CN114717133B - 一株具有增强骨健康作用的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株具有增强骨健康作用的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一株枯草芽孢杆菌及其应用，所提供的枯草芽孢杆菌筛的保藏编号为CCTCC NO：M2021684。本发明所提供的枯草芽孢杆菌能显著增强骨密度，增加骨小梁的数量和厚度，改善骨健康水平，有效预防因衰老而造成的骨质疏松症等现象。所述枯草芽孢杆菌VHProbi P08可添加在大多数种类的宠物食品中，制备成有增强骨健康作用的功能性食品。该菌株发酵条件简单、产业化成本低、市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有增强骨健康作用的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
益生菌(probiotics)一词起源于希腊语，随着人们认识的深入，调节肠道菌群、内源微生物、活的微生物、活菌数量等关键词也融入到益生菌的概念中。目前，被广泛接受的是联合国粮农组织/世界卫生组织的定义，即施以足够的数量，对宿主起到有益作用的活性微生物。
肠道内环境的变化——尤其是肠道菌群的紊乱，最终会导致我们肠道屏障的损伤，增加肠道屏障的通透性，造成周身性的炎症。这些周身性炎症最终作用到像胰岛、中枢神经这些部位，导致相应的代谢性疾病和精神类疾病。益生菌自身的代谢产物，如短链脂肪酸、胞外多糖、细菌素、色氨酸和色氨酸代谢物、肌苷以及共轭亚油酸等，以及益生菌对肠道菌群调节作用，会增强肠道屏障功能，降低肠道屏障的通透性，降低周身性的炎症。周身性炎症的降低，使得人在代谢系统、免疫系统以及神经系统上发生相应疾病的几率大大降低。例如，益生菌缓解Ⅱ型糖尿病可能的机制是——益生菌能够改善肠道菌群结构，降低肠道通透性，降低循环内毒素以及降低周身性炎症，从而最终改善胰岛素抵抗。同时另一方面，益生菌促进了乙酸盐以及丁酸酯的产生，这两种最常见的短链脂肪酸能够与相应的受体结合，并诱导下游的GLP-1以及PYY分泌，通过对胰腺功能以及胰岛素释放的影响，最终降低血糖。
Li等人抑制无菌小鼠雌激素分泌后发现无菌小鼠不会患骨质疏松，表明肠道菌群与绝经后骨质疏松症存在关联。另外Ohlsson等人发现使用副干酪乳杆菌灌胃卵巢切除小鼠，能够提高小鼠的骨密度。Jafarnejad S等人研究发现服用益生菌复配混合物能改善绝经妇女的骨代谢水平。在一项人群试验中，Tsukamoto Y等人发现健康人群食用经枯草芽孢杆菌发酵的纳豆制品能够降低血液中血清羧化不全骨钙素水平，减少骨质疏松症发病风险。
骨质疏松症是一种与身体衰老相关的常见疾病，采用药物治疗骨质疏松症存在效果不佳、依从性差或副作用明显等问题。目前公开的益生菌或者是纯厌氧菌，工业生产成本高，或是复配菌株作用机制不明确，并不能满足预防宠物骨骼疾病增强骨骼健康的作用。因此筛选优质的益生菌资源，尤其是芽孢杆菌资源用于宠物保健食品，仍然是本领域的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。所提供的枯草芽孢杆菌筛选自酸白菜样品，具有较强的抗氧化能力和降解胆固醇能力，还能有效缓解骨流失，增强骨密度，预防骨质疏松，效果非常显著。
本发明一方面提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌VHProbi P08(Bacillus subtilis VHProbi P08)，已于2021年6月7日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021684。
所提供的枯草芽孢杆菌，其Riboprinter指纹图谱如图1所示；RAPD指纹图如图2所示，rep-PCR指纹图如图3所示；
所提供的枯草芽孢杆菌，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌用于制备增强骨健康的制品；
本发明还提供一种用于增强骨健康的制品，所述的制品中包含有枯草芽孢杆菌VHProbi P08的活菌。
本发明筛选获得的VHProbi P08不产生溶血素，不会溶解血细胞，对常见抗生素敏感，生物安全性良好；能够耐受较高的盐度，最大耐受盐浓度为8％；能在45℃条件下生长，并且能产生耐热性很强的孢子，方便后期工业化加工；体外细胞表面疏水性为38.47％，对肠道细胞具有一定的粘附性。
枯草芽孢杆菌VHProbi P08具备较强的抗氧化功能，其中对DPPH自由基清除率为16.14％；上清液抗脂质过氧化抑制率为50.44％。
枯草芽孢杆菌VHProbi P08具备降解胆固醇能力，其中体外胆固醇降解率达到8.45％。
枯草芽孢杆菌VHProbi P08能有效减少骨流失，降低骨质疏松小鼠的炎症水平，调节免疫反应水平。与建模组相比，益生菌组小鼠尿液中钙、磷的含量显著降低，血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)和促炎症反应细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)的含量显著降低。
枯草芽孢杆菌VHProbi P08能显著增强骨密度，增加骨小梁的数量和厚度，改善骨健康水平，有效预防因衰老而造成的骨质疏松症等现象。与建模组相比，益生菌组小鼠骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨密度指标显著上升，骨小梁分离度明显下降；益生菌组小鼠股骨骨小梁结构缺失有改善，完整度提高。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08可添加在大多数种类的宠物食品中，制备成有增强骨健康作用的功能性食品。该菌株发酵条件简单、产业化成本低、市场前景广阔。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌VHProbi P08Riboprinter指纹图谱；
