CN103497920A - 一种用于防治枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌菌剂，包括枯草芽孢杆菌A-22.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/mL；枯草芽孢杆菌F-52.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/mL；解淀粉芽孢杆菌ZR-11.0×10⁸-2.0×10¹⁰cfu/mL；解淀粉芽孢杆菌ZR-81.0×10⁸-2.0×10¹⁰cfu/mL；总菌数为2×10¹⁰-4×10¹⁰cfu/mL。本发明用于防治植物枯萎病，能够防治植物病害，促进植物根、叶生长和改良土壤，使农作物增产。

Description

一种用于防治枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于防治枯萎病的芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用，属于微生物制剂领域。

背景技术

植物枯萎病作为农业生产中常见的植物土传病害，具有发生面积广、发病时间短、危害程度大、防治难度高等特点，其致病菌可以在土壤环境中存活多年，抗逆性非常强。植物枯萎病给全世界的农业种植产生了严重危害，给农业生产带来了巨大的经济损失，广大植病工作者也一直在进行防治植物枯萎病的相关研究，试图寻找到一种安全、高效的防治方法。

目前植物枯萎病主要通过选育抗病作物品种、农业防治、化学防治和生物防治等方法进行。近年来，化学农药的使用带来的危害已被人们所熟知，生物防治越来越被人们接受以及重视。近些年出现了许多生防制剂产品，包括细菌源农药、真菌源农药、农药抗生素等。细菌源农药应用最为广泛，尤其是芽孢杆菌，作为生防材料主要是利用它的强有力的竞争作用，从整体上讲，许多生防芽孢杆菌不仅能防病而且有促进植物生长和增产作用。但是现有生防制剂普遍也存在以下几方面问题，1、生防制剂效果的稳定性较差；2、生防菌剂的有效保质期短；3、生防菌剂的生产技术问题，包括菌剂易污染、发酵条件严格、产品的剂型及产品的检测技术等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供了一种芽孢杆菌菌剂，用于防治植物枯萎病。本发明还公开了该菌剂的制备方法和应用。

本发明从28个不同属、种中筛选出最佳稳定共生菌种组合，通过单独培养筛选高产菌种。筛选出的菌种为枯草芽孢杆菌A-2（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌F-5（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌ZR-1（Bacillus amyloliquefaciens）、解淀粉芽孢杆菌ZR-8（Bacillus amyloliquefaciens）。

根据上述筛选结果，本发明提出了一种芽孢杆菌菌剂，包括：

优选地，所述芽孢杆菌菌剂由如下组分组成：

更进一步优选，所述芽孢杆菌菌剂由如下组分组成：

本发明所述的枯草芽孢杆菌A-2（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌F-5（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌ZR-1（Bacillusamyloliquefaciens）、解淀粉芽孢杆菌ZR-8（Bacillus amyloliquefaciens）均为北京沃土天地生物科技有限公司已售的，本领域技术人员可购买的产品。

本发明还提供了所述芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20℃-37℃条件下，培养1-3天，使菌种活化；

2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，20℃-37℃条件下，100-200r/min摇床培养2-3天，单菌种液体培养OD₆₀₀值达到2.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；

3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-20%的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，20℃-37℃条件下，搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.5-1.5，培养2-3天，制得二级种子；

4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5-20%的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。

其中，在步骤1)中所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；在步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基。

其中，在步骤2）中，所述OD₆₀₀值优选为2.0-2.5；在步骤3）中，通气量优选为1：0.6-1.0；

步骤4）所述液体培养基的配方按质量百分比为：糖蜜5-10%、豆饼粉2-10%、蛋白胨1.0-5%、磷酸氢二钾1-1.5‰，余量为水。

在步骤4）中，所述的高密度发酵培养可以采用补料分批培养（FBC）方式，其中补料碳源为：葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的一种或两种以上；氮源为：豆饼粉和/或蛋白胨。

在步骤4）中，所述混合发酵培养的过程中需要分阶段调控发酵pH、溶解氧、搅拌转速和温度。具体地说，混合发酵培养为有氧培养：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件下发酵，通气量1：1-1.5，调控发酵溶解氧10-15%，搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间2-3小时，搅拌1-3分钟，温度25-35℃。

本发明所述芽孢杆菌菌剂可作为生防制剂用于防治植物枯萎病。

本发明用于防治植物枯萎病，能够防治植物病害，促进植物根、叶生长和改良土壤，使农作物增产。同时，本发明所得复合菌剂稳定性优异，保质期长，在6个月时，有效防护仍能达到48%以上，适合农业推广。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

