고 있다.
트레포네마 파지데니스는 처음에 스피로헤타 파지데니스(Spirocahaeta phagedenis)로 명명되었으며, 침식성(phagedenic) 병변이 있는 여성의 외부 생식기와 독일에서 소 발굽으로부터 분리될 때까지, 트레포네마 파지데니스는 16s rRNA 유전자 서열에 기초한 인간 균주와 유전적으로 관련되어 있다고 보았다. 이러한 트레포네마 파지데니스는 처음 발견된지 100년이 지난 지금도 이 종에 관한 연구가 충분히 이루어지지 않고 있어 다양한 정보가 공개되어 있지 않은 상태이다.
트레포네마 파지데니스에 대한 연구가 충분히 이루어지지 않는 이유 중 하나는 트레포네마의 까다로운 특성으로 인해 혐기성 물질을 시험관 내에서 배양 및 분리하는 것이 매우 어렵기 때문이다. 구체적으로 배양 및 분리가 어려운 이유로는, (i) 트레포네마는 까다로운 성질과 복잡한 영양 및 배양 조건을 가지고 있으며, (ii) 발굽 피부에는 트레포네마 외의 다른 공생 미생물이 존재하고, (iii) 발굽 조직 샘플에는 트레포네마의 성장을 능가하여 빠르게 성장하는 다른 미생물의 영양 성분인 배성물, 토양물질, 배양 배지 등이 포함되어 있으며, 및 (iv) 상기 다른 미생물이 길항제를 생성하여 트레포네마의 성장을 억제할 수 있는 가능성 등이 있기 때문이다.
한편, 배양 조건이 까다로운 트레포네마를 배양하기 위한 배양 시스템에 대한 기술이 선행문헌에 개시되어 있다. 구체적으로, 미국공개특허 제2020-0032201호는 트레포네마 필라듐(T. pallidum)과 같은 트레포네마 종을 시험관 내에서 배양하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 트레포네마 종을 호기성 조건 및 산 염기, 뉴클레오사이드, 코카르복실라제, 코엔자임 A, 플라빈아데닌디뉴클레오티드, NAD, NADP, 나트륨 아세테이트, 나트륨 글루코로 네이트, 지방산 혼합물 및 트윈 80으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지를 이용하여 트레포네마를 배양하고 있다. 그러나, 상기 선행문헌에는 본원발명과 같이 소 발굽으로부터 분리한 신규한 트레포네마 파지데니스 균주에 대한 기재가 없으며, 이를 분리하기 위한 방법 및 조건 또한 본원발명과 차이가 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하고, 소 발굽질병을 유발하는 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1을 분리하고, 이를 분리하기 위한 방법을 확립하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 소 발굽으로부터 분리한 조직을 에탄올로 세척하고, 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)과 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지를 이용하여 혐기성 배양할 경우, 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1를 정확하고 용이하게 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
미국 특허공개 2020-0032201 A1 (2020.01.30. 공개)
따라서, 본 발명의 주된 목적은 소 발굽질병을 유발하는 신규 미생물 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미생물 트레포네마 파지데니스를 분리 및 동정하기 위한 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 신규 미생물인 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1를 제공한다.
트레포네마 파지데니스는 소 발굽질병을 일으키는 원인균으로서, 건강한 조직의 계면에서의 지속적 생존이 가능하여 질병 발병에 주요 작용제로 간주되고 있으나, 트레포네마의 까다로운 성질 및 배양 조건으로 인해 소 발굽질병을 유발하는 트레포네마 파지데니스를 분리 및 동정하기 어려워 이에 대한 연구가 이루어지지 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 분리 및 동정이 까다로운 트레포네마 파지데니스를 분리하기 위하여 다양한 배양 조건을 확립함으로써 소 발굽으로부터 소 발굽질병을 유발하는 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP)를 분리하였다.
본 발명자들은 소 발굽으로부터 분리한 다양한 트레포네마 파지데니스 종들의 염기서열을 분석하여 신규 균주를 선별하였다. 또한, 상기 선별된 균주를 신규 미생물로서 “트레포네마 파지데니스 KS1”으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 3월 24일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 14157BP를 부여받았다.
본 발명의 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP)는 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP)는 소 발굽에서 유래된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 소 발굽으로부터 채취한 조직을 멸균 식염수로 세척하는 단계, (b) 상기 (a) 단계의 조직의 이물질을 제거하는 단계, (c) 상기 (b) 단계의 조직을 분쇄한 후, 휘발성지방산(VFA) 용액을 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에서 혐기성 배양하는 단계, 및 (d) 상기 배양 후, 트레포네마 농축배양액 배양물을 휘발성지방산 용액을 포함하는 고체배지에 접종한 후, 혐기성 배양을 통해 수득된 콜로니를 정제하여 트레포네마 파지데니스 균주를 분리하는 단계를 포함하는 트레포네마 파지데니스 균주의 분리 방법을 제공한다.