图2为枯草芽孢杆菌VHProbi P08RAPD指纹图；
图3为枯草芽孢杆菌VHProbi P08rep-PCR指纹图；
图4为各组别小鼠尿磷、尿钙测定结果图；
图5为各组别小鼠血清细胞因子检测结果图；
图6为各组别小鼠Micro-CT指标计算结果图；
图7为各组别小鼠股骨Micro-CT扫描建模图。
具体实施方式
本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1菌株的分离筛选
1、芽孢杆菌初筛
取1g发酵的酸白菜，捣碎机捣碎，然后用10ml 0.85％的生理盐浸泡10分钟，放入无菌样品袋中用均质机拍打混匀，倒入试管内，水浴锅70℃加热10分钟，悬浊液进行梯度稀释，分别取10-1、10-2、10-3三个稀释梯度100ul涂布于MRS培养基上，好氧条件下37℃培养箱中培养48h，待平板长出单菌落后，分别进行镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出10株芽孢杆菌，分别命名为01，02，……，10。
2、芽孢杆菌复筛
液体发酵培养基：称取酵母粉3.0g、蛋白胨5.0、牛肉膏2.0g、K2HPO4 3g、MnSO40.005g、MgSO4 0.02g和NaCl 2g，混匀，加入1000ml蒸馏水溶解，121℃20分钟高压灭菌。
菌量计数培养基：酵母粉5.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖5.0g、K2HPO4 0.5g、KH2PO40.5g、MgSO4 0.3g、微量元素溶液1.0ml、琼脂粉15.0g，加入1000ml蒸馏水溶解，115℃30分钟高压灭菌。
(1)成孢率筛选
将筛选得到的10株芽孢杆菌，按6％接种量分别接种于上述液体发酵培养基中，40℃好氧条件下置于摇床中培养，210rpm/min培养48h。取发酵液进行菌量计数N1，同时把发酵液放到70℃，10分钟灭活菌体，再次进行计数N2，计算各株芽孢杆菌的成孢率。
成孢率＝N2/N1*100％。
结果显示：本发明筛选得到的芽孢杆菌01，02，……，10的成孢率分别是63％，68％，80％，72％，66％，79％，88％，89％，65％和77％，其中8号菌株的成孢率最高，达89％。
(2)95℃条件下存活率筛选
将芽孢杆菌01，02，……，10按6％接种量分别接种于上述液体发酵培养基中，40℃好氧条件下置于摇床中培养，210rpm/min培养48h后，将发酵液放到70℃，10分钟灭活菌体，计算孢子浓度；利用液体发酵培养基稀释发酵液，使10株芽孢杆菌的孢子量保持一致，孢子菌量的对数值为9.0logCFU/ml；将稀释后的发酵液在95℃条件下处理20分钟后，分别测定菌量，10株菌的孢子存活量分别为6.27，4.46，6.58，6.66，5.74，6.16，4.43，6.74，5.91，5.80logCFU/ml。其中8号菌株的孢子存活量最多，菌量对数值为6.74logCFU/ml。
综上所述，本发明筛选到的10株芽孢杆菌中08号菌株的成孢率最高，且耐热性最强，有利于该芽孢杆菌的广泛应用。
实施例2菌株鉴定
2.1菌落形态鉴定
08号菌株的单菌落呈乳白色，有光泽，菌落表面平整湿润，边缘整齐，菌落直径在2-3mm。显微镜下呈杆状，单个，成对或链状排列，芽孢端生。
2.2生理生化特性鉴定
本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬后稀释50倍，作为接种液。
1、温度生长范围实验
在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种到10ml MRS液体培养基中，不接菌的10ml MRS液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温振荡培养箱培养7天，45℃和65℃恒温振荡培养箱培养2天，观察培养液是否变浑浊。
结果显示：15℃恒温培养7天后，培养基仍澄清；45℃恒温培养2天后，培养基变浑浊，65℃恒温培养2天后，培养基仍澄清。从而说明，8号菌株在15℃和65℃条件下不能生长，在45℃条件下能正常生长。
2、碳源代谢实验
本实施例中所用的含酚红的基础培养基配方如下：
蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5ml；酚红18mg；蒸馏水100ml；pH7.4±0.2。盐溶液成分：MgSO4·7H2O 11.5g，MnSO4·4H2O2 8g，蒸馏水100ml。
配制10g/ml的糖、醇和苷类碳水化合物溶液，并用0.22μm的无菌过滤器进行过滤。在无菌条件下，向96孔板中加入20μl除菌后的碳水化合物溶液，每种碳水化合物4个平行，然后加入170μl灭菌后含酚红的基础培养基，再加入10μl接种液，不接菌孔作为对照。每孔加入50μl液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。37℃培养，以酚红为指示剂，观察培养基颜色变化，结果见表1。
表1：碳源代谢结果表
| 甘油 | D-核糖 | D-木糖 | D-半乳糖 | D-甘露糖 | L-鼠李糖 | D-甘露醇 |
| + | + | + | + | + | - | + |
| D-山梨醇 | 苦杏仁苷 | 水杨苷 | D-纤维二糖 | 麦芽糖 | 乳糖 | D-蜜二糖 |
| + | + | + | + | + | + | + |
| 蔗糖 | D-海藻糖 | 菊粉 | D-松三糖 | D-棉子糖 | L-岩藻糖 | 葡萄糖酸钠 |
| + | + | + | - | + | - | - |
注：“+”阳性反应；“-”阴性反应
4、葡萄糖产酸产气试验
本实施例中所用的培养基配方如下：
蛋白胨0.5g；酵母提取物0.3g；吐温80 0.1ml；盐溶液A 0.5ml；盐溶液B 0.5ml；乙酸钠0.5g；葡萄糖2.5g；2％溴甲酚绿(w/v)0.05ml；蒸馏水100ml；pH6.8～7.0。
