CN106244467A - 一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基 - Google Patents

一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基 Download PDF

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王根豪
严艺波
李肖宇
吴俊杰
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曾升华
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明提供了一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基，将淡紫拟青霉菌种活化，一级液体培养基中含氮量高，促使淡紫拟青霉菌种集中在菌体的生产上，得到更加强健的菌体。在二级种子液培养基中，强健的菌体可以产生更多的孢子，同时淡紫拟青霉孢子可在二级液体培养基中萌发，进而在固体培养中快速产生大量的菌体，在3.0×1010cfu/g以上。

Description

一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基。
背景技术
线虫可侵袭和寄生植物，被侵袭和寄生的植物因线虫吸收体内营养而影响正常的生长发育，并且线虫代谢的分泌物会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形。大多数植物线虫侵害植物的地下部分，如根、块茎等，根部可表现为结瘤、坏死、根短粗和丛生，导致农作物大量减产或质量严重下降。常见的植物线虫病有根结线虫病、大豆胞囊线虫病、小麦粒线虫病、甘薯茎线虫病、水稻干尖线虫病、柑橘半穿刺线虫病等。
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可有效防治多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。淡紫拟青霉的寄主广、易培养，而且功效高，特别是在控制植物病原线虫方面具有显著功效。半个多世纪以来，国内外的研究学者对淡紫拟青霉进行了广泛而深入的研究，在生物学、生态学、控害效能与田间应用等方面取得了一系列的研究成果，在生物防治上表现出巨大的潜力，市场前景广阔，虽然传统的真菌发酵方法能够实现工业化生产，但是存在发酵时间长，成本高，收率低等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种淡紫拟青霉发酵生产方法，包括以下步骤：
1)将淡紫拟青霉菌种活化；
2)将所述步骤1)得到的活化后的淡紫拟青霉接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中进行一级液体培养，得到淡紫拟青霉一级种子液；
3)将所述步骤2)得到的一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中进行二级液体培养，得到淡紫拟青霉二级种子液；
所述二级液体培养基包括以下质量含量的组分：蔗糖30～50g/L，黄豆粉15～25g/L，硝酸钠1～8g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0g/L，硫酸锌0.18～0.30g/L，硫酸铁0.01～0.08g/L，余量为水；
4)将所述步骤3)得到的二级种子液接种于淡紫拟青霉固体培养基中，进行固体培养，得到淡紫拟青霉。
进一步，所述步骤2)中一级液体培养的条件为：
培养的时间为35～50h，培养的温度为25～30℃，培养的初始pH值为6.0～7.0，接种量为0.5～1.5％；
培养的过程进行通气，具体为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量为15～24m3/h；
培养在黑暗中进行。
进一步，所述步骤3)中二级液体培养的条件为：
培养的时间为55～75h，培养的温度为25～30℃，培养的初始pH值为6.0～7.0，培养的接种量为5～15％；
培养的过程需要通气，具体为：进入培养24h内，通气量为130～170m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h；
培养在搅拌下进行，搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min；
培养在黑暗中进行。
进一步，所述步骤4)中固体培养的条件为：
固体培养的过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度控制为24～28℃，在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为40～50％，环境温度为26℃，6～7d之内环境温度为28～30℃；
所述固体培养28～32h时翻盘散热；
所述固体培养45～55h时将营养液喷洒到菌料上。
进一步，所述营养液包括以下质量含量的组分：5％葡萄糖，0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4；
所述营养液的喷洒量为菌料体积的5～10％。
