CN110200017A - 一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法，利用蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423、非致病尖孢镰刀菌制成的复合菌粉与预处理载体混合制成，其中，非致病尖孢镰刀菌是从花生根系内部纯化、培养得到，对花生根结线虫病的防治更好，与蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423协同配合，增强了花生根结线虫病防治效果。预处理载体是将载体经非致病尖孢镰刀菌处理后得到，预处理载体与复合菌粉载体复合后，进一步增强了花生根结线虫病防治效果，不需再行添加噻唑膦即可实现良好的花生根结线虫病防治效果。

Description

一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及花生种植技术领域，特别是涉及一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
花生根结线虫病是一种世界性病害，在根结线虫发病土壤里，根结线虫、花生和根际微生物组成了一个小的生态系统，表明根结线虫病的发生与根际微生物有非常重要的关系。根结线虫作为一种顽固的土壤病害，直接危害花生的根部营养吸收。花生感病后根的吸收功能被破坏，植株矮小发黄，结果少而稀。一般减产20％～30％，严重的可减产70％以上，甚至绝收。
由于抗根结线虫病的种质资源稀少，所以目前花生根结线虫还是依赖于人工防治干预，主要分为化学农药防治、物理防治和生物防治。化学农药防治会导致线虫抗药性增强、虫口密度上升、污染环境、杀伤天敌、农药残留、病虫菌的抗药性增强、威胁人类健康等。物理防治主要是用来处理温室的种子、苗床和苗木，可能需要较长一段休棚期，打乱生产计划，影响作物生长周期，一般不适用于大田防治线虫。其应用范围有限，防治效果一般，有些需要特殊的仪器设备，增加生产成本。生物防治可以有效避免化学农药防治和物理防治带来的诸多问题，无疑是当前花生根结线虫病防治的有效措施。
目前针对结线虫病的生物防治也进行了一系列拮抗微生物筛选，但是现有的微生物利用没有充分发挥微生物在土壤根际的生态效应，也没有发挥复合微生物调节土壤肥力等作用。
非致病尖孢镰刀菌是根结线虫的拮抗菌，作为线虫生防菌具有巨大潜力，镰刀菌可以产生某些代谢产物毒杀卵粒，再定植于卵，影响其发育，由于内寄生特性使得菌株受到外界其他微生物竞争作用较小，所以有利于稳定的发挥功效。但是目前的尖孢镰刀菌菌剂往往使用大量的噻唑膦来配合制成，使用大量的噻唑膦将带来很高的经济成本，不适合大规模生产，防治效果差，噻唑膦除了自身降解速度快等缺陷外，其属于化学药物，长久使用不可避免会出现抗药性。专利CN103503924B公开了一种尖孢镰刀菌菌剂，虽然减少了噻唑膦的使用量，但是仍需要与噻唑膦配合使用。而且其专门应用于黄瓜、番茄等根结线虫的防治，将其用于花生根结线虫的防治，有一定的防治效果，但是比在黄瓜、番茄中的防治效果更差。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种防治根结线虫的复合微生物菌剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明是通过如下方案实现的：
一种防治根结线虫的复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4～5天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养10～12天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
优选的，步骤(1)中，培养条件为：在25～28℃温度条件下，于121℃灭菌20～30分钟后的平板培养基中培养3～5天。
优选的，步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.2～0.3g：8～10g：20～22mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.4～0.5。
优选的，步骤(2)中，加热搅拌的工艺条件为：70～80℃搅拌5～6小时。
优选的，步骤(2)中，洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3～4次。
优选的，步骤(2)中，干燥的工艺条件为：85～90℃真空干燥12～15小时。
优选的，步骤(2)中，研磨过筛得到粒径范围50～60目的载体。
优选的，步骤(2)中，灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌40～50分钟。
优选的，步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。
优选的，步骤(3)中，培养温度为25～28℃。
优选的，步骤(3)中，非致病尖孢镰刀菌种的接种量为4～5％(体积)。
优选的，步骤(3)中，非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：30～40mg。
优选的，步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.3～0.4：0.3～0.5：0.2～0.3：0.8～1进行混合。
优选的，步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4～5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3～4％(体积)，培养4～6天后，分别于170～180r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为27～29℃，培养时间为40～45小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为28～30℃，培养时间为45～48小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为27～29℃，培养时间为40～45小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为27～29℃，培养时间为72～75小时。
进一步优选的，以重量份计，所述肉汁胨培养基包括：牛肉膏3～5份，蛋白胨5～6份，NaCl 2～4份，琼脂18～22份和1000份去离子水，且其pH为6.8～7.2；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆195～200份、葡萄糖10～12份、琼脂18～20份，Na2HPO4 4～6份和1000份去离子水，且其pH为7.0～7.6。
优选的，步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1～2％和0.5～0.8％。
优选的，步骤(4)中，压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后45～50℃干燥至含水量20～30％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
优选的，步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5～6。
利用上述制备方法得到的一种防治根结线虫的复合微生物菌剂。
本发明还要求保护上述微生物菌剂在防治根结线虫病中的应用。
优选的，所述根结线虫病为花生根结线虫病。
本发明的有益效果是：
(1)本发明利用蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423、非致病尖孢镰刀菌制成的复合菌粉与预处理载体混合制成，其中，非致病尖孢镰刀菌是从花生根系内部纯化、培养得到，对花生根结线虫病的防治更好，与蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423协同配合，增强了花生根结线虫病防治效果。预处理载体是将载体经非致病尖孢镰刀菌处理后得到，预处理载体与复合菌粉载体复合后，进一步增强了花生根结线虫病防治效果，不需再行添加噻唑膦即可实现良好的花生根结线虫病防治效果。
(2)本发明载体是利用花生秧粉、松针粉、凹凸棒土利用二甲基亚砜-乙醇混合液处理得到，一方面在混合液处理过程中各物料充分混合，形成多孔结构，增强吸附作用，对微生物具有良好的负载作用；另一方面，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土等为微生物生长提供营养，有利于微生物繁殖生长，强化微生物的防治作用。
(3)在本发明的复合菌粉中，非致病尖孢镰刀菌为内生菌，对花生安全无害，并有效持久抑制根结线虫病的发生；蜡样芽孢杆菌ACCC02368，可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境；根瘤菌ACCC01041，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养；凝结芽孢杆菌ACCC00403，提高对土壤中的磷、钾转化吸收，并有固氮、促生作用；哈茨木霉ACCC30423，在植物根围生长并形成“保护罩”，以防止根部病原真菌的侵染。促进对氮磷钾的吸收，同时与根际微生物相互作用，优化微生物环境，促进花生生长。复合菌粉中的多种微生物共同作用，抑制花生根结线虫病的产生，并改善土壤微环境，为花生根系提供更多营养支持，促进花生生长。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及的蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423，均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一种防治根结线虫的复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养12天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在25℃温度条件下，于121℃灭菌30分钟后的平板培养基中培养3天。