将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3ml/管，121℃，高压灭菌15min。
盐溶液A成分：KH2PO4 10g、K2HPO4 1.0g，溶于蒸馏水，定容至100ml。
盐溶液B成分：MgSO4·7H2O 11.5g、MnSO4·2H2O 2.4g、FeSO4·7H2O 0.68g，溶于蒸馏水，定容至100ml。
在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2ml无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养。连续培养6d，每天观察培养基颜色有无变化。
结果显示：37℃培养6d后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明8号菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。
综上，8号菌株的生理生化鉴定结果如下：能利用甘油、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、苦杏仁苷、水杨苷、D-纤维二糖、麦芽糖、乳糖、D-蜜二糖、蔗糖、D-海藻糖、菊粉、D-棉子糖、葡萄糖酸钠作为碳源，而不能利用D-山梨醇、D-松三糖、L-岩藻糖作为碳源；在15℃和65℃条件下不能生长，在45℃条件下能正常生长；发酵葡萄糖产酸，不产气。
2.3分子生物学鉴定
挑取平板上08号菌株的单菌落于MRS肉汤培养基中，37℃培养24小时，然后取500ul发酵液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作得到该菌株的基因组，该基因组用于后面的分子生物学鉴定。
1、16s rDNA基因序列鉴定
16s rDNA基因扩增
1)引物序列:
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
2)反应体系(50μL)
表2：16s rDNA PCR扩增体系表
3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。
4)PCR产物测序
测序结果显示08号菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BALST比对，其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性最高。因此，初步确定08号菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2、Riboprinter指纹图谱
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的8号菌株单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使菌体在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，8号菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其Riboprinter指纹图谱如图1所示。
经比对，08号菌株的Riboprinter指纹图谱与Riboprinter库里附带的上万株菌株的指纹图谱均不同。另外，经查询全球所有发表的文献中枯草芽孢杆菌的Riboprinter指纹图谱，未发现有与该指纹图谱吻合的菌株，从而进一步说明08号菌株是一株新的枯草芽孢杆菌菌株。
3、RAPD指纹图谱鉴定
1、RAPD指纹图谱鉴定
1)引物序列：M13(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)
2)RAPD反应体系
表3：RAPD反应体系表
3)电泳
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图，8号菌株和对照菌株枯草芽孢杆菌GBI-30 6086的RAPD指纹图谱如图2所示。
经查询全球所有发表的文献中枯草芽孢杆菌的RAPD指纹图谱，未发现有与该指纹图谱吻合的菌株，说明8号菌株是一株新的枯草芽孢杆菌菌株。
4、rep-PCR指纹图谱鉴定
1)rep-PCR引物
GTGGTGGTGGTGGTG
2)rep-PCR的反应体系
表4：rep-PCR的反应体系表
3)电泳
DL2000DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果，8号菌株和对照菌株枯草芽孢杆菌GBI-30 6086的rep-PCR指纹图谱如图3所示。
经查询全球所有发表的文献中枯草芽孢杆菌的rep-PCR指纹图谱，未发现有与该指纹图谱吻合的菌株，说明P08菌株是一株新的枯草芽孢杆菌菌株。
综上，将08号菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html，同时结合文献De Clerck E，etal.Systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，08号菌株为一株新的枯草芽孢杆菌菌株，将其命名为枯草芽孢杆菌VHProbi P08(Bacillus subtilis VHProbi P08)。
实施例4枯草芽孢杆菌VHProbi P08盐度耐受性试验
在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种到盐浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的5ml MRS液体培养基中，不接菌的5ml MRS液体培养基作为对照，置于37℃恒温振荡培养，观察培养基是否变浑浊。
结果显示：枯草芽孢杆菌VHProbi P08在8％盐浓度下生长。