芽孢杆菌菌剂的构成：

上述芽孢杆菌菌剂的制备方法如下：

1).斜面培养：枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，37℃条件下培养1天，使菌种活化；

2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8在37℃条件下150r/min摇床培养1天，待各菌悬液光密度OD₆₀₀值均达到2.5时停止培养，制得一级种子；

3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10%的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，37℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为1：1，培养2天，制得二级种子；

4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10%的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。

其中，步骤1)中所用的固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：具体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。

步骤2）、步骤3）中所用的液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基：具体培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，琼脂15-20g，pH7.0-7.2。

其中，步骤4）所用的液体培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖10%、豆饼粉4.5%、蛋白胨3%、磷酸氢二钾1.5‰，余量为水；

步骤4）中，高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、蔗糖、糖蜜；氮源为：豆饼粉、蛋白胨。

步骤4）中，混合发酵培养阶段：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.2，调控发酵溶解氧10%，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。

实施例2

芽孢杆菌菌剂的构成：

上述芽孢杆菌菌剂的制备方法如下：

1).斜面培养：枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，37℃条件下培养1天，使菌种活化；

2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8在37℃条件下200r/min摇床培养1天，待各菌悬液光密度OD₆₀₀值均达到3.5时停止培养，制得一级种子；

3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为20%的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，37℃条件下，搅拌速度为100r/min，通气量为1：1，培养2天，制得二级种子；

4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10%的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。

其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基均与实施例1中相应的培养基配方相同。

其中，步骤4）所用的液体培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖10%、豆饼粉4.5%、蛋白胨3%、磷酸氢二钾1.5‰，余量为水；

高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、蔗糖、糖蜜；氮源为：豆饼粉、蛋白胨。

发酵培养阶段：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.2，调控发酵溶解氧10%，搅拌转速180r/min，搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃。

实施例3

芽孢杆菌菌剂的构成：

上述芽孢杆菌菌剂的制备方法如下：

1).斜面培养：枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20℃条件下培养3天，使菌种活化；

2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8在20℃条件下200r/min摇床培养1天，待各菌悬液光密度OD₆₀₀值均达到2.0时停止培养，制得一级种子；

3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5%的接种量，将一级种子分别接种到100L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为60L，20℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为1：0.6，培养3天，制得二级种子；

4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15%的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。

其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基均与实施例1中相应的培养基配方相同。

其中，步骤4）所用的液体培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖5%、豆饼粉8%、蛋白胨2%、磷酸氢二钾1‰，余量为水；

高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖；氮源为：蛋白胨。

发酵培养阶段：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1，调控发酵溶解氧5%，搅拌转速200r/min，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，温度25℃。

实验例1对作物种子萌发的影响

供试西瓜品种：京欣西瓜

供试茄子品种：鲁茄1号

供试棉花品种：美国33B

方法：选取籽粒饱满的供试作物种子，用浓度15%的H₂O₂溶液或浓度为5‰的NaClO溶液进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次。分别取一定数量的作物种子放入实施例1得到的芽孢杆菌菌剂中浸种6h，取事先灭菌的培养皿，在底部铺一层脱脂棉，在上面均匀放置20粒作物种子，再覆盖一层脱脂棉，向其中滴加清水将脱脂棉全部浸湿，置于25℃条件下暗培养，以在清水中浸种的作物种子为对照，待对照中作物种子露白后48h分别统计各处理中种子的发芽率并测定胚根长。每个处理设3个重复。结果见表1。

表1芽孢杆菌菌剂对作物种子萌发的影响效果

结果显示，芽孢杆菌菌剂对茄子、西瓜、棉花种子的萌发具有一定的促进作用，加菌后的种子发芽率及根长均明显高于对照例。

实验例2对作物幼苗的生长影响

选取籽粒饱满的西瓜和茄子种子，用浓度为15%的H₂O₂溶液或浓度为5‰的NaClO溶液进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次，置于25℃条件下催芽。用浅盘（长×宽×高=33cm×24cm×4.5cm）装好事先灭菌的营养土，加入稀释浓度为10⁶cfu·mL^-1的实施例1芽孢杆菌菌剂并混匀，以加清水为对照，加入的放线菌发酵液或清水的量以按压营养土可结块但无多余水分为准，将已发芽的供试作物种子分别播种，每种作物种子播30粒，分为3组，待对照出苗后统计出苗率并移栽至营养钵中，待作物生长至3叶期测量作物幼苗的根长、地上株高。结果见表2。