进一步，所述淡紫拟青霉一级液体培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖30～50g/L，黄豆粉5～15g/L，硝酸钠5～15g/L，磷酸氢二钾1.8～2.2g/L，氯化钾0.25～0.75g/L，硫酸镁0.18～0.30g/L，硫酸铁0.01～0.08g/L，余量为水。
进一步，所述淡紫拟青霉固体培养基包括以下质量含量的组分：麦麸40～60％，玉米粉25～35％，黄豆粉5～15％，谷壳5～13％，硫酸铵0.5～1.5％。
本发明提供了上述方案所述的淡紫拟青霉二级液体培养基，包括以下质量含量的组分：蔗糖10～80g/L，黄豆粉1～30g/L，硝酸钠0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.05～5g/L，硫酸锌0.03～3g/L，硫酸铁0.01～1g/L，余量为水。
本发明提供了一种淡紫拟青霉发酵生产方法，将淡紫拟青霉菌种活化，一级种子液体培养基中含氮量高，促使菌体集中在菌体生产上，得到更加强健的菌体。在二级种子液培养基中，强健的菌体可以产生更多的孢子，同时淡紫拟青霉孢子可在二级液体培养基中萌发，进而在固体培养培养阶段，快速产生大量的菌体，在3.0×1010cfu/g以上。
进一步的，本发明通过温度与湿度梯度化管理来完成产孢子，在刚进行固体培养时，给予高温高湿的环境，让菌丝在固体培养基中迅速适应环境；在密集发酵期即进入发酵第20h～40h时，物料温度将会急速升高，应降低环境温度，防止烧盘，同时在30h左右将发酵料翻动，以便于扇热的同时为菌种更好的提供空气；在产孢阶段，降低房间湿度和温度，有利于促进菌丝产生孢子；在50h左右补液能够给菌丝充足的葡萄糖和无机盐以促进产孢子。
保藏说明
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，于2013年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCCNo.7994。
具体实施方式
本发明提供了一种淡紫拟青霉发酵生产方法，包括以下步骤：
1)将淡紫拟青霉菌种活化；
2)将所述步骤1)得到的活化后的淡紫拟青霉接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中进行一级液体培养，得到淡紫拟青霉一级种子液；
3)将所述步骤2)得到的一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中进行二级液体培养，得到淡紫拟青霉二级种子液；
所述二级液体培养基包括以下质量含量的组分：蔗糖10～80g/L，黄豆粉1～30g/L，硝酸钠0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.05～5g/L，硫酸锌0.03～3g/L，硫酸铁0.01～1g/L，余量为水；
4)将所述步骤3)得到的二级种子液接种于淡紫拟青霉固体培养基中，进行固体培养，得到淡紫拟青霉。
在本发明中，所述淡紫拟青霉优选为选自生物保藏编号为CGMCC No.7994的菌种活化培养得到。
本发明中淡紫拟青霉菌种的活化是将保藏的淡紫拟青霉菌种接种于装有营养琼脂培养基的茄型瓶中，25～30℃培养10～14h进行活化培养。
得到活化的淡紫拟青霉，本发明将所述活化的淡紫拟青霉接种到淡紫拟青霉一级液体培养基中进行淡紫拟青霉一级液体培养，得到淡紫拟青霉一级种子液。
在本发明中，所述一级液体培养的时间优选为35～50h，更优选为40～48h，最有选为43h。所述一级液体培养的温度优选为25～30℃，更优选为26～29℃，最优选为28℃。所述一级液体培养的初始pH值优选6.0～7.0，更优选为6.4～6.8，最优选为6.5。所述一级液体培养的接种量优选为0.5～1.5％，更优选为0.8～1.2％，最优选为1.0％。
在本发明中，在一级液体培养的过程进行通气，具体优选为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量为15～24m3/h；更优选为：进入培养24h内，通气量为12～18m3/h，培养24h后，通气量为18～22m3/h；最优选为：进入培养24h内，通气量为15m3/h，培养24h后，通气量为20m3/h。本发明对所述通气的设备没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的通气设备即可，如通风机。
在本发明中，所述一级液体培养在黑暗条件下进行培养。本发明对提供黑暗条件的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的提供黑暗条件的方法即可。
在本发明中，所述淡紫拟青霉一级液体培养基优选包括以下质量含量的组分：葡萄糖30～50g/L，黄豆粉5～15g/L，硝酸钠5～15g/L，磷酸氢二钾1.8～2.2g/L，氯化钾0.25～0.75g/L，硫酸镁0.18～0.30g/L，硫酸铁0.01～0.08g/L，余量为水；更优选为葡萄糖35～45g/L，黄豆粉8～12g/L，硝酸钠8～12g/L，磷酸氢二钾1.9～2.15g/L，氯化钾0.35～0.65g/L，硫酸镁0.20～0.26g/L，硫酸铁0.03～0.07g/L，余量为水；最优选为葡萄糖40g/L，黄豆粉10g/L，硝酸钠10g/L，磷酸氢二钾2.06g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁0.24g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。本发明对上述药品的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员常规用于制备培养基的药品即可。
