CN107586730A - 一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法 - Google Patents
一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，包括以下步骤：菌体分离培养、一级种子平板培养、二级种子固体培养、稳定处理、三级种子固体培养、规模固体培养；所述二级种子固体培养，将麸皮和玉米粉按10‑1:1的比例混合得料，水和料按1：1‑10比例混合，灭菌，接种孢子悬浮液，待料表面全部变白后，3天翻料一次，移入室温条件下继续培养10d；所述稳定处理：将二级种子放入恒温箱，以0.5‑1℃的升温速率升温至28℃，然后以0.5‑1℃的降温速率降温至‑4℃，再升温至25℃；本发明所述的生产方法得到的一种淡紫拟青霉菌剂，有效孢子量为2.0‑2.2×108cfu/g，杂菌率≤0.1%，脱落率≤3%。
Description
技术领域
本发明属于微生物农业技术领域，涉及一种淡紫拟青霉菌剂的培养方法，具体涉及一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法。
背景技术
淡紫拟青霉作为一种生物防治菌剂，在防治蔬菜、水果花卉的根结线虫病和青枯病、黄枯萎病、根腐病等根部死棵病方面效果非常优秀。
市场销售上的淡紫拟青霉菌剂采用液体发酵培养和固体吸附烘干的生产方法，虽然生产菌剂的纯度和孢子含量很高，但是生产成本和销售价格以及每亩土地的防治成本也很高，致使淡紫拟青霉菌剂难以推广。
发明内容
本发明针对以上不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法。本发明可以实现以下发明目的：
本发明的生产方法简单，生产成本极低，纯度和孢子含量高，杂菌少，脱落率低，稳定性高，在蔬菜和花卉方面的应用效果显著。
为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法包括以下步骤：菌体分离培养、一级种子平板培养、二级种子固体培养、稳定处理、三级种子固体培养、规模固体培养。
一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法包括以下步骤：
1）菌体分离培养：用淡紫拟青霉菌株在PDA培养基上培养，并进行转管培养；
2）一级种子平板培养：向转管培养后的菌种管中加入含吐温80的无菌水，制成孢子悬浮液，吸取孢子悬浮液接到PDA平板培养基上在温箱里培养；
3）二级种子固体培养：将麸皮和玉米粉混合得料，水和料混合，灭菌；接种孢子悬浮液后培养，待料表面全部变白后，移入室温条件下继续培养；
4）稳定处理：将二级种子放入恒温箱，以0.5-1℃的升温速率升温至28℃，然后以0.5-1℃的降温速率降温至-4℃，再升温至25℃；
5）三级种子固体培养：将二级种子菌种和水、料混合，连续培养 2-10天；
6）规模固体培养：所述的规模培养，包括培养料的准备、混合方法、平面培养和粉粹包装。
作为本发明优选的技术方案，所述稳定处理，将二级种子放入恒温箱，22℃保持45min后，以0.5-1℃的升温速率升温至28℃，恒温40min，然后以0.5-1℃的降温速率降温至-4℃，恒温15min，再以1.5-2℃的升温速率升温至25℃，保持恒温。
作为本发明优选的技术方案，其特征在于，所述二级种子固体培养，将麸皮和玉米粉按10-1:1的比例混合得料，水和料按1：1-10比例混合，灭菌；接种孢子悬浮液，置于25℃温箱培养，待料表面全部变白后，3天翻料一次，移入室温条件下继续培养10d。
作为本发明优选的技术方案，所述三级种子固体培养，将麸皮和玉米粉按10-1:1的比例混合，二级种子淡紫拟青霉菌种和水、料按1：10-100:1-100的比例混合，然后将培养料铺在瓷盘上，在室温条件下培养，控制好温度，连续培养 2-10天，然后封闭阴干后粉粹，包装存放。
作为本发明优选的技术方案，所述三级种子固体培养，培养料铺在瓷盘上的厚度为1-10cm。
作为本发明优选的技术方案，所述平面培养，将混合后的培养料摊铺在平整的地面上，厚度为1-10cm，在18-28℃条件下进行发酵培养；1天后和培养基干燥结块，在培养基内布满白色菌丝后翻动一次，连续培养2-10天后，进行通风阴干。
