CN110129234A - 经诱变的高产天然维生素k2的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents
经诱变的高产天然维生素k2的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开经诱变的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。当在液体培养基中，37℃温度下以180r/min培养3天后，本发明的菌株发酵液中维生素K2的含量为62.08mg/L以上，且该发酵产生维生素K2的能力至少能够维持10代传代培养。与目前已知的枯草芽孢杆菌相比，本发明的菌株产维生素K2的能力提高至少24倍。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的改造，具体涉及稳定高产维生素k2的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，可分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等，促进小肠黏膜细胞增殖，使肠道酸化利于铁、钙及维生素D等的吸收。枯草芽孢杆菌作为重要的工业生产益生菌，能够合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，从而在食品、酶制剂、饲料行业得到广泛的应用。该菌为美国FDA公布的40种益生菌之一，食用安全，基因组清晰，早在1995年Rowland等就系统阐明了枯草芽抱杆菌基因组。然而，天然菌株因生长繁殖能力弱，产酶效率低等缺点而不能用于工业生产。
维生素K2(Menaguinone，MK)是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的系列衍生物，共有14种同系物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。有多种结构形式，其中最常见的是合成的MK-4和天然的MK-7。WHO的数据表明，MK-7是公认的优质天然维生素K2，几乎完全被人体吸收，并留在血液中的时间最长。且活性高，仅能通过微生物发酵法获得。因其在食品中含量极少，素有“铀金维生素”之称，具有预防和治疗骨质疏松、动脉钙化、心血管疾病、肿瘤及帕金森症等多种重要的生理功能。其安全性已得到美国FDA、中国食品药品监督管理局、美国药品研究所及欧洲议会和欧盟理事会的权威认定。传统的维生素K2一般采用化学合成法生产，但存在化学前体原料来源限制、化学反应产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K2，其异戊二烯侧链多是顺式结构，活性较低。而活性更高的天然维生素K2(MK-7)仅能通过微生物发酵法获得，因此，微生物发酵法越来越受到人们的欢迎，具有广阔的应用前景。其中纳豆枯草芽抱杆菌因其生长速度快、易于培养、维生素K2含量高等优势，成为发酵生产维生素K2最主要的微生物，是目前进行工业化生产的理想菌种之一。但是野生菌种维生素K2的产量<3mg/L，难以满足生产的需求。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明利用紫外(UV)物理诱变和亚硝基胍(NTG)化学诱变改造现有菌株，抗性筛选高产菌株，得到高产天然维生素K2的菌株。至少部分地基于此完成本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种经诱变的枯草芽孢杆菌菌株(有时也称作“本发明的菌株”)，与目前已知的枯草芽孢杆菌相比，本发明的菌株具有更高的维生素K2发酵能力。当在液体培养基中，接种4％，2×106cfu/ml的菌株于37℃温度下以180r/min培养本发明的菌株3天后，其发酵液中维生素K2的含量为62.08mg/L以上，优选65.79mg/L，一般情况下，野生枯草芽孢杆菌菌种的维生素K2的产量<3mg/L，而本发明的产量为62.08mg/L以上，产量增加24倍以上，优选26倍以上。