实施例5枯草芽孢杆菌VHProbi P08的抗生素耐受性试验
1、抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素均配制成2048μg/ml的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用MRS液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/ml共11个梯度。
2、接种液制备：取适量新鲜菌液(24～48h，40℃培养)，5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬后稀释50倍，作为接种液。
3、微量肉汤稀释法测定抗生素对枯草芽孢杆菌VHProbi P08的最小抑菌浓度MIC。
(1)96孔板第1列次加入不含抗生素的MRS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。
(2)加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。
(3)将96孔板于40℃振荡培养48h后取出，测定OD600值，用48h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，结果见表5。
表5：枯草芽孢杆菌VHProbi P08的抗生素MIC值
注：MIC单位μg/ml
从表5的结果可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08对红霉素、氨苄西林等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
实施例6枯草芽孢杆菌VHProbi P08的疏水性细胞表面测试
1、待测菌液制备：挑取纯化好的枯草芽孢杆菌VHProbi P08菌落接种于新配制的MRS液体培养基中，于40℃振荡培养24～48h。再按1％(V/V)的接种量接至MRS液体培养基中于40℃继续振荡培养24～48h后6000×g离心10min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1M KNO3 1ml溶液重悬菌体，作为待测菌液。
2、表面疏水性测定：吸取50μl上述菌悬液加入2450μl的0.1M KNO3并记录OD600为A0,取1.5ml菌悬液与500μl二甲苯混匀后在室温下静置10min(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋振荡2min后再静置20min,重新形成水相和有机相。小心吸取水相(不要吸到有机相)在600nm处测量吸光度A1。细胞疏水性按公式Hydrophobicity％＝(A0-A1)/A1×％计算，测三次实验取平均值。
结果显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08细胞表面疏水性为38.47％，标准差为1.92％。
实施例7枯草芽孢杆菌VHProbi P08抗氧化功能测定
1、菌株清除DPPH能力测定
1)PBS菌悬液制备
将生长状态优良的单菌落接种于3ml的MRS液体培养基中，37℃条件下培养18-20h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50ml的MRS液体培养基中，静置培养18h，获得菌株的培养液。吸取1ml菌液收集菌体后用1ml PBS缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2ml PBS溶液重悬菌体备用。
2)菌株清除DPPH自由基能力的测定
取1ml待测菌株的PBS菌悬液，加入1ml 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。
结果显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08对DPPH自由基的清除率高达16.14％，标准差为1.12％。
2、菌株抗脂质过氧化能力测定
1)菌株培养及发酵上清液的制备：
菌株在MRS液体培养基中37℃培养24h，传3代后，6000r/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵上清液。
2)亚油酸乳化液的制备：0.1ml亚油酸，0.2ml Tween 20，19.7ml去离子水。
3)0.5ml的PBS溶液(pH 7.4)中加入1ml亚油酸的乳化液，1mlFeSO4(1％)，再加入0.5ml样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2ml TCA(4％)，2ml TBA(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000r/min离心15min，收集上清液在OD532nm下测吸光度即为A；对照组以0.5ml蒸馏水代替样品即为A0。抑制率/％＝(A0－A)/A0×100。
结果显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08的上清液抗脂质过氧化抑制率为50.44％，标准差为0.57％；
实施例8枯草芽孢杆菌VHProbi P08体外胆固醇降解试验
1、胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100ml，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2、称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0ml，乙酸钠5.0，硫酸镁0.1，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2.0g，蒸馏水1000ml，调节pH值7.3，115℃灭菌30min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1％。按照0.1％的接种量接种新鲜菌液，37℃静止培养48小时，然后取0.2ml菌液，加入1.8ml无水乙醇，混匀，静止10分钟，3000转离心5分钟，取上清用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法按照GB/T 5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》。