作为本发明优选的技术方案，所得到的一种淡紫拟青霉菌剂，有效孢子量为2.0-2.2×108cfu/g，杂菌率≤0.1%，脱落率≤3%。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
（1）本发明生产的淡紫拟青霉菌剂的有效孢子量为2.0-2.2×108cfu/g，杂菌率≤0.1%，脱落率≤3%。在本发明生产的淡紫拟青霉菌剂高效、低毒，杀虫效果稳定，且对人畜和作物安全，安全性高。
（2）本发明的生产方法工艺简单，生产成本极低，纯度和孢子含量高，具有很高的经济价值和社会价值。
具体实施方式
实施例1一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法
本发明提供了一种生产工艺简单，生产成本极低，纯度和孢子含量高的淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，本发明的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，包括以下步骤：
1、菌体分离培养
用常规组织分离法分离出淡紫拟青霉菌株，在PDA培养基上进行培养，并进行转管培养。
2、一级种子平板培养
向转管培养后的菌种管中加入含有少量吐温80的无菌水，制成孢子悬浮液；
吸取1ml孢子悬浮液接到PDA平板培养基上，在25℃的温箱里培养15d。
3、二级种子固体培养
将麸皮和玉米粉按10-1:1的比例混合得料，水和料按1：1-10比例混合，装到罐头瓶子的1/3处，大约50g左右，灭菌；
在每瓶中加入10ml步骤2中配制好的孢子悬浮液，置于25℃温箱培养，待料表面全部变白后，3天翻料一次，移入室温条件下继续培养10d。
4、稳定处理
将步骤3制备的二级种子放入恒温箱，22℃保持45min后，以0.5-1℃的升温速率升温至28℃，恒温40min，然后以0.5-1℃的降温速率降温至-4℃，恒温15min，再以1.5-2℃的升温速率升温至25℃，保持恒温备用；
在实际操作中发明人发明采用上述稳定处理后，二级种子菌体的稳定性明显提高，制备的二级种子中活菌含量60天内不减少。
5、三级种子固体培养
将麸皮和玉米粉按10-1:1的比例混合，二级种子菌种或者购买成品菌种或者购买的商品淡紫拟青霉菌剂和水、料按1：10-100:1-100的比例混合，然后将培养料铺在瓷盘上，厚度1-10cm，在室温条件下培养，控制好温度，连续培养 2-10天，然后封闭阴干后粉粹，包装存放。
6、规模固体培养
①培养料的准备
培养料一：麸皮：玉米粉以10-1:1比例；
培养料二：烘干木薯渣：麸皮：玉米粉按10-1:10-1:1比例。
②混合方法
先将制作的三级种子菌种或者购买成品菌种或者购买的商品淡紫拟青霉菌剂与玉米粉按照1:5-100的比例搅拌混合，然后再与麸皮、木薯渣搅拌混合，混合后在加入适量的水，再进行搅拌混合。
③平面培养
将混合后的培养料摊铺在平整的地面上，厚度为1-10cm，在室温条件下（18-28℃）进行发酵培养；1天后和培养基干燥结块，在培养基内布满白色菌丝后翻动一次，连续培养2-10天后，进行通风阴干。
④粉粹包装
将发酵好的淡紫拟青霉菌块用粉粹机粉粹，粉粹后将菌粉平铺在地面上，厚度1-20cm，进行散热和阴干，得到本发明所述的淡紫拟青霉菌剂；阴干后装袋避光储存或销售。
按照本发明实施例1所述的生产方法生产的淡紫拟青霉菌剂的有效孢子量为2.0-2.2×108cfu/g，杂菌率≤0.1%，脱落率≤3%。在本发明生产的淡紫拟青霉菌剂高效、低毒，杀虫效果稳定，且对人畜和作物安全，安全性高。
实施例2本发明生产的淡紫拟青霉菌剂在黄瓜种植中的应用
在实际生产应用中，发明人发现：在连续2年以上种植黄瓜的田块中，黄瓜生长中后期，生长缓慢，果实严重偏小，畸形率高，经检测，普遍存在重茬导致的黄瓜根的根尖腐烂以及根尖不长病症；
将黄瓜种植区随机分为等面积的3个区域，每个区域50株；
1区对应施用本发明实施例1的淡紫拟青霉菌剂，将本发明的淡紫拟青霉菌剂溶于水灌根施用，施用量为每株植物2g菌剂，每7天施用一次，共施用3次；
2区对应施用对比例的淡紫拟青霉菌剂，所述的对比例为制备方法与本发明的实施例1相同，区别在于仅没有实施例1中步骤4即稳定步骤，其他都相同，所制备的淡紫拟青霉菌剂；将对比例1的淡紫拟青霉菌剂溶于水灌根施用，施用量为每株植物2g菌剂，每7天施用一次，共施用3次；
3区为对照组施用等量水；