得到淡紫拟青霉一级种子液后，本发明将所述一级淡紫拟青霉一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中进行淡紫拟青霉二级液体培养，得到淡紫拟青霉二级种子液。
在本发明中，所述淡紫拟青霉二级液体培养的时间优选为55～75h，更优选为60～70h，最优选为65h；所述二级液体培养的温度优选为25～30℃，更优选为26～29℃，最优选为28℃；所述二级液体培养的初始pH值优选为6.0～7.0，更优选为6.3～6.7，最优选为6.5；所述二级液体培养的接种量优选为5～15％，更优选为8～12％，最优选为10％。
在本发明中，在二级液体培养过程通入空气，具体优选为进入培养24h内，通气量为130～170m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h；更优选为进入培养24h内，通气量为140～160m3/h，培养24h后，通气量为210～250m3/h；最优选为进入培养24h内，通气量为150m3/h，培养24h后，通气量为230m3/h。本发明对所述通气的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的通气设备即可，如通风机。
在本发明中，所述二级液体培养需要在搅拌下进行，搅拌的频率优选为1～2次/h，更优选为2次/h；每次搅拌的时间优选为10～20min，更优选为12～18min，最优选为15min。本发明对所述搅拌的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌设备即可。
在本发明中，所述二级液体培养在黑暗条件下进行培养。本发明对提供黑暗条件的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的提供黑暗条件的方法即可。
在本发明中，所述二级液体培养基优选包括以下质量含量的组分：蔗糖10～80g/L，黄豆粉1～30g/L，硝酸钠0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.05～5g/L，硫酸锌0.03～3g/L，硫酸铁0.01～1g/L，余量为水；更优选为蔗糖25～60g/L，黄豆粉8～22g/L，硝酸钠3～15g/L，磷酸氢二钾0.5～3g/L，硫酸锌0.1～2g/L，硫酸铁0.03～0.07g/L，余量为水；最优选为蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.24g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。本发明对上述药品的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员常规用于制备培养基的药品即可。
得到淡紫拟青霉二级种子液后，本发明将得到的淡紫拟青霉二级种子液接种于淡紫拟青霉固体培养基中，进行固体培养，得到淡紫拟青霉。
在本发明中，所述淡紫拟青霉固体培养的接种量优选为5～15％，更优选为8～12％，最优选为10％。在本发明中，所述淡紫拟青霉固体培养基的初始含水量优选为30～70％，更优选为40～60％，最优选为50％。在本发明中，所述固体培养的培养基厚度优选为1～6cm，更优选为2～4cm，最优选为3cm。
在本发明中，所述淡紫拟青霉固体培养的过程温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体优选为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度控制为24～28℃，在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为40～50％，环境温度为26℃，6～7d之内环境温度为28～30℃；更优选为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为85％，环境温度为26℃，菌料温度控制为26℃，在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为45％，环境温度为26℃，6～7d之内环境温度为29℃，环境湿度为自然条件下的湿度。
在本发明中，所述淡紫拟青霉固体培养优选在28～32h时翻盘散热，更优选为29～31h，最优选为30h。
在本发明中，所述淡紫拟青霉固体培养优选在45～55h时将营养液喷洒到菌料上，更优选为48～52h，最优选为50h。所述营养液的喷洒量优选为菌料体积的5～10％，更优选为6～9％，最优选为8％。本发明对喷洒营养液的设备没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的喷洒设备即可。
在本发明中，所述营养液优选包括以下质量含量的组分：5％葡萄糖，0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4。本发明对上述药品的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用的药品即可。