트레포네마의 까다로운 성질과 복잡한 영양 및 배양 조건에 의해 소 발굽으로부터 소 발굽질병을 유발하는 트레포네마 속만을 분리 및 동정하는 것은 매우 어렵다. 본 발명자들은 트레포네마 파지데니스를 분리하기 위하여 다양한 배양 조건을 연구한 결과, 소 발굽으로부터 분리한 조직의 세척 용매 및 배양 배지의 조성을 조정 및 변경할 경우, 트레포네마 파지데니스 균주를 정확하고 용이하게 분리 및 동정할 수 있음을 확인하고, 구체적인 분리 방법을 확립하였다.
하나의 구체적 예로서, 상기 트레포네마 파지데니스 균주는 상술한 신규 미생물인 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP)일 수 있다.
소 발굽으로부터 채취한 조직을 배양하기 전, 조직을 실험실로 운반하는 단계의 운반배지는 조직 내의 트레포네마 종의 생존률을 높이기 위한 중요한 요소 중 하나이다. 종래에는 소 발굽으로부터 채취한 조직을 실험실로 옮기기 위한 운반배지로서 항생제에 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)를 이용하였다. 그러나, 일반적으로 소 발굽에는 트레포네마 종 외의 비표적 미생물들이 존재한다. 이러한 비표적 미생물들은 항생제에 대한 내성이 강하고, 오히려 운반배지인 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)을 영양분으로 이용하기 때문에 상기와 같은 운반배지는 비표적 미생물들의 번식을 오히려 촉진시키는 역할을 한다. 또한, 상기 번식한 비표적 미생물들의 번식은 트레포네마 성장을 억제시키는 화합물을 생성하게 되고, 결론적으로 조직 내의 트레포네마 종의 생존율이 낮아지게 된다. 따라서, 본 발명에서는 비표적 미생물들의 번식을 막기 위하여 어떠한 운반배지도 이용하지 않고 조직을 실험실로 옮겼으며, 조직의 부패를 막기 위해 단지 얼음에 간접적으로 담근 상태를 유지하도록 하였다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 조직의 이물질을 제거하는 단계는, (b-1) 조직의 표면에 존재하는 돌기를 제거하는 단계, (b-2) 상기 돌기가 제거된 조직을 에탄올 및 식염수로 차례로 세척하는 제1 세척 단계, (b-3) 상기 세척한 조직을 자른 후, 에탄올 및 식염수로 차례로 세척하는 제2 세척 단계, 및 (b-4) 상기 (b-3)의 조직에 남은 용액을 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 (b-4)에서 조직에 남은 용액을 제 거하는 단계는 조직을 세척한 후 조직의 표면에 남아있는 용액을 제거하기 위한 단계로서, 조직의 표면에 용액을 제거하기 위해서는 티슈 페이퍼를 이용하여 용액을 닦아내는 것이 바람직하다.
소 발굽으로부터 채취한 조직에는 비표적 미생물을 번식시킬 수 있는 다양한 배설물, 먼저, 사료 등의 물질이 부착되어 있으므로, 이러한 물질을 조직으로부터 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 먼저 이물질이 가장 많이 부착되어 있는 조직 표면의 털과 같은 돌기들을 제거하고, 에탄올을 이용하여 조직 내의 비표적 미생물을 사멸시킨 다음, 멸균 식염수 용액을 이용하여 사멸한 미생물 및 남은 에탄올을 세척함으로써 조직의 비표적 미생물의 번식을 억제하였다. 상기 에탄올 및 멸균 식염수를 이용한 세척은 2회 내지 5회로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 2회로 진행하는 것이 바람직하다. 세척 횟수를 5회 이상 실시할 경우, 조직에 존재하는 트레포네마 또한 사멸될 가능성이 있으므로, 세척 회수는 5회를 초과하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)는 하기 표 1의 성분으로 구성된 종래 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)의 휘발성지방산 함량에 비하여 1.5 내지 2.5배, 바람직하게는 1.8 내지 2.2배, 보다 바람직하게는 1.9 내지 2.1배, 가장 바람직하게는 2배 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 배지 조성물에 휘발성 지방산이 1.5배 미만으로 포함될 경우 트레포네마 파지데니스 균주 외의 비표적 미생물의 번식이 일어나 오히려 트레포네마 파지데니스 균주의 성장을 억제하게 되므로 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 분리하기 어려우며, 휘발성 지방산이 2.5배 초과하여 포함될 경우 트레포네마 파지데니스 균주의 성장이 지연되어 트레포네마 파지데니스 균주만을 선택적으로 분리하기 어려운 문제가 있다.