本发明中，上述培养的液体培养基为葡萄糖0.5wt％、可溶性淀粉0.5wt％、大豆蛋白0.5wt％、蛋白胨1wt％、MgSO4 0.5wt％、K2HPO4 0.1wt％和NaCl 0.5wt％。
在优选的实施方案中，本发明的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株还具有优异的稳定性。当经诱变的枯草芽孢杆菌菌株经至少10代传代培养后，在液体培养基中37℃温度下以180r/min培养3天，其发酵液中维生素K2的含量仍维持62.08mg/L以上，优选65.79mg/L。即，本发明的菌株不会因传代而降低维生素K2的发酵能力。
在某些实施方案中，本发明的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株为纳豆芽孢杆菌。
本发明的第二方面，提供利用紫外(UV)物理诱变和亚硝基胍(NTG)化学诱变改造现有菌株，抗性筛选高产菌株，得到的高产天然维生素K2的菌株。发明人已于2019年3月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO:17326。
本发明的第三方面，提供一种发酵方法，其包括在适于微生物生长的条件下使本发明的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株在培养基中进行培养以得到培养物的步骤。
在某些实施方案中，本发明的发酵方法中使用的培养基包含葡萄糖、可溶性淀粉、大豆蛋白、蛋白胨、MgSO4、K2HPO4、琼脂和NaCl。对于上述各成分的含量不特别限定。基于重量，葡萄糖的含量一般为0.2-0.7wt％，优选0.3-0.6wt％，更优选0.4-0.6wt％。可溶性淀粉的含量一般为0.2-0.7wt％，优选0.3-0.6wt％，更优选0.4-0.6wt％。大豆蛋白的含量一般为0.2-0.7wt％，优选0.3-0.6wt％，更优选0.4-0.6wt％。蛋白胨的含量一般为0.5-3wt％，优选0.8-2wt％，更优选0.8-1.5wt％。MgSO4的含量一般为0.2-0.7wt％，优选0.3-0.6wt％，更优选0.4-0.6wt％。K2HPO4的含量一般为0.02-0.7wt％，优选0.05-0.5wt％，更优选0.1-0.2wt％。琼脂的含量一般为0.5-5wt％，优选1-4wt％，更优选1.5-3wt％。NaCl的含量一般为0.2-0.7wt％，优选0.3-0.6wt％，更优选0.4-0.6wt％。
本发明的发酵方法还包括控制发酵时的温度的步骤，例如控制发酵过程中菌株的温度为25-40℃，优选37℃。本发明的发酵还包括一级培养和二级培养过程。例如，在一级培养时，控制发酵的锥形瓶内的温度至30℃，将预先经二级培养处于对数生长期的枯草芽孢杆菌BB-MK-16菌株接入上述锥形瓶中，接种量为4％，在180rpm和37℃的条件下，对该菌株连续发酵24-72h。
本发明的发酵方法还包括对于发酵物进行灭菌的步骤。灭菌可采用本领域已知的任何方法进行。例如，在115℃高压蒸汽灭菌30分钟等。
本发明的发酵方法还包括从培养物中分离产物例如维生素K2的步骤。产物的分离可采用本领域已知的方法进行。在示例性分离方法中，将发酵液在5000r/min条件下离心10min，分别收集清液和菌体。在上清液中加入萃取液(例如，正己烷和异丙醇的混合液)，明显分层后取上清液，对下层发酵液进行二次萃取得到萃取液，合并两次的萃取液。萃取液于40℃减压旋转浓缩，得到淡黄色油状物。加入例如无水乙醇和正己烷混合液溶解。进一步结晶得到纯度99％以上的VK2的固体粉末，或以多孔淀粉、糊精等作为载体，把VK2负载到载体上，得到任意浓度的VK2粉体。
本发明的第四方面，提供一种食品的制备方法，其包括本发明的发酵方法作为其步骤。优选地，本发明的食品为含有维生素K2的食品。例如，维生素K2片剂。
与现有技术相比，本发明的菌株可高产维生素K2。用该菌株发酵产维生素K2降低发酵成本，使发酵法生产维生素K2在工业大量优质生产中的应用成为可能。另外，本发明的菌株稳定性良好，经过多次发酵生产，可保证其生产性能不发生较大程度的下降。
附图说明
图1紫外诱变复筛结果。
图2化学诱变复筛结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株的筛选方法大致包括以下步骤：
