CN110577916A - 一种防治作物根结线虫的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物源杀虫制剂领域，具体涉及一种防治作物根结线虫的复合菌剂及其制备方法，其特征在于：微生物组成为：枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽胞杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌属、穿刺巴氏杆菌、淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉。本发明采用多菌同罐发酵新技术，配方巧妙合理，消除了复合菌液体深层发酵培养中的相互拮抗的弊端，使得复合菌活性高，用于番茄、黄瓜根结线虫防治效果好。

Description

一种防治作物根结线虫的复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物源杀虫制剂领域，具体涉及一种防治作物根结线虫的复合菌剂及制备方法。
背景技术
蔬菜根结线虫病是世界性病害，危害蔬菜的根结线虫主要有四种：即南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫。番茄、黄瓜根结线虫的病害多由南方根结线虫引起，危害严重。据多年在山东、广西、河南等地试验调查：番茄、黄瓜大棚总发病率达到67.6％，总病株率接近50％，老棚的发病率平均接近95％。发病部位主要寄生在番茄、黄瓜根部的须根和侧根上，病部产生肥胖畸形的瘤状结，造成株矮小、发育不良、结实少、提早死亡，严重影响菜农增收。控制根结线虫危害、保证蔬菜产品质量安全，是关系到蔬菜产业可持续发展的头等大事。
近年来菜农防治番茄、黄瓜根结线虫的方法多样，包括农业防治、物理防治、化学防治和生物防治；
①农业防治：采用水旱轮作、嫁接、改良土壤、调节播种期、种植抗病品种等；其中选用抗病品种，对减少农药用量、保护环境、确保人类健康起到了很好的作用。
②物理防治：采用夏季土壤热护理(蒸汽消毒、高温闷棚、日光爆嗮、灌注热水消毒、盐水泥浆水漂洗、去除带虫种子等方法，还有用水淹半个月以上，射线、超声处理等)
③化学防治：施用杀虫剂，采用溴甲烷消毒，在我国蔬菜种植区占很大比例，有一定效果。但溴甲烷对大气臭氧层具有破坏作用。再者就是用石灰氮土壤消毒，用阿维菌素防治幼虫，虽有一定效果，但存在残留药害和环境污染。
④生物防治：利用真菌、细菌、病毒、立克次氏体、放线菌、捕食性线虫，原生动物等。其中尤以穿刺巴氏杆菌效果明显。真菌有轮枝属和拟青霉属等产生几丁质酶和蛋白酶，对线虫具有较好的防治作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治蔬菜作物根结线虫的复合菌剂及制备方法，具有更好的使用效果。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种防治蔬菜蔬菜作物根结线虫的复合菌剂，微生物组成为：枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽胞杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌属、穿刺巴氏杆菌、淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉。
优选的：各菌活菌数比例为：枯草芽孢杆菌10％；球形芽孢杆菌5％；荧光假单胞菌10％；苏云金芽胞杆菌10％；侧孢短芽孢杆菌5％；多粘类芽孢杆菌属10％；穿刺巴氏杆菌10％；淡紫拟青霉10％；厚垣轮枝菌10％；白僵菌5％；烟曲霉15％。
优选的：所述复合菌剂由初始活菌数比例为：枯草芽孢杆菌10％；球形芽孢杆菌5％；荧光假单胞菌10％；苏云金芽胞杆菌10％；侧孢短芽孢杆菌5％；多粘类芽孢杆菌属10％；穿刺巴氏杆菌10％；淡紫拟青霉10％；厚垣轮枝菌10％；白僵菌5％；烟曲霉15％的微生物，经复合发酵培养，使得菌体90％形成芽孢而成。
优选的：所述复合发酵培养在发酵罐内进行，发酵罐内培养液体积：纯净空气体积＝1:1.2；搅拌转速180r/min；培养时间：40小时—72小时。
优选的：所述复合发酵培养所用复合发酵培养基重量组成为：糖蜜3％；玉米淀粉4％；豆粕粉2％；葡萄糖0.5％；蛋白胨0.2％；硫酸亚铁0.008％；硝酸铵0.3％；酵母膏0.1％；硫酸铵0.2％；复合氨基酸粉3％；麦麸皮3％；磷酸二氢钾0.02％；碳酸钙0.1％；过磷酸钙0.1％；氯化钠0.2％；硫酸镁0.02％；碳酸钠0.8％；硫酸锰0.003％；消泡剂0.02％。
优选的：所述用于复合发酵培养的微生物中，所述枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、穿刺巴氏杆菌菌种分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行母种斜面试管培养获得，培养温度32℃---34℃，培养2--3天；然后分别接种于灭菌的500ml三角瓶中进行培养，瓶内有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基，每瓶装液量200ml；温度设定为32℃--34℃，在200r/min的摇床中进行培养，时间2--3天。