성분 함량
프로테오스 펩톤 (Proteose peptone) 5.0 g
Heart Infusion Broth 5.0 g
효모 추출물 (Yeast Extract) 5.0 g
인산 칼슘(dibasic) (Potassium phosphate) 2.0 g
염화나트륨 (Sodium chloride) 5.0 g
황산 마그네슘 (Magnesium sulfate heptahydrate) 0.2 g
휘발성 지방산 (Volatile fatty acid) 3 mL
비타민 K1 (1% solution) (Vitamin K1) 1.0 mL
L-시스테인 (25% solution) (L-cysteine solution) 2.0 mL
소태아혈성 (Fetal bovine serum) 100 mL
당저장용액(Sugar Stock solution) 100 mL
탈이온수 (Deionized water) 800 mL
상기 표 1의 당저장용액(Sugar stock solution)은 글루코스 8g, 프룩토오스 8g, 수크로스 8g, 말토스 8g, 리보스 8g, 자일로스 8g, 펙틴 8g, 가뇽성 녹말(soluble starch) 8g, 피부르산 나트륨(sodium pyruvate) 8g, 티아민피로인산(thiamine pyrophosphate) 750ug, 및 탈이온수(deionized water) 1000 L로 이루어진 용액이다.
상기 휘발성지방산(VFA) 용액은 트레포네마의 성장을 촉진시키기 위한 어떠한 휘발성 지방산도 포함될 수 있으나, 빙초산(Glacial acetic acid), 프로피온산(Propionic acid), 뷰티르산(Butyric acid), 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid)으로 구성된 휘발성지방산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 휘발성지방산(VFA)을 구성하는 빙초산은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 50 내지 55 vol%, 바람직하게는 51 내지 54 vol%, 보다 바람직하게는 52 내지 54 vol%, 가장 바람직하게는 53 내지 54 vol%로 포함된다. 상기 프로피온산(Propionic acid)은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 18 내지 22 vol%, 바람직하게는 19 내지 21 vol%, 보다 바람직하게는 19.5 내지 20.5 vol%, 가장 바람직하게는 19.8 내지 20.2 vol%로 포함된다. 상기 뷰티르산(Butyric acid)은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 10 내지 15 vol%, 바람직하게는 11 내지 14 vol%, 보다 바람직하게는 12 내지 14 vol%, 가장 바람직하게는 13 내지 14 vol%로 포함된다. 상기 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid) 각각은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 3 내지 4 vol%, 바람직하게는 3.1 내지 3.8 vol%, 보다 바람직하게는 3.1 내지 3.6 vol%, 가장 바람직하게는 3.2 내지 3.4 vol%로 포함된다.
본 발명의 분리 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 OTEB 배양액은 소태아 혈청(fetal bovine serum) 및 항생제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 소태아혈청(FBS)은 상기 표 1의 조성으로 구성된 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 함유된 소태아혈청 함량의 1.5 내지 2.5배, 바람직하게는 1.8 내지 2.2배, 보다 바람직하게는 1.9 내지 2.1배, 가장 바람직하게는 2배 더 포함할 수 있다. 상기 소태아혈청을 1.5 내지 2.5배 더 포함하는 경우 표 1의 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에 비하여 트레포네마 파지데니스 균주를 선택적으로 분리하는데 더 효율적이다. 상기 추가로 포함된 소태아혈청의 함량이 1.5배 미만인 경우 트레포네마 파지데니스 균주를 배양 및 분리하는데 비효율적이며, 2.5배 초과인 경우 함량 대비 트레포네마 파지데니스 균주의 배양 및 분리가 효율적이지 않다.
상기 항생제는 비표적 미생물의 번식을 억제하기 위한 어떠한 항생제도 포함할 수 있으나, 바람직하게는 리팜피신(rifampicin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 또는 리팜피신과 엔로플록사신 모두를 포함한다. 상기 항생제는 본 발명의 배지 조성물의 1ml 함량을 기준으로 18 내지 22ug, 바람직하게는 19 내지 21ug, 보다 바람직하게는 20ug으로 사용한다. 상기 항생제 함량이 18ug 미만인 경우 트레포네마 외의 비표적 미생물의 번식 증가로 인하여 트레포네마의 생존율이 낮아질 수 있으며, 22ug 초과인 경우 트레포네마의 사멸로 인하여 트레포네마의 생존율이 낮아질 수 있다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 (d) 단계의 휘발성지방산(VFA)을 포함하는 고체배지는 휘발성지방산을 고체배지의 100 중량부를 기준으로 0.08 내지 0.12 중량부, 바람직하게 0.1 중량부를 포함한다.