(1)出发菌株的培养：
将大豆用清水浸泡静置一夜，第二天将水倒出，将泡发的大豆在121℃下灭菌20min；
固体培养基：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉0.5％、大豆蛋白0.5％、蛋白胨1％、MgSO40.5％、K2HPO4 0.1％、琼脂2％、NaCl 0.5％，自然pH；
将灭菌的大豆与纳豆在无菌条件下混合均匀，放入培养箱中37℃培养12-24h，当观察到大豆表面有白色拉丝物时停止培养。用无菌水将白色拉丝物洗下，通过梯度稀释并涂布，从白色拉丝物中分离细菌。通过三区划线法对分离得到的细菌进行纯化并编号；细菌分离及培养用121℃高压蒸汽灭菌20min的固体培养基；通过分离纯化，将得到菌株，根据不同的菌株形态特征分别进行标记。
(2)出发菌株菌悬液的制备：
从保藏的培养基上挑一环菌落，接种到灭菌液体培养基中培养，使其处于对数生长期，取50mL的离心管，加入10mL的菌液，5000r/min离心10min；弃去上清，向沉淀中加入10mL灭菌的生理盐水悬浮打匀，并重复一次；最后向沉淀中加入10mL的生理盐水悬浮打匀，菌悬液制备完成，4℃冰箱保存备用。
(3)菌体的紫外诱变和传代稳定性实验
进行紫外照射：取6个10ml离心管中各取1ml的上述菌悬液，置于20W紫外灯下10cm处照射0min、5min、10min、15min、20min、25min(每个辐照时间做3个平行对照)。每个实验组中取出1ml菌液用生理盐水稀释为10-1到10-6的菌悬液，选取10-4到10-6的菌悬液各100μl，涂布到枯草芽孢杆菌固态筛选培养基上，每个浓度涂三个平板。其中没有经过诱变处理的菌悬液提前稀释涂布到平板上，37℃恒温箱中培养2-3天，取出进行菌落计数，并计算致死率。
初筛：将经过紫外诱变的菌悬液接种到固态筛选培养基上，在37℃下培养，出现的每个菌落都会被钝化为单个菌落。挑选较大的单菌落，以1体积％-10体积％的量接种到20ml液体培养基中，37℃，180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量，初筛选出高产菌株，并计算正突变率。
复筛：将选出的高产菌株传10代培养，以1体积％-10体积％的量接种到20ml液体培养基中，37℃，180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量。重复上述步骤进行紫外诱变及筛选，剔除菌种退化，生长速度下降，VK2产量不稳定的菌株，保留生长速度快，稳定遗传的菌株、VK2产量较高的枯草芽孢杆菌菌株。
(4)菌体的化学诱变和传代稳定性实验
精确称取一定量NTG(亚硝基胍)，先溶于少量助溶剂丙酮中，再用pH6.0磷酸缓冲液定容为1mg/mL,将NTG溶液用磷酸盐缓冲液分别稀释到100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL。将NTG溶液加入到菌悬液中，最终浓度分别为：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL，将混合液37℃温浴30min，进行诱变。诱变结束后将菌悬液离心，用无菌水洗涤两次以终止诱变作用。最后加5mL液体培养基于菌体沉淀中使其悬浮，37℃震荡培养1-2h(度过生理延迟期)。
将各个离心管的菌液取样并逐级稀释至10-4到10-6，各取100μL涂布到枯草芽孢杆菌固态筛选培养基上，每个浓度涂三个平板。其中没有经过诱变处理的菌悬液提前稀释涂布到平板上。涂布后的固体培养基倒放至37℃培养箱中培养2-3天，取出后进行菌落计数并计算致死率。
初筛：将经过化学诱变的菌悬液接种到固态筛选培养基上，在37℃下培养，出现的每个菌落都会被钝化为单个菌落。挑选较大的单菌落挑菌，以1体积％-10体积％的量接种到20ml液体培养基中，37℃，180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量,初筛选出高产菌株，并计算正突变率。
复筛：将选出的高产菌株传10代培养，以1体积％-10体积％的量接种到20ml液体培养基中，37℃,180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量。重复上述步骤进行化学诱变及筛选，剔除菌种退化，生长速度下降，VK2产量不稳定的菌株，保留生长速度快，稳定遗传的菌株、VK2产量较高的枯草芽孢杆菌菌株。