步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.3g：8g：22mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.4。
加热搅拌的工艺条件为：80℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤4次。干燥的工艺条件为：85℃真空干燥15小时。研磨过筛得到粒径50目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌50分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为25℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为5％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：30mg。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.4：0.3：0.3：0.8进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为4％(体积)，培养4天后，分别于180r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为27℃，培养时间为45小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为28℃，培养时间为48小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为27℃，培养时间为45小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为27℃，培养时间为75小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏3份，蛋白胨6份，NaCl 2份，琼脂22份和1000份去离子水，且其pH为6.8；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆200份、葡萄糖10份、琼脂20份，Na2HPO4 4份和1000份去离子水，且其pH为7.6。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1％和0.8％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后45℃干燥至含水量30％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5。
实施例2
一种防治根结线虫的复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养5天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养10天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在28℃温度条件下，于121℃灭菌20分钟后的平板培养基中培养5天。
步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.2g：10g：20mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.5。
加热搅拌的工艺条件为：70℃搅拌6小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：90℃真空干燥12小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌40分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为28℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为4％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：40mg。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.3：0.5：0.2：1进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3％(体积)，培养6天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为29℃，培养时间为40小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为30℃，培养时间为45小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为29℃，培养时间为40小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为29℃，培养时间为72小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏5份，蛋白胨5份，NaCl 4份，琼脂18份和1000份去离子水，且其pH为7.2；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆195份、葡萄糖12份、琼脂18份，Na2HPO46份和1000份去离子水，且其pH为7.0。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的2％和0.5％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后50℃干燥至含水量20％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：6。
实施例3
一种防治根结线虫的复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养11天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在27℃温度条件下，于121℃灭菌25分钟后的平板培养基中培养4天。
步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.25g：9g：21mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.45。
加热搅拌的工艺条件为：75℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：88℃真空干燥13小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌45分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为26℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为5％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：35mg。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.35：0.4：0.23：0.9进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4.5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3.4％(体积)，培养5天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为28℃，培养时间为42小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为289℃，培养时间为46小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为28℃，培养时间为42小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为28℃，培养时间为73小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏4份，蛋白胨6份，NaCl 3份，琼脂20份和1000份去离子水，且其pH为7；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆198份、葡萄糖11份、琼脂19份，Na2HPO4 5份和1000份去离子水，且其pH为7.4。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1.5％和0.6％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5.5。
对比例1