在本发明中，所述淡紫拟青霉固体培养基优选包括以下质量含量的组分：麦麸40～60％，玉米粉25～35％，黄豆粉5～15％，谷壳5～13％，硫酸铵0.5～1.5％；更优选为麦麸45～55％，玉米粉27～32％，黄豆粉8～12％，谷壳7～11％，硫酸铵0.8～1.2％；最优选为麦麸50％，玉米粉30％，黄豆粉10％，谷壳9％，硫酸铵1％。本发明对上述原料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员常规配置培养基的原料即可。
所述固体培养后，本发明优选对得到孢子粉的进行收集，得到淡紫拟青霉孢子。在本发明实施例中，所述孢子粉的收集具体采用微生物固态发酵真菌孢子分离设备的仪器进行。所述微生物固态发酵真菌孢子分离设备的仪器购自江西天人生态股份有限公司。
本发明提供了上述方案所述的淡紫拟青霉二级液体培养基，包括以下质量含量的组分：蔗糖10～80g/L，黄豆粉1～30g/L，硝酸钠0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.05～5g/L，硫酸锌0.03～3g/L，硫酸铁0.01～1g/L，余量为水；更优选为蔗糖25～60g/L，黄豆粉8～22g/L，硝酸钠3～15g/L，磷酸氢二钾0.5～3g/L，硫酸锌0.1～2g/L，硫酸铁0.03～0.07g/L，余量为水；最优选为蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.24g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。本发明对上述药品的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员常规用于制备培养基的药品即可。
在本发明中，所述淡紫拟青霉二级液体培养基优选经120～130℃灭菌30～45min后使用。在本发明中，所述灭菌温度更优选为125℃；所述灭菌时间更优选为40min。本发明对所述灭菌的设备没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌设备即可，如高压蒸汽灭菌锅。
在本发明中，所述淡紫拟青霉二级液体培养基中的碳氮比适宜，使一级液体培养基生长出的强健菌体产生更多的淡紫拟青霉孢子，同时淡紫拟青霉孢子可在二级液体培养基中萌发，进而可在固体培养阶段产生大量的菌体。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
淡紫拟青霉一级种子液的制备：将保藏的淡紫拟青霉菌种接种于装有营养琼脂培养基的茄型瓶中，28℃培养12h进行活化培养，完成菌种活化；活化后的淡紫拟青霉菌种按照1％的接种量接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中，一级液体培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖40g/L，黄豆粉10g/L，硝酸钠10g/L，磷酸氢二钾2.06g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁0.24g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。淡紫拟青霉一级液体培养的温度为28℃，初始pH值为6.8，进入培养24h内按照15m3/h通气量进行通气培养，液体培养24h后按照20m3/h的通气量进行通气培养，黑暗培养43h后，停止培养，得到淡紫拟青霉一级种子液。
淡紫拟青霉二级种子液的制备：将得到的淡紫拟青霉一级种子液以10％接种量接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中，二级液体培养基包括以下质量含量的组分：蔗糖40g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.24g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。二级液体培养的温度为28℃，pH值为6.5，进入培养24h内，通气量为150m3/h，培养24h后，通气量为230m3/h，每小时搅拌2次，每次搅拌时间为15min，黑暗培养65h后，停止培养，得到淡紫拟青霉二级种子液。
淡紫拟青霉的固体培养：将得到的淡紫拟青霉二级种子液以10％的接种量接种于淡紫拟青霉固体培养基中，固体培养基包括以下质量含量的组分：麦麸50％，玉米粉30％，黄豆粉10％，谷壳9％，硫酸铵1％。淡紫拟青霉固体培养基的初始含水量为50％，固体培养第1d环境温度为28℃，物料温度为24℃，环境湿度在90％下进行培养；固体培养第2d环境温度为24℃，菌料温度为28℃，环境湿度在85％下进行培养，在培养30h时进行翻盘；固体培养第3d环境温度为26℃，物料温度为28℃，环境湿度在80％下进行培养，在培养50h时将5％葡萄糖、0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4的营养液喷洒到菌料上；固体培养第4d环境温度为26℃，环境湿度在50％下进行培养；固体培养第5d环境温度为26℃，环境湿度在40％下进行培养；固体培养第6d环境温度为28℃，环境湿度在自然条件下进行培养；固体培养第7d环境温度为30℃，环境湿度在自然条件下进行培养，固体培养7d后，停止培养，得到的淡紫拟青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