结果显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08对胆固醇的降解率为8.45％。
实施例9枯草芽孢杆菌VHProbi P08在改善小鼠骨健康中的应用
1.1实验动物
C57小鼠SPF级，雌雄各半，14周龄小鼠18只，体重19～25g。
1.2实验方法
小鼠适应性饲养7天后随机分为正常组、建模组和益生菌组，每组6只小鼠。益生菌组连续8周肌肉注射糖皮质激素，同期按照0.2ml/10g每天灌胃给予益生菌菌液(1×109CFU/ml)，并持续至第24周；建模组连续8周肌肉注射糖皮质激素，剂量为1mg/kg,建模完成后同期灌胃等量的MRS液体培养基，并持续至第24周；正常组不建模，同期按照0.2ml/10g每天灌胃给予生理盐水(0.9％)，并持续至第24周。
1.3.1检测指标
试验结束后取小鼠股骨标本，采用Micro-CT测量骨密度、骨小梁体积分数、骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁分离度和SMI指数。终末时，测量小鼠血清细胞因子TNF-α、IL-1β和INF-γ，收集小鼠尿液测量其钙、磷含量。
1.3.2数据统计处理方法
所有实验数据以均数±标准差表示，用Microsoft EXCEL进行数据统计和作图，两组数据间比较采用t检验，以P<0.05判定为有显著性差异。
1.4实验结果
1.4.1终末期小鼠尿液钙、磷含量测定
各组别小鼠尿磷、尿钙测定结果如图4所示。
终末期时，与正常组相比，建模组和益生菌组小鼠尿液中钙含量显著升高，说明建模组和益生菌组小鼠机体内钙存在流失现象。其中，建模组与正常组相比具有极显著性差异(P<0.01)，说明建模成功。与建模组相比，益生菌组小鼠尿液中钙含量显著下降(P<0.05)。
终末期时，与正常组相比，建模组和益生菌组小鼠尿液中磷含量显著升高，说明建模组和益生菌组小鼠机体内磷存在流失现象。其中，建模组与正常组相比具有显著性差异(P<0.05)，说明建模成功。与建模组相比，益生菌组尿液中磷含量下降，差异具有显著性(P<0.05)。
上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08能显著降低骨质疏松小鼠尿液中钙、磷的含量，有效减少骨流失。
1.4.2终末期小鼠血清细胞因子测定
各组别小鼠血清细胞因子检测结果如图5所示。
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠血清TNF-α含量升高，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠血清中TNF-α含量显著降低(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠血清INF-γ含量升高，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠血清中INF-γ含量极显著降低P<0.01)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠血清IL-1β含量升高，差异具有极显著性(P<0.01)，与建模组相比，益生菌组小鼠血清中IL-1β含量显著降低(P<0.05)。
上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08能显著降低骨质疏松小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)和促炎症反应细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)的水平，有效降低骨质疏松小鼠的炎症水平，调节免疫反应水平。
1.4.2终末期小鼠股骨Micro-CT扫描分析
各组别小鼠Micro-CT指标计算结果如图6所示。
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠骨体积分数BV/TV降低，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠的骨体积分数BV/TV极显著升高(P<0.01)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠骨小梁厚度Tb.Th降低，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠的骨小梁厚度Tb.Th显著升高(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠骨小梁分离度Tb.Sp上升，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠的骨小梁分离度Tb.Sp显著下降(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠骨小梁数量Tb.N降低，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠的骨小梁数量Tb.N显著升高(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠结构模型指数SMI升高，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠的结构模型指数SMI显著降低(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，建模组小鼠骨密度BMD降低，差异具有极显著性(P<0.01)。与建模组相比，益生菌组小鼠的骨密度BMD极显著升高(P<0.01)。