상기 휘발성지방산(VFA) 용액은 트레포네마의 성장을 촉진시키기 위한 어떠한 휘발성 지방산도 포함될 수 있으나, 빙초산(Glacial acetic acid), 프로피온산(Propionic acid), 뷰티르산(Butyric acid), 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid)으로 구성된 휘발성지방산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 휘발성지방산(VFA)을 구성하는 빙초산은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 50 내지 55 vol%, 바람직하게는 51 내지 54 vol%, 보다 바람직하게는 52 내지 54 vol%, 가장 바람직하게는 53 내지 54 vol%로 포함된다. 상기 프로피온산(Propionic acid)은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 18 내지 22 vol%, 바람직하게는 19 내지 21 vol%, 보다 바람직하게는 19.5 내지 20.5 vol%, 가장 바람직하게는 19.8 내지 20.2 vol%로 포함된다. 상기 뷰티르산(Butyric acid)은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 10 내지 15 vol%, 바람직하게는 11 내지 14 vol%, 보다 바람직하게는 12 내지 14 vol%, 가장 바람직하게는 13 내지 14 vol%로 포함된다. 상기 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid) 각각은 휘발성 지방산(VFA)의 전체 부피를 기준으로 3 내지 4 vol%, 바람직하게는 3.1 내지 3.8 vol%, 보다 바람직하게는 3.1 내지 3.6 vol%, 가장 바람직하게는 3.2 내지 3.4 vol%로 포함된다.
상기 고체배지는 바람직하게 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지이다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 (d) 단계의 고체배지는 휘발성지방산 이외에 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood), 소태아혈청, 및 항생제를 더 포함할 수 있다.
상기 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood)은 고체배지의 100중량부를 기준으로 4 내지 6 중량부, 바람직하게는 6 중량부이며, 상기 소태아혈청은 고체배지의 100중량부를 기준으로 8 내지 12 중량부, 바람직하게는 10 중량부이며, 상기 항생제는 고체배지의 100중량부를 기준으로 0.8 내지 1.2 중량부, 바람직하게는 1 중량부로 포함한다.
상기 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood)은 목적하는 미생물의 분리 및 배양은 물론 용혈능력과 색소생성을 동시에 관찰함으로써 그람 양성세균의 여러 가지 동정에 유용하게 사용 할 수 있으며, 상기 항생제는 전술한 항생제와 동일하다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 상술한 분리방법에 따라 트레포네마 종을 분리할 경우, 스피로헤타 형태의 트레포네마 종만 생존하는데 반해 종래의 분리방법에 트레포네마를 분리할 경우, 스피로헤타가 아닌 다른 비표적 미생물까지 생존한 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 트레포네마의 분리 방법은 조직 표면에 존재하는 트레포네마 종 이외의 비표적 미생물의 번식을 막음으로써 트레포네마 종만을 효율적으로 분리할 수 있음을 시사한다(실험예 1, 도 1 내지 4 참조).
본 발명에 따른 트레포네마의 분리방법은 소 발굽으로부터 소 발굽질병을 유발하는 트레포네마 파지데니스를 효율적으로 분리할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 방법을 통해 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP)를 분리 및 동정하였다.
도 1은 갓 분쇄된 샘플에서 생존한 트레포네마 종을 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(풀 프레임)에서 확인한 도면이다.
도 2는 종래의 방법을 이용하여 OTEB에서 6일 동안 배양된 스피로헤타가 아닌 박테리아를, 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(풀 프레임)에서 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 OTEB에서 6일 동안 배양된 배양액을, 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(풀 프레임)에서 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 방법을 이용하여 분리된 트레포네마 종을 암시야 현미경법을 이용하여 400x 배율(자른 프레임)로 확인한 도면이다.
도 5 및 도 6은 5일 OTEB 접종원을 FAA 혈액 한천 플레이트 표면에 7일 획선 도말한 플레이트를 나타내는 도면이다.
도 7은 기존 연구에서의 방법과 조정된 방법에서의 OTEB 및 FAA의 항생제 농도를 나타내는 도면이다.
도 8은 트레포네마 파지데니스 KS1의 계통도이다.