实施例1
本实施例为诱变育种高产维生素K2的枯草芽孢杆菌菌株BB-MK-16的方法，其步骤如下：
(1)出发菌株的培养：
液体培养基：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉0.5％、大豆蛋白0.5％、蛋白胨1％、MgSO40.5％、K2HPO4 0.1％、NaCl0.5％，自然pH；
固体培养基：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉0.5％、大豆蛋白0.5％、蛋白胨1％、MgSO40.5％、K2HPO4 0.1％、琼脂2％、NaCl 0.5％，自然pH；
将实验室野生枯草芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上37℃复壮培养3代，使其达到正常的生长周期，备用。
(2)出发菌株菌悬液的制备：
从保藏的培养基上挑一环菌落，接种到灭菌液体培养基中培养，使其处于对数生长期，取50mL的离心管，加入10mL的菌液，5000r/min离心10min；弃去上清，向沉淀中加入10mL灭菌的生理盐水悬浮打匀，并重复一次；最后向沉淀中加入10mL的生理盐水悬浮打匀，菌悬液制备完成，4℃冰箱保存备用。
(3)菌体的紫外诱变和传代稳定性实验
进行紫外照射：取6个10ml离心管中各取1ml的上述菌悬液，置于20W紫外灯下10cm处照射0min、5min、10min、15min、20min、25min(每个辐照时间做3个平行对照)。每个实验组中取出1ml菌液用生理盐水稀释为10-1到10-6的菌悬液，选取10-4到10-6的菌悬液各100μl，涂布到枯草芽孢杆菌固态筛选培养基上，每个浓度涂三个平板。其中没有经过诱变处理的菌悬液提前稀释涂布到平板上，37℃恒温箱中培养2-3天，取出进行菌落计数，并计算致死率。
初筛：将经过紫外诱变的菌悬液接种到固态筛选培养基上，在37℃下培养，出现的每个菌落都会被钝化为单个菌落。挑选较大的80个单菌落，以4体积％的量(0.8ml 2×106cfu/ml的菌株)接种到20ml液体培养基中，37℃，180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量，初筛选出高产菌株8个，并计算正突变率为11.5％。
复筛：选出8个高产菌株进行传代培养，传10代。以4体积％的量(0.8ml2×106cfu/ml的菌株)接种到20ml液体培养基中，37℃，180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量。重复上述步骤进行紫外诱变及筛选，剔除菌种退化，生长速度下降，VK2产量不稳定的菌株，保留生长速度快，遗传稳定，VK2产量较高的枯草芽孢杆菌BB-MK-5。出发野生菌株VK2的产量为2.57mg/L，紫外诱变得到的BB-MK-5VK2产量为39.55mg/L。与出发菌株相比，紫外诱变得到的BB-MK-5产量提高了15倍。具体结果参见图1。
(4)菌体的化学诱变和传代稳定性实验
精确称取一定量NTG(亚硝基胍)，先溶于少量助溶剂丙酮中，再用pH6.0磷酸缓冲液定容为1mg/mL，将NTG溶液用磷酸盐缓冲液分别稀释到100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL。将NTG溶液加入到菌悬液中，最终浓度分别为:50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL，将混合液37℃温浴30min，进行诱变。诱变结束后将菌悬液离心,用无菌水洗涤两次以终止诱变作用。最后加5mL液体培养基于菌体沉淀中使其悬浮，37℃震荡培养1-2h(度过生理延迟期)。
将各个离心管的菌液取样并逐级稀释至10-4到10-6，各取100μL涂布到枯草芽孢杆菌固态筛选培养基上，每个浓度涂三个平板。其中没有经过诱变处理的菌悬液提前稀释涂布到平板上。涂布后的固体培养基倒放至37℃培养箱中培养2-3天，取出后进行菌落计数并计算致死率。