一种复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)省略；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(2)所得载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在27℃温度条件下，于121℃灭菌25分钟后的平板培养基中培养4天。
步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.25g：9g：21mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.45。
加热搅拌的工艺条件为：75℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：88℃真空干燥13小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌45分钟。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.35：0.4：0.23：0.9进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4.5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3.4％(体积)，培养5天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为28℃，培养时间为42小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为289℃，培养时间为46小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为28℃，培养时间为42小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为28℃，培养时间为73小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏4份，蛋白胨6份，NaCl 3份，琼脂20份和1000份去离子水，且其pH为7；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆198份、葡萄糖11份、琼脂19份，Na2HPO4 5份和1000份去离子水，且其pH为7.4。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1.5％和0.6％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5.5。
对比例2
一种复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养11天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在27℃温度条件下，于121℃灭菌25分钟后的平板培养基中培养4天。
步骤(2)中，松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1.25g：9g：21mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.45。
加热搅拌的工艺条件为：75℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：88℃真空干燥13小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌45分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为26℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为5％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：35mg。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.35：0.4：0.23：0.9进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4.5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3.4％(体积)，培养5天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为28℃，培养时间为42小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为289℃，培养时间为46小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为28℃，培养时间为42小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为28℃，培养时间为73小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏4份，蛋白胨6份，NaCl 3份，琼脂20份和1000份去离子水，且其pH为7；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆198份、葡萄糖11份、琼脂19份，Na2HPO4 5份和1000份去离子水，且其pH为7.4。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1.5％和0.6％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5.5。
对比例3
一种复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养11天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在27℃温度条件下，于121℃灭菌25分钟后的平板培养基中培养4天。
步骤(2)中，花生秧粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1.25g：9g：21mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.45。
加热搅拌的工艺条件为：75℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：88℃真空干燥13小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌45分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为26℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为5％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：35mg。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.35：0.4：0.23：0.9进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4.5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3.4％(体积)，培养5天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为28℃，培养时间为42小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为289℃，培养时间为46小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为28℃，培养时间为42小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为28℃，培养时间为73小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏4份，蛋白胨6份，NaCl 3份，琼脂20份和1000份去离子水，且其pH为7；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆198份、葡萄糖11份、琼脂19份，Na2HPO4 5份和1000份去离子水，且其pH为7.4。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1.5％和0.6％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5.5。
对比例4
一种复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养11天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在27℃温度条件下，于121℃灭菌25分钟后的平板培养基中培养4天。
步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.25g：9g：21mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.45。