도 9는 트레포네마 파지데니스 KS1의 형태학적 특성을 확인한 FAA 배지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예: 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1의 분리 및 동정
아래와 같은 방법으로 소 발굽질병을 유발하는 신규 미생물 트레포네마 파지데니스 KS1을 분리 및 동정하였다.
(1) 샘플 수집
소의 족지간(interdigital space)에서 생검(Biopsy) 샘플을 채취하였다. 구체적으로, 소의 발 표면을 세척한 후, 펀치 생검(Punch biopsy)을 병변의 중심으로부터 채취하고, 멸균 PBS로 꼼꼼히 세척하였다. 그 다음, 상기 채취한 샘플을 코니칼 튜브에 넣고, 샘플이 담긴 코니칼 튜브를 아이스에 담근 상태로 실험실로 옮겼다.
(2) 배양
실험실로 옮긴 생검 샘플을 멸균 식염수 용액으로 꼼꼼히 세척한 후, 생검 샘플의 바깥 부분의 돌기, 즉 소의 털과 같은 이물질을 무균적으로 제거하였다. 상기 돌기가 제거된 조직을 70% 에탄올로 세척한 다음 0.85 % 멸균 식염수로 1차 세척 하고 조직에 남은 용액을 닦아내었다. 1차 세척이 끝난 조직을 약 2-3mm3 크기의 작은 조각으로 자르고, 빠르게 70% 에탄올로 세척하였다. 남은 에탄올을 제거하기 위해 0.85 % 멸균 식염수로 세척하고, 조직에 남은 용액은 티슈 페이퍼로 제거하였다. 그 후, 상기 샘플을 혐기성 캐비넷 내부에서 멸균된 막자사발 및 막자를 사용하여 분쇄하고, 1mL 소태아 혈청(FBS), 항생제(리팜피신(rifampicin) 10μg/ml 및 엔로플록사신(enrofloxacin) 10μg/ml) 및 5μL 휘발성지방산(VFA) 용액이 보충된 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB; 미국 캘리포니아 주의 Anaerobe Systems 제품) 튜브(7mL)에 접종한 후, 36.5±1℃에서 혐기성 배양 하였다.
상기 휘발성지방산은 경구 트레포네마 농축배양액에 일정량이 포함되어 있으나, 본 발명에서는 추가적으로 더 포함하였다. 휘발성지방산의 구체적인 성분 및 추가 함량은 하기 표 2와 같다.
휘발성 지방산 OTEB에 기본적으로
포함된 함량 		실시예에서 추가적으로
보충한 함량
빙초산
(Glacial acetic acid)		 1.60 mL 1.6 mL
프로피온산
(Propionic acid)		 0.60 mL 0.6 mL
뷰티르산
(Butyric acid)		 0.40 mL 0.4 mL
발레르산
(Valeric acid)		 0.10 mL 0.1 mL
아이소발레르산
(Isovaleric acid)		 0.10 mL 0.1 mL
아이소뷰티르산
(Isobutyric acid)		 0.10 mL 0.1 mL
메틸뷰티르산
(Methylbutyric acid)		 0.10 mL 0.1 mL
(3) 분리 및 정제
상기 배양한 OTEB 배양물을 5% 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood), 10% 소태아혈청(FBS), 1% 리팜피신, 1% 엔로플록사신 및 0.1% 휘발성지방산(VFA) 용액(상기 표 1에서 추가적으로 보충한 함량과 동일)이 보충된 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지 플레이트 상에 접종하여 배양하였다. 플레이트를 Anaerocult®과 함께 혐기성 컨테이너에 넣은 다음, 이를 37 ℃의 혐기성 챔버 인큐베이터 내부에 넣었다. 박테리아 콜로니가 관찰될 때까지 플레이트를 21일 동안 매일 관찰 하였다. 동일한 보충제를 포함하는 FAA에 후속 접종하여 콜로니를 정제 하여 분리하였다.
그리고 추가 실험을 위해 표면에서 성장하는 단리된 콜로니를 동일한 보충제로 새로운 OTEB로 계대 배양하고, 혐기성 캐비닛에서 배양 하였다.
(4) 동정
약 3uL의 배양액을 깨끗한 슬라이드에 떨어뜨려 암시야현미경(dark-field microscopy)으로 관찰하였다. 순수한 샘플은 분자 식별에 이용하였다.
16s rRNA 유전자 및 플라젤린(FlaB2) 프라이머의 PCR 증폭 대상 DNA 추출을 위해 박테리아 현탁액 200uL(고정 성장기 동안의 현탁액)을 수득하였다. BLAST를 사용하여 서열을 확인하고 다른 트레포네마 종으로 계통 발생 분석을 수행하였다.