将固体培养后的菌料采用微生物固态培养真菌孢子分离设备收集淡紫拟青霉孢子，将收集的孢子在显微镜下观察孢子形态，以确定为淡紫拟青霉孢子。
实施例2
淡紫拟青霉一级种子液的制备：将保藏的淡紫拟青霉菌种接种于装有营养琼脂培养基的茄型瓶中，28℃培养10h进行活化培养，完成菌种活化；活化后的淡紫拟青霉菌种按照0.5％的接种量接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中，一级液体培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖30g/L，黄豆粉15g/L，硝酸钠15g/L，磷酸氢二钾2.2g/L，氯化钾0.25g/L，硫酸镁0.18g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。淡紫拟青霉一级液体培养的温度为28℃，初始pH值为7.0，进入培养24h内按照15m3/h通气量进行通气培养，液体培养24h后按照20m3/h的通气量进行通气培养，黑暗培养45h后，停止培养，得到淡紫拟青霉一级种子液。
淡紫拟青霉二级种子液的制备：将得到的淡紫拟青霉一级种子液以5％接种量接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中，二级液体培养基包括以下质量含量的组分：蔗糖50g/L，黄豆粉20g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.30g/L，硫酸铁0.08g/L，余量为水。二级液体培养的温度为28℃，pH值为6.8，进入培养24h内，通气量为150m3/h，培养24h后，通气量为230m3/h，每小时搅拌1次，每次搅拌时间为10min，黑暗培养75h后，停止培养，得到淡紫拟青霉二级种子液。
淡紫拟青霉的固体培养：将得到的淡紫拟青霉二级种子液以15％的接种量接种于淡紫拟青霉固体培养基中，固体培养基包括以下质量含量的组分：麦麸60％，玉米粉25％，黄豆粉15％，谷壳13％，硫酸铵1.5％。淡紫拟青霉固体培养基的初始含水量为50％，固体培养第1d环境温度为28℃，菌料温度为24℃，环境湿度在90％下进行培养；固体培养第2d环境温度为24℃，物料温度为28℃，环境湿度在85％下进行培养，在培养30h时进行翻盘；固体培养第3d环境温度为26℃，物料温度为28℃，环境湿度在80％下进行培养，在培养50h时将5％葡萄糖、0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4的营养液喷洒到菌料上；固体培养第4d环境温度为26℃，环境湿度在50％下进行培养；固体培养第5d环境温度为26℃，环境湿度在40％下进行培养；固体培养第6d环境温度为28℃，环境湿度在自然条件下进行培养；固体培养第7d环境温度为30℃，环境湿度在自然条件下进行培养，固体培养7d后，停止培养，得到的淡紫拟青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
将固体培养后的菌料采用微生物固态培养真菌孢子分离设备收集淡紫拟青霉孢子，将收集的孢子在显微镜下观察孢子形态，以确定为淡紫拟青霉孢子。
实施例3
淡紫拟青霉一级种子液的制备：将保藏的淡紫拟青霉菌种接种于装有营养琼脂培养基的茄型瓶中，28℃培养12h进行活化培养，完成菌种活化；活化后的淡紫拟青霉菌种按照1.5％的接种量接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中，一级液体培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖50g/L，黄豆粉15g/L，硝酸钠5g/L，磷酸氢二钾1.8g/L，氯化钾0.75g/L，硫酸镁0.18g/L，硫酸铁0.05g/L，余量为水。淡紫拟青霉一级液体培养的温度为28℃，初始pH值为6.5，进入培养24h内按照15m3/h通气量进行通气培养，液体培养24h后按照20m3/h的通气量进行通气培养，黑暗培养45h后，停止培养，得到淡紫拟青霉一级种子液。
淡紫拟青霉二级种子液的制备：将得到的淡紫拟青霉一级种子液以15％接种量接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中，二级液体培养基包括以下质量含量的组分：蔗糖30g/L，黄豆粉25g/L，硝酸钠8g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸锌0.30g/L，硫酸铁0.08g/L，余量为水。二级液体培养的温度为28℃，pH值为6.5，进入培养24h内，通气量为150m3/h，培养24h后，通气量为200m3/h，每小时搅拌2次，每次搅拌时间为10min，黑暗培养65h后，停止培养，得到淡紫拟青霉二级种子液。