加热搅拌的工艺条件为：75℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：88℃真空干燥13小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌45分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为26℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为5％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：35mg。
步骤(4)中，根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比0.35：1.4：0.23：0.9进行混合。
凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4.5％(体积)；根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，接种量为3.4％(体积)，培养5天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为289℃，培养时间为46小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为28℃，培养时间为42小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为28℃，培养时间为73小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏4份，蛋白胨6份，NaCl 3份，琼脂20份和1000份去离子水，且其pH为7；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆198份、葡萄糖11份、琼脂19份，Na2HPO4 5份和1000份去离子水，且其pH为7.4。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1.5％和0.6％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5.5。
对比例5
一种复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用；
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养11天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
步骤(1)中，培养条件为：在27℃温度条件下，于121℃灭菌25分钟后的平板培养基中培养4天。
步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比为1g：0.25g：9g：21mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.45。
加热搅拌的工艺条件为：75℃搅拌5小时。洗涤是通过60℃的热乙醇洗涤3次。干燥的工艺条件为：88℃真空干燥13小时。研磨过筛得到粒径60目的载体。灭菌处理的工艺条件为：在121℃条件下高温灭菌45分钟。
步骤(3)中，PDA培养基的配方组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，自然pH。培养温度为26℃。非致病尖孢镰刀菌种的接种量为5％(体积)。非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：35mg。
步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.58：0.4：0.9进行混合。
蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，接种量为4.5％(体积)；根瘤菌ACCC01041接种于PDA培养基，接种量为3.4％(体积)，培养5天后，分别于170r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为28℃，培养时间为42小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为289℃，培养时间为46小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为28℃，培养时间为42小时。
肉汁胨培养基包括：牛肉膏4份，蛋白胨6份，NaCl 3份，琼脂20份和1000份去离子水，且其pH为7；以重量份计，所述PDA培养基包括：土豆198份、葡萄糖11份、琼脂19份，Na2HPO4 5份和1000份去离子水，且其pH为7.4。
步骤(4)中，利用磷酸氢二钠和氯化钙絮凝，两者的加入量分别为接种培养所得发酵液质量的1.5％和0.6％。压滤、干燥及粉碎的具体方法为：采用板框压滤，然后48℃干燥至含水量25％，旋风分离后利用粉碎机粉碎，过30目筛，即得所述菌粉。
步骤(5)中，复合菌粉与预处理载体的质量比为1：5.5。
试验例
将一块理化性质均一的棕壤随机划分为9小块进行花生种植，其中一小块作为空白对照组，整地时仅施入无机肥(氮钾复合肥，购自郑州吉星化工产品有限公司，用量5kg/亩；过磷酸钙，购自济南群驿化工有限公司，用量6kg/亩)，然后播种；剩余8小块分别施入实施例1～3或对比例1～5的微生物菌剂以及与空白对照组相同量的无机肥，花生品种为花育20号。考察花生根结线虫病的发病率、亩产量和出仁率，结果见表1。
表1.花生种植情况比较
由表1可知，与对照组相比，实施例1～3花生根结线虫发病率低，并且产量高，品质好。对比例1略去步骤(3)，对比例2略去步骤(2)中的花生秧粉，对比例3略去步骤(2)中的松针粉，对比例4略去步骤(4)中的蜡样芽孢杆菌ACCC02368，对比例5略去步骤(4)中的哈茨木霉ACCC30423，根结线虫发病率明显变高，亩产量和出仁率也明显降低。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种防治根结线虫的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)菌种培养：先将花生根系内部的非致病尖孢镰刀菌纯化、培养，得到非致病尖孢镰刀菌菌种，备用；
(2)载体准备：将花生秧粉、松针粉、凹凸棒土加入二甲基亚砜-乙醇混合液中，加热搅拌，过滤，洗涤除去二甲基亚砜，干燥，研磨过筛，灭菌处理，得到载体，备用。
(3)载体预处理：先将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌种无菌接种至PDA培养基中，培养4～5天，然后向其中倒入步骤(2)所得载体，继续搅拌培养10～12天，得到预处理载体，备用；
(4)复合菌粉的制备：先将蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423菌株分别单独进行接种培养、絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到相应的菌粉，同时将步骤(1)所得非致病尖孢镰刀菌菌种也经絮凝、压滤、干燥及粉碎，得到其相应的菌粉，然后将所得菌粉进行混合，得到复合菌粉；
(5)最后将步骤(4)所得复合菌粉与步骤(3)所得预处理载体混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，培养条件为：在25～28℃温度条件下，于121℃灭菌20～30分钟后的平板培养基中培养3～5天。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，花生秧粉、松针粉、凹凸棒土、二甲基亚砜-乙醇混合液的质量体积比约为1g：0.2～0.3g：8～10g：20～22mL，其中，二甲基亚砜-乙醇混合液中两者的体积比为1：0.4～0.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加热搅拌的工艺条件为：70～80℃搅拌5～6小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，培养温度为25～28℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，非致病尖孢镰刀菌种与载体的体积质量比为1μl：30～40mg。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、根瘤菌ACCC01041、凝结芽孢杆菌ACCC00403、哈茨木霉ACCC30423的菌粉与非致病尖孢镰刀菌的菌粉依次以质量比1：0.3～0.4：0.3～0.5：0.2～0.3：0.8～1进行混合。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，蜡样芽孢杆菌ACCC02368、凝结芽孢杆菌ACCC00403接种于肉汁胨培养基，根瘤菌ACCC01041、哈茨木霉ACCC30423菌株接种于PDA培养基，培养4～6天后，分别于170～180r/min摇床培养，各自的培养条件如下：蜡样芽孢杆菌ACCC02368的培养温度为27～29℃，培养时间为40～45小时；凝结芽孢杆菌ACCC00403的培养温度为28～30℃，培养时间为45～48小时；根瘤菌ACCC01041的培养温度为27～29℃，培养时间为40～45小时；哈茨木霉ACCC30423的培养温度为27～29℃，培养时间为72～75小时。
9.一种利用权利要求1～8中任一项所述制备方法得到的一种防治根结线虫的复合微生物菌剂。
10.一种权利要求9所述微生物菌剂在防治根结线虫病中的应用。
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