비교예: 박테리아의 동정
아래와 같은 종래의 방법으로 소 발굽질병에 존재하는 박테리아를 분리 및 동정하였다.
(1) 샘플 수집
소의 족지간(interdigital space)에서 생검(Biopsy) 샘플을 채취하였다. 구체적으로, 소의 발 표면을 세척한 후, 펀치 생검(Punch biopsy)을 병변의 중심으로부터 채취하고, 멸균 PBS로 꼼꼼히 세척하였다. 그 다음, 리팜피신(rifampicin)(5μg/ml) 및 엔로플록사신(enrofloxacin)(5μg/ml)을 포함하는 경구 트레포네마(treponeme) 농축배양액(OTEB: Anaerobe Systems, CA, Morgan Hill, USA)에 넣고 실험실로 옮긴다.
(2) 배양
실험실로 옮긴 생검 샘플을 멸균 식염수 용액(0.9 %)으로 꼼꼼히 세척 하였다. 그 다음, 샘플을 혐기성 캐비닛(85% N2, 10% H2 및 5% CO2, 36℃)으로 옮기고 약 1 mm3의 작은 조각으로 절단하였다. 절단한 조각을 리팜피신(rifampicin)(5μg/ml) 및 엔로플록사신(enrofloxacin)(5μg/ml)을 포함하고, 10% 소태아혈청(FCS)이 보충된 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB; 미국 캘리포니아 주의 Anaerobe Systems 제품)에 접종하고 24시간 동안 배양(incubation)하였다. 상기 배양 후, OTEB에 존재하는 박테리아 현탁액의 한 집락(a loopful)을 5% 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood), 10% FCS, 리팜피신(rifampicin)(5μg/ml) 및 엔로플록사신(enrofloxacin)(5μg/ml)가 보충된 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지 플레이트에 획선도말(streaking)하고, 14일 동안 혐기성 배양(incubation)하였다. 표면에서 자란 분리된 콜로니를 동일한 보충제를 사용하여 새로운 FAA 배지 플레이트에 계대 배양하고, 혐기성 캐비닛에서 배양(incubation)하였다.
(3) 동정
16s rRNA 유전자 및 트레포네마(Treponema) 일반 프라이머의 PCR 증폭 대상 DNA를 추출하기 위하여 박테리아의 한 집락(a loopful)를 수득하였다. BLAST를 사용하여 서열을 확인하였다.
실험예 1: 트레포네마 검출 및 확인
트레포네마(Treponema)를 확인 및 검출하기 위하여 샘플을 1mL 멸균 식염수로 세척한 막자사발 및 막자에 넣어 분쇄하였으며, 살아있는 트레포네마의 운동성은 암시야현미경법을 이용하여 확인하였다.
좀 더 구체적으로, 혐기적으로 수득된 실시예 및 비교예의 OTEB 중의 박테리아 현탁액 3uL 각각을 14일 동안 24 시간마다 암시야현미경으로 관찰 하였다. 또한, 스피로헤타(Spirochaetes)가 관찰된 배양액은 스피로헤타가 고정 성장기에 도달할 때까지 관찰하였으며, 그 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다.
그 결과 도 1 내지 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 분리방법에 따라 트레포네마 종을 분리할 경우, 스피로헤타 형태의 트레포네마 종만 생존하는데 반해 종래의 분리방법에 트레포네마를 분리할 경우, 스피로헤타가 아닌 다른 비표적 미생물까지 생존한 것을 확인하였다.
실험예 2: 트레포네마의 염기서열 분석
트레포네마 파지데니스의 염기서열 분석은 16s rRNA 핵산 염기서열 분석 방법을 통해 수행하였다.
구체적으로, 실시예 및 비교예에서 배양을 통해 수득한 배양물을 샘플로 이용하였으며, 분자 식별은 범용 프라이머 27F 및 1492R을 사용하여 16s rRNA 유전자의 전체 서열 길이의 증폭에 의해 수행하여 ~1500bp의 앰플리콘을 생성하였다. PCR은 10uL의 PCR 중합 효소 프리믹스, 양쪽 프라이머 1uL, 컬럼 기반 추출 키트 또는 열변성법을 이용하여 추출한 DAN 주형 및 멸균된 증류수 7uL를 포함하는 20uL 부피를 같는 반응물을 이용하여 어닐링 온도는 55℃에서 시행하였다.