初筛：将经过化学诱变的菌悬液接种到固态筛选培养基上，在37℃下培养，出现的每个菌落都会被钝化为单个菌落。挑选较大的80个单菌落，以4体积％的量(0.8ml 2×106cfu/ml的菌株)接种到20ml液体培养基，37℃，180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量,初筛选出8个高产菌株，并计算正突变率为25％。
复筛：选出8个高产菌株进行传代培养，传10代。以4体积％的量(0.8ml2×106cfu/ml的菌株)接种到20ml液体培养基中，37℃,180r/min培养3天，检测发酵液中VK2产量。重复上述步骤进行化学诱变及筛选，剔除菌种退化，生长速度下降，VK2产量不稳定的菌株，保留生长速度快，遗传稳定，VK2产量较高的枯草芽孢杆菌BB-MK-16。出发野生菌株VK2的产量为2.57mg/L，化学诱变得到的BB-MK-16 VK2产量为65.79mg/L。与出发菌株相比，化学诱变得到的BB-MK-16产量提高了26倍。结果如图2所示。发明人已将BB-MK-16菌株于2019年3月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO:17326。
实施例2
本实施例为高产维生素K2的枯草芽孢杆菌BB-MK-16的发酵方法。
2.1将枯草芽孢杆菌BB-MK-16接种于灭菌的液体培养基上37℃复壮培养3代，使其达到正常的生长周期，备用。
液体培养基组成为：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉0.5％、大豆蛋白0.5％、蛋白胨1％、MgSO4 0.5％、K2HPO4 0.1％、NaCl0.5％，自然pH；于115℃灭菌30分钟。
2.2发酵培养基的配制
为容量为500mL的锥形瓶配制发酵培养基：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉0.5％、大豆蛋白0.5％、蛋白胨1％、MgSO4 0.5％、K2HPO4 0.1％，琼脂2％，NaCl 0.5％，自然pH；于115℃灭菌30分钟。
2.3接种培养
当锥形瓶降温至30℃时，将预先经二级培养处于对数生长期的枯草芽孢杆菌BB-MK-16菌株接入上述锥形瓶中，接种量为4％，在180rpm和37℃的条件下，对该菌株连续发酵72h。
2.4提取维生素K2
发酵结束后将发酵液在5000r/min条件下离心10min，分别收集清液和菌体。在上清液中按1:1的体积比加入萃取液(相同体积的正己烷和异丙醇)，进行第一次萃取，明显分层后取上清液，对下层发酵液重复萃取一次，合并萃取液。萃取液于40℃减压旋转浓缩，得到淡黄色油状物。加入1mL混合液溶解(无水乙醇和正己烷混合液，体积比97/3)。进一步结晶得到纯度99％以上的VK2的固体粉末，或以多孔淀粉、糊精等作为载体，把VK2负载到载体上，得到任意浓度的VK2粉体。
实施例3
本实施例为发酵生产的维生素K2的应用例。
维生素K2片剂，以维生素K2粉末为主要原料，添加适量奶粉、葡萄糖和淀粉制成。由于添加了维生素K2粉末，所以具有防治骨质疏松等保健功能，食用方便。
制作维生素K2片剂，原料及其配比为：维生素K2粉末0.001％，奶粉60％-70％，葡萄糖12％-15％，淀粉12％-15％。每个片剂约重3g，含维生素K2量30μg。
推荐男性每天吃4片，女性每天吃3片。
实施例4
本实施例为高产维生素K2的枯草芽孢杆菌BB-MK-16的菌粉应用例。
1固体培养基组成为：燕麦麸或者燕麦、自然pH，于120℃下灭菌20分钟。
将灭菌后的固态培养基冷却后，接种4％的枯草芽孢杆菌BB-MK-16，37℃，培养3天。
本方法也可以用液体培养基进行发酵培养。
3菌粉胶囊的制备
发酵结束后，进行冷冻干燥，制成菌粉，分装于胶囊中。由于菌粉中含大量维生素K2，所以本菌粉软胶囊具有防治骨质疏松等保健功能，食用方便。
菌粉胶囊规格：每粒胶囊0.25g，每粒含菌粉0.20g，含维生素K2量30μg。
推荐男性每天吃4粒，女性每天吃3粒。
实施例5
本实施例为高产维生素K2的枯草芽孢杆菌BB-MK-16的菌粉应用例。
1液体培养基的组成：蒸馏水、红豆8％、自然pH，于120℃下灭菌20分钟。