淡紫拟青霉的固体培养：将得到的淡紫拟青霉二级种子液以20％的接种量接种于淡紫拟青霉固体培养基中，固体培养基包括以下质量含量的组分：麦麸50％，玉米粉35％，黄豆粉15％，谷壳9％，硫酸铵0.5％。淡紫拟青霉固体培养基的初始含水量为50％，固体培养第1d环境温度为28℃，菌料温度为24℃，环境湿度在90％下进行培养；固体培养第2d环境温度为24℃，物料温度为28℃，环境湿度在85％下进行培养，在培养31h时进行翻盘；固体培养第3d环境温度为26℃，物料温度为28℃，环境湿度在80％下进行培养，在培养52h时将5％葡萄糖、0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4的营养液喷洒到菌料上；固体培养第4d环境温度为26℃，环境湿度在50％下进行培养；固体培养第5d环境温度为26℃，环境湿度在40％下进行培养；固体培养第6d环境温度为28℃，环境湿度在自然条件下进行培养；固体培养第7d环境温度为30℃，环境湿度在自然条件下进行培养，固体培养7d后，停止培养，得到的淡紫拟青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
将固体培养后的菌料采用微生物固态培养真菌孢子分离设备收集淡紫拟青霉孢子，将收集的孢子在显微镜下观察孢子形态，以确定为淡紫拟青霉孢子。
由以上实施例可知，在淡紫拟青霉一级种子液制备中以高的含氮量，促使菌种集中在菌体生产上，生长出更加强健的菌体，在淡紫拟青霉二级种子液产生中，适宜的碳氮比产生强健的菌丝，可以产生更多的孢子，同时孢子可在菌液中萌发，使得在固体培养阶段产生大量的菌体，最终得到的淡紫拟青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种淡紫拟青霉发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将淡紫拟青霉菌种活化；
2)将所述步骤1)得到的活化后的淡紫拟青霉接种于淡紫拟青霉一级液体培养基中进行一级液体培养，得到淡紫拟青霉一级种子液；
3)将所述步骤2)得到的一级种子液接种于淡紫拟青霉二级液体培养基中进行二级液体培养，得到淡紫拟青霉二级种子液；
所述二级液体培养基包括以下质量含量的组分：蔗糖10～80g/L，黄豆粉1～30g/L，硝酸钠0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.05～5g/L，硫酸锌0.03～3g/L，硫酸铁0.01～1g/L，余量为水；
4)将所述步骤3)得到的二级种子液接种于淡紫拟青霉固体培养基中，进行固体培养，得到淡紫拟青霉。
2.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤2)中一级液体培养的条件为：
培养的时间为35～50h，培养的温度为25～30℃，培养的初始pH值为6.0～7.0，接种量为0.5～1.5％；
培养的过程进行通气，具体为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量为15～24m3/h；
培养在黑暗中进行。
3.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤3)中二级液体培养的条件为：
培养的时间为55～75h，培养的温度为25～30℃，培养的初始pH值为6.0～7.0，培养的接种量为5～15％；
培养的过程需要通气，具体为：进入培养24h内，通气量为130～170m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h；
培养在搅拌下进行，搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min；
培养在黑暗中进行。
4.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述步骤4)中固体培养的条件为：
固体培养的过程进行温度和湿度的控制，所述温度和湿度的控制程序具体为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度为80～90％，环境温度为24～28℃，菌料温度控制为24～28℃，在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为40～50％，环境温度为26℃，6～7d之内环境温度为28～30℃；
所述固体培养28～32h时翻盘散热；
所述固体培养45～55h时将营养液喷洒到菌料上。
5.根据权利要求4所述的发酵生产方法，其特征在于，所述营养液包括以下质量含量的组分：5％葡萄糖，0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4；
所述营养液的喷洒量为菌料体积的5～10％。
6.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述淡紫拟青霉一级液体培养基包括以下质量含量的组分：葡萄糖30～50g/L，黄豆粉5～15g/L，硝酸钠5～15g/L，磷酸氢二钾1.8～2.2g/L，氯化钾0.25～0.75g/L，硫酸镁0.18～0.30g/L，硫酸铁0.01～0.08g/L，余量为水。
7.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述淡紫拟青霉固体培养基包括以下质量含量的组分：麦麸40～60％，玉米粉25～35％，黄豆粉5～15％，谷壳5～13％，硫酸铵0.5～1.5％。
8.淡紫拟青霉二级液体培养基，包括以下质量含量的组分：蔗糖10～80g/L，黄豆粉1～30g/L，硝酸钠0.1～20g/L，磷酸氢二钾0.05～5g/L，硫酸锌0.03～3g/L，硫酸铁0.01～1g/L，余量为水。
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