상기 방법으로부터 수득한 트레포네마 파지데니스 KS1의 핵산 염기서열(서열번호 1, 표 3)을 이용하여 계통수를 만들고 트레포네마 파지데니스 KS1 균주의 위치를 확인하였다(도 8).
서열번호 1 (트레포네마 파지데니스 KS1의 핵산 염기 서열)
CTTTTCACCTCTGCACATACCTTCGGCACCGCCCTCCCTTAACGGGTTAGACTGGCGACTTCGGGTACCCTCAACTCGGATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCACCGTGCTGATGTGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGAAGTCGAGTTTCAGACTTCAATCCGAACTACGATTGCTTTTTTGCGATTTGCTTAACCTCACAGTCTCGCTTCACTTTGTAGCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGACATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGATTTGTCATCGGCAGTTCCGCCAGAGTCCTCAGCGTTACCTGTTAGCAACTGACAGTAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACACCTCACGGCACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCAAAAGCCGTATTGCTACGCTACCATATCTCTATAATATTGCTTTTGATGTCAAACCCAGGTAAGATTCCTCGCGTATCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACCCTTGCGGGCATACTCCCCAGGCGGTACACTTATTGCGTTTGCGCCGGCACTGAAGCTCTTGCCCCAACACCTAGTGTACATCGTTTACTGTGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACACCTTCGCACCTCAGCGTCAATCATCGGCCAGAAACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCTTCCAAATATCTACAGATTCCACCCCTACACTTGGAATTCCGGTTTCCCCTCCGTGATTCAAGACTGGCAGTACCCAATGCAATTCTCAAGTTAAGCTTGAGTATTTCACATCAGGCTTACCAACCCGCCTGCGTGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGAACAACGCTCGCCCCTTACGTGTTACCGCGGCTGCTGGCACGTAATTAGCCGGGGCTTATTCGCTCGACTACCGTCATCAAGGACGCATTCCCTCATCCTCTTATTCTTCATCGGCAAAAGAACTTTACAACCTTTCGGCCTTCTTCGTCCACGCGGCGTCGCTCCGTCAGACTTCCGTCCATTGCGGAATATTCTTAGCTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGTCCGTCCACCCTCTCAGGCCGGATACCCATCGTCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTCACCAACAAGCATAATGGGACGCGGGCTCATCCTCAAGCAAGGCCGTAGCCTCCTTTCCTTATACGGCTTTATCCGTATAAGCGTATTCGGTATTACCTCCTATTTCTAGGAGCTATCCCCATCTTAAGGGCAGATCACCCACGCGTTACTCACCAGTCCGCCACTCTAGGGGAGGAAGCAAGCTCCTCCCTTGCCGTTCGACTGCATGCTAAGACGCGCCGCCCTCCAG
실험예　3: 트레포네마 파지데니스 KS1의 특성 확인
트레포네마 파지데니스 KS1의 특성을 다양한 측면에서 확인하였다.
OTEB에서의 성장 특성은 OTEB 튜브의 바닥에 백색 응고를 형성하고, FAA의 표면에는 1-2.5mm 백색의 불투명성을 나타내었다. 또한, 한천 표면 아래로 약간 확산되서 14일의 배양 후에 관찰되는 콜로니는 불규칙적인 형태로서 불투명하고 직경이 0.5 내지 2.5mm이며 b-용혈 활성을 나타내었다(도 9).