各组别小鼠Micro-CT扫描结果如图7所示，正常组股骨骨小梁结构完整，建模组股骨骨小梁隐窝结构出现缺失，而益生菌组小鼠的股骨骨小梁结构缺失有改善，完整度提高。
上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08能显著减少骨流失，增强骨密度，增加骨小梁的数量和厚度，改善骨健康水平，有效预防因衰老而造成的骨质疏松症等现象。
枯草芽孢杆菌在动物饲料中应用历史悠久，安全性良好。本发明提供的枯草芽孢杆菌VHProbi P08符合我国的规定，可以添加到宠物保健食品中使用。经过体外动物实验证实，枯草芽孢杆菌VHProbi P08具有减少骨流失，增强骨密度，预防骨质疏松的功能。此外，枯草芽孢杆菌VHProbi P08所具有的耐热性特点及良好的成孢率使其可以添加在大多数种类的食品中。该菌株发酵条件简单、产业化成本低、市场前景广阔，是一株具有巨大经济价值的新型益生菌株。
申请人已于2021年6月7日将所述枯草芽孢杆菌VHProbi P08(Bacillus subtilisVHProbi P08)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：M2021684。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一株具有增强骨健康作用的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggctggctc ctaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt 180
gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420
cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg 480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600
agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca 720
gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac 780
acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctcccc 840
ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca 900
ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960
gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt tgaacggcac ttgttcttcc 1020
ctaacaacag agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag 1080
actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1140
tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc 1200
cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca 1260
ccttttatgt ctgaaccatg cggttcagac aaccatccgg tattagcccc ggtttcccgg 1320
agttatccca gtcttacagg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaacat 1380
cagggagcaa gctcccatct gtccgctcga ctgc 1414
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2021684。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的Riboprinter指纹图谱如图1所示。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的RAPD指纹图如图2所示。
4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的rep-PCR指纹图如图3所示。
5.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备用于增强骨健康的制品中的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备用于抗氧化功能的制品中的应用。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备用于降解胆固醇的制品中的应用。
9.一种益生菌制品，其特征在于，所述的益生菌制品中包含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的活菌。
10.如权利要求9所述的益生菌制品，其特征在于，所述的益生菌制品中还包含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵产物。
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