表2芽孢杆菌菌剂对作物幼苗的生长情况

结果显示，芽孢杆菌菌剂的加入对西瓜、茄子幼苗的出苗率、株高、根长均具有明显的提高，效果非常明显。

实验例3对作物枯萎病的防治效果

取自然土壤灭菌备用，按1:60的质量比向土壤中加入稀释浓度为10⁶cfu·mL^-1的实施例1保存1个月、3个月、6个月的芽孢杆菌菌剂，以加清水为对照，混合均匀后分装于塑料盒（长×宽×高=20cm×15cm×10cm）中并保持适宜的湿度，每个菌剂处理播种5盒并分为两组。将经过催芽的西瓜种子和茄子种子分别播种，西瓜每盒播10粒，茄子每盒播15粒。将西瓜枯萎病和棉花枯萎病的致病菌在PDA培养液中扩大培养96h，制成浓度为10⁵cfu·mL^-1的孢子悬浮液，待作物幼苗生长至3叶期，采用浸根法分别接种病原菌。待对照发病且病情稳定后，观察并记录各处理中作物的发病情况，依照病害严重度分级标准，根据公式3-1和公式3-2计算病情指数和防病效果。

西瓜枯萎病严重度分级标准：

0级：植株健全，叶片正常，表面无症状，维管束无黄化；

1级：植株感病轻微，叶片略显枯萎皱缩，维管束略微变色；

2级：植株株型反常，一半以下叶片枯萎较重，维管束有一半以下变色；

3级：植株焦枯，一半以上叶片枯萎，维管束有一半以上变色；

4级：植株叶片全部枯萎。

茄子黄萎病严重度分级标准：

0级：植株健康，叶片正常；

1级：植株有1至2片叶片出现症状，叶片小部分变黄或有不规则形状的病斑；

2级：植株有一半以下叶片发病，叶片大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘有卷枯；

3级：植株有一半以上的叶片发病，少数叶片枯萎凋落；

4级：大量植株叶片产生褐色掌状枯斑，有的病株叶片脱落成光杆，甚至整株枯死。

结果见表3。

表3芽孢杆菌菌剂对作物枯萎病的防治效果

结果显示，使用本发明的芽孢杆菌菌剂能够对茄子黄萎病、西瓜枯萎病产生一定的防治作用，即便芽孢杆菌菌剂保存长达6个月时，防治效果依然显著，达到48%以上；由此可见，本发明芽孢杆菌菌剂在6个月内具备较高的稳定性，且保存时间≤6个月。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种芽孢杆菌菌剂，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，由如下组分组成：

3.权利要求1或2所述芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1).斜面培养：将枯草芽孢杆菌A-2、枯草芽孢杆菌F-5、解淀粉芽孢杆菌ZR-1、解淀粉芽孢杆菌ZR-8四种原始菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20℃-37℃条件下，培养1-3天，使菌种活化；

2).一级种子培养：将步骤1)活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，20℃-37℃条件下，100-200r/min摇床培养2-3天，单菌种液体培养OD₆₀₀值达到2.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子；

3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-20%的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，20℃-37℃条件下，搅拌速度为100-200r/min，通气量为1：0.5-1.5，培养2-3天，制得二级种子；

4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为5-20%的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得芽孢杆菌菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；

在步骤2）、步骤3）中，所述液体培养基为牛肉膏蛋白琼脂胨培养基。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，所述OD₆₀₀值为2.0-2.5；

在步骤3）中，通气量为1：0.6-1.0。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述液体培养基的配方按质量百分比为：糖蜜5-10%、豆饼粉2-10%、蛋白胨1.0-5%、磷酸氢二钾1-1.5‰，余量为水。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述高密度发酵培养采用补料分批培养方式。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述补料分批培养方式中补料碳源为：葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的一种或两种以上；氮源为：豆饼粉和/或蛋白胨。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，所述混合发酵培养为有氧培养：起始0-24小时内，间隔通气，保持在有氧条件下发酵，通气量1：1-1.5，调控发酵溶解氧10-15%，搅拌转速100-200r/min，搅拌间隔时间2-3小时，搅拌1-3分钟，温度25-35℃。

10.权利要求1或2所述芽孢杆菌菌剂作为生防制剂在防治植物枯萎病中的应用。