20天后，测定具体效果见表1：
表1黄瓜的试验效果
所述的治愈率按治愈黄瓜的株数计算；
由表1可见，实施例的结果最佳，本发明淡紫拟青霉菌剂对黄瓜重茬引起的根尖腐烂、根尖不长和果实畸形有明显治疗作用，效果显著，使用后主根长度明显增长1.2-2.4cm，果实直径明显增长1.52-2.81 cm；根尖腐烂治愈率为94.1%，根尖不长治愈率为91.7%。
在实际操作过程中，发明人发现：施用本发明淡紫拟青霉菌剂后，黄瓜产量提高18-20%，同时，黄瓜果实的维生素C的含量提高0.5-0.8%。
本发明生产的淡紫拟青霉菌剂在其他蔬菜、水果花卉中也有较为明显的效果，对根结线虫病和青枯病、黄枯萎病等根部死棵病方面效果非常优秀。
本发明的发明人长期从事微生物菌剂的研发工作，特别是对植物种植中相关微生物菌剂开发，有独特的见解，并取得了显著的效果，攻克了本领域的瓶颈问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数，本发明所述的比例，均为质量比例。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法包括以下步骤：菌体分离培养、一级种子平板培养、二级种子固体培养、稳定处理、三级种子固体培养、规模固体培养。
2.一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法包括以下步骤：
1）菌体分离培养：用淡紫拟青霉菌株在PDA培养基上培养，并进行转管培养；
2）一级种子平板培养：向转管培养后的菌种管中加入含吐温80的无菌水，制成孢子悬浮液，吸取孢子悬浮液接到PDA平板培养基上在温箱里培养；
3）二级种子固体培养：将麸皮和玉米粉混合得料，水和料混合，灭菌；接种孢子悬浮液后培养，待料表面全部变白后，移入室温条件下继续培养；
4）稳定处理：将二级种子放入恒温箱，以0.5-1℃的升温速率升温至28℃，然后以0.5-1℃的降温速率降温至-4℃，再升温至25℃；
5）三级种子固体培养：将二级种子菌种和水、料混合，连续培养 2-10天；
6）规模固体培养：所述的规模培养，包括培养料的准备、混合方法、平面培养和粉粹包装。
3.根据权利要求2所述的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述稳定处理，将二级种子放入恒温箱，22℃保持45min后，以0.5-1℃的升温速率升温至28℃，恒温40min，然后以0.5-1℃的降温速率降温至-4℃，恒温15min，再以1.5-2℃的升温速率升温至25℃，保持恒温。
4.根据权利要求2所述的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述二级种子固体培养，将麸皮和玉米粉按10-1:1的比例混合得料，水和料按1：1-10比例混合，灭菌；接种孢子悬浮液，置于25℃温箱培养，待料表面全部变白后，3天翻料一次，移入室温条件下继续培养10d。
5.根据权利要求2所述的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述三级种子固体培养，将麸皮和玉米粉按10-1:1的比例混合，二级种子淡紫拟青霉菌种和水、料按1：10-100:1-100的比例混合，然后将培养料铺在瓷盘上，在室温条件下培养，控制好温度，连续培养 2-10天，然后封闭阴干后粉粹，包装存放。
6.根据权利要求2所述的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述三级种子固体培养，培养料铺在瓷盘上的厚度为1-10cm。
7.根据权利要求2所述的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所述平面培养，将混合后的培养料摊铺在平整的地面上，厚度为1-10cm，在18-28℃条件下进行发酵培养；1天后和培养基干燥结块，在培养基内布满白色菌丝后翻动一次，连续培养2-10天后，进行通风阴干。
8.根据权利要求2所述的一种淡紫拟青霉菌剂的固体培养生产方法，其特征在于，所得到的一种淡紫拟青霉菌剂，有效孢子量为2.0-2.2×108cfu/g，杂菌率≤0.1%，脱落率≤3%。
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