암시야 현미경법 하에서 운동성을 관찰한 결과, 스피로헤타(spirochete)이고, 나선형 운동으로 움직인다. 세포의 양쪽 말단의 나선형 영역은 나선형으로, 서로 나선형으로 움직일 수 있다. 셀의 길이는 9 내지 12um이고, 두께는 0.2 내지 0.25um이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION OF SUNCHON NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel Treponema phagedenis KS1 and separation thereof <130> PA-20-0107 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1466 <212> DNA <213> Treponema phagedenis <220> <221> gene <222> (1)..(1466) <223> 16s rDNA <400> 1 cttttcacct ctgcacatac cttcggcacc gccctccctt aacgggttag actggcgact 60 tcgggtaccc tcaactcgga tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt 120 caccgcaccg tgctgatgtg cgattactag cgattccaac ttcatgaagt cgagtttcag 180 acttcaatcc gaactacgat tgcttttttg cgatttgctt aacctcacag tctcgcttca 240 ctttgtagca accattgtag cacgtgtgta gccctggaca taagggccat gatgacttga 300 cgtcatcccc accttcctcc gatttgtcat cggcagttcc gccagagtcc tcagcgttac 360 ctgttagcaa ctgacagtag gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa cacctcacgg 420 cacgagctga cgacagccat gcagcacctg tcaaaagccg tattgctacg ctaccatatc 480 tctataatat tgcttttgat gtcaaaccca ggtaagattc ctcgcgtatc atcgaattaa 540 accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc acccttgcgg 600 gcatactccc caggcggtac acttattgcg tttgcgccgg cactgaagct cttgccccaa 660 cacctagtgt acatcgttta ctgtgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc 720 acaccttcgc acctcagcgt caatcatcgg ccagaaaccc gccttcgcca ccggtgttct 780 tccaaatatc tacagattcc acccctacac ttggaattcc ggtttcccct ccgtgattca 840 agactggcag tacccaatgc aattctcaag ttaagcttga gtatttcaca tcaggcttac 900 caacccgcct gcgtgccctt tacgcccaat aattccgaac aacgctcgcc ccttacgtgt 960 taccgcggct gctggcacgt aattagccgg ggcttattcg ctcgactacc gtcatcaagg 1020 acgcattccc tcatcctctt attcttcatc ggcaaaagaa ctttacaacc tttcggcctt 1080 cttcgtccac gcggcgtcgc tccgtcagac ttccgtccat tgcggaatat tcttagctgc 1140 tgcctcccgt aggagtttgg gccgtatctc agtcccaatg tgtccgtcca ccctctcagg 1200 ccggataccc atcgtcgcct tggtaagccg ttacctcacc aacaagcata atgggacgcg 1260 ggctcatcct caagcaaggc cgtagcctcc tttccttata cggctttatc cgtataagcg 1320 tattcggtat tacctcctat ttctaggagc tatccccatc ttaagggcag atcacccacg 1380 cgttactcac cagtccgcca ctctagggga ggaagcaagc tcctcccttg ccgttcgact 1440 gcatgctaag acgcgccgcc ctccag 1466

Claims (10)

  1. 신규 미생물인 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 소 발굽에서 유래된 것인 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP).
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP).
  4. (a) 소 발굽으로부터 채취한 조직을 멸균 식염수로 세척하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 조직의 이물질을 제거하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 조직을 분쇄한 후, 휘발성지방산을 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)에서 혐기성 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 배양 후, 트레포네마 농축배양액 배양물을 휘발성지방산 용액을 포함하는 고체배지에 접종한 후, 혐기성 배양을 통해 수득된 콜로니를 정제하여 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP) 균주를 분리하는 단계로,
    상기 (c) 단계의 휘발성지방산을 포함하는 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)은 하기 표 1의 경구 트레포네마 농축배양액에 함유된 휘발성지방산 함량에 비하여 1.5 내지 2.5배 더 포함하는 것을 특징으로 하며,
    상기 (d) 단계의 휘발성지방산 용액을 포함하는 고체배지는 휘발성지방산을 고체배지의 100 중량부를 기준으로 0.08 내지 0.12중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스(Treponema phagedenis) KS1 (KCTC 14157BP) 분리 방법.
    [표 1]
    Figure 112020097493615-pat00010
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 조직의 이물질을 제거하는 단계는,
    (b-1) 조직의 표면에 존재하는 돌기를 제거하는 단계;
    (b-2) 상기 돌기가 제거된 조직을 에탄올 및 식염수로 차례로 세척하는 제1 세척 단계;
    (b-3) 상기 세척한 조직을 자른 후, 에탄올 및 식염수로 차례로 세척하는 제2 세척 단계; 및
    (b-4) 상기 (b-3)의 조직에 남은 용액을 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP) 분리 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 (c) 및 (d) 단계의 휘발성 지방산(VFA)은 빙초산(Glacial acetic acid), 프로피온산(Propionic acid), 뷰티르산(Butyric acid), 아이소뷰티르산(Isobutyric acid), 발레르산(Valeric acid), 아이소발레르산(Isovaleric acid) 및 메틸뷰틸르산(Methylbutyric acid)으로 구성된 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP) 분리 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 (c) 단계의 경구 트레포네마 농축배양액(OTEB)은 소태아 혈청(fetal bovine serum) 및 항생제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP) 분리 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 (d) 단계의 고체배지는 탈섬유 면양 혈액(defibrinated sheep blood), 소태아혈청, 및 항생제를 포함하는 FAA(fastidious anaerobe agar) 배지인 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP) 분리 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항생제는 리팜피신(rifampicin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 또는 리팜피신과 엔로플록사신 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 트레포네마 파지데니스 KS1 (KCTC 14157BP) 분리 방법.
  10. 삭제
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