将灭菌后的液体培养基冷却后，接种4％的枯草芽孢杆菌BB-MK-16，37℃，摇培3天。
本方法也可以用固体培养基进发酵培养。
3菌粉胶囊的制备
发酵结束后，将发酵液进行冷冻干燥，制成菌粉，分装于胶囊中。由于菌粉中含大量维生素K2，所以本菌粉软胶囊具有防治骨质疏松等保健功能，食用方便。
菌粉胶囊规格：每粒胶囊0.25g，每粒含菌粉0.20g，含维生素K2量30μg。
推荐男性每天吃4粒，女性每天吃3粒。
实施例6
本实施例为高产维生素K2的枯草芽孢杆菌BB-MK-16的咀嚼片。
发酵培养基：葡萄糖0.5％、可溶性淀粉0.5％、大豆蛋白0.5％、蛋白胨1％、MgSO40.5％、K2HPO4 0.1％，NaCl 0.5％，自然pH；于115℃灭菌30分钟。
将BB-MK-16菌接种于灭菌的发酵培养基中，接种量为4％，37℃，摇培3天。摇培结束后离心收集菌体，将收集到的菌体进行冷冻干燥，得到菌体的冻干粉。
咀嚼片的组成：水，脱脂奶粉，葡萄糖，BB-MK-16冻干菌粉(冻干菌粉活菌数1.0×1011CFU/g)
按咀嚼片组成添加主料BB-MK-16冻干菌粉及其他辅料后，混合机混匀12min，上压片机压片，得到片剂。咀嚼片可以制作成香草、葡萄、苹果等多种口味。这种咀嚼片中含有枯草芽孢杆菌BB-MK-16，可以产维生素K2，有助于防止骨质疏松，促进骨形成，抑制骨吸收，促进骨矿化。
咀嚼片规格：每片0.25g，含菌粉0.20g，最多含维生素K2量30μg。推荐男性每天吃4粒，女性每天吃3粒。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
Claims (10)
1.一种经诱变的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，当在液体培养基中，接种4％，2×106cfu/ml的菌株于37℃温度以180r/min培养3天后，其发酵液中维生素K2的含量为62.08mg/L以上。
2.根据权利要求1所述的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述经诱变的枯草芽孢杆菌菌株经至少10代传代培养后，在液体培养基中，接种4％，2×106cfu/ml的菌株于37℃温度下以180r/min培养3天，其发酵液中维生素K2的含量维持62.08mg/L以上。
3.根据权利要求1所述的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株为纳豆芽抱杆菌。
4.根据权利要求1-3任一项所述的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述液体培养基的组成为：葡萄糖0.5wt％、可溶性淀粉0.5wt％、大豆蛋白0.5wt％、蛋白胨1wt％、MgSO4 0.5wt％、K2HPO4 0.1wt％和NaCl 0.5wt％。
5.一种经诱变的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株通过对枯草芽孢杆菌野生菌株进行诱变得到，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO:17326。
6.一种发酵方法，其特征在于，包括在适于微生物生长的条件下使根据权利要求1-5任一项所述的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株在培养基中进行培养以得到培养物的步骤。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述培养基包含葡萄糖、可溶性淀粉、大豆蛋白、蛋白胨、MgSO4、K2HPO4、琼脂和NaCl。
8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，进一步包括从培养物中分离维生素K2的步骤。
9.一种保健食品的制备方法，其特征在于，包括权利要求6-8任一项所述的发酵方法作为其步骤。
10.根据权利要求9所述的保健食品的制备方法，其特征在于，所述保健食品为维生素K2片剂、咀嚼片或胶囊。
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