优选的：所述用于复合发酵培养的微生物中，所述淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉菌种分别在马玲薯蔗糖固体营养培养基上进行母种斜面试管培养，培养温度28℃--30℃，培养3--5天；然后分别接种于灭过菌500ml三角瓶中，马铃薯蔗糖液体培养基中进行培养，每瓶装液量200ml；温度设定28度—30度，摇床设定160r/min。
优选的：所述复合培养后的菌剂制备为固体粉剂，具体制备方法：培养好的复合菌剂作为原液与白炭黑、经灭过菌完全腐熟的有机肥、轻质碳酸钙、生物质炭粉等载体混合；
混合比例为：液体菌剂：载体＝＝1:1.2；载体重量百分比为：有机肥15％、轻质碳酸钙20％、生物质炭粉5％、白炭黑60％；用搅拌机充分搅拌均匀，放入通风干燥室低温烘干，温度控制在45度以下，干燥到水分低于10％左右时粉碎至80目以上；包装即得到固体微生物复合固体粉剂。
相应的，本发明的复合菌剂使用方法为：
1：防治番茄、黄瓜根结线虫，每亩用菌剂2—3公斤；稀释300倍灌根或滴灌。
2：严重地块每亩使用3—5公斤；稀释150倍灌根或滴灌。
3：每隔5—7天罐根一次，整个生育期灌2—3次为佳。
本发明具有以下有益效果：现有技术中，生物防治的菌剂产品大都是菌种单一，真菌、细菌、放线菌等菌类不能科学合理配伍；即使复合菌剂仍是单菌培养，然后勾兑，菌与菌之间相互拮抗，“内斗”，造成防效降低，防治效果差。本发明采用多菌同罐发酵新技术，配方巧妙合理，消除了复合菌液体深层发酵培养中的相互拮抗的弊端，使得复合菌活性高，防治效果好。本发明采用了十种以上微生物液体同罐发酵混合培养先进技术，该复合菌剂在选用菌株上狠下功夫。
本复合菌剂选用了枯草芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、穿刺巴氏杆菌、多粘类芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单孢菌杆菌六种芽孢杆菌和一种穿刺巴氏杆菌。其中两种芽孢杆菌能产生伴孢晶体，蛋白质毒素，直接杀灭根结线虫幼虫，使根结线虫产生败血症死亡。另外四种芽孢杆菌，是保护番茄、黄瓜的根际抗生细菌。再一种杆菌是专性寄生南方根结线虫的寄生细菌，寄生方式是以球形孢子粘附于根结线虫表面，然后孢子萌发形成芽管，在酶和芽管的作用下，侵入根结线虫的表皮；在根结线虫微体腔内漂浮和皮下生殖；吸取根结线虫的营养，持续不断地削弱线虫，并在线虫体内发育，产生大量菌体；菌体的生命活动产生有毒的代谢物，使被感染的幼虫反应迟钝，但不影响幼虫的吸收营养，待线虫发育成虫时，其体内充满菌体孢子而导致成虫彻底摧毁，释放大量菌孢子于土壤中，从而再次感染其它根结线虫，达到持续防治根结线虫的效果。本复合菌剂采用一种微生物同罐混合深层发酵培养，多菌种协同作战，“双管齐下”，互不拮抗，和谐生长，菌种活性高，防治效果优于同类产品。
具体实施方式
下面提供本发明优选实施，以便本领域技术人员理解本发明方案和效果。但本发明不限于下述的优选实施例。根据本发明的原理，本发明对农作物的根结线虫都有防治效果，尤其是对南方根结线虫引起的番茄或黄瓜根结线虫病害效果更佳。
实施例一
斜面菌种制备：
将枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、穿刺巴氏杆菌分别在“牛肉膏蛋白胨固体”培养基上进行母种斜面试管培养，设定温度32℃---34℃，培养2--3天备用。
将淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉分别在“马玲薯蔗糖固体”营养培养基上进行母种斜面试管培养，设定温度28℃--30℃，培养3--5天备用。
实施例二
种子培养：
将实施例一培养的枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、穿刺巴氏杆菌母种斜面试管在无菌条件下，分别接种于灭菌的500ml三角瓶中进行培养，瓶内有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基，每瓶装液量200ml；温度设定为32℃，在200r/min的摇床中进行培养，时间3天。
将实施例一培养的淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉母种试管在无菌条件下，分别接种于灭过菌500ml三角瓶中，马铃薯蔗糖液体培养基中进行培养，每瓶装液量200ml；温度设定30℃，摇床设定160r/min，时间3天。
实施例三
发酵罐混菌培养：
1：发酵罐复合发酵培养基组成(重量比)：
糖蜜3％；玉米淀粉4％；豆粕粉2％；葡萄糖0.5％；蛋白胨0.2％；硫酸亚铁0.008％；硝酸铵0.3％；酵母膏0.1％；硫酸铵0.2％；复合氨基酸粉3％；麦麸皮3％；磷酸二氢钾0.02％；碳酸钙0.1％；过磷酸钙0.1％；氯化钠0.2％；硫酸镁0.02％；碳酸钠0.8％；硫酸锰0.003％；消泡剂0.02％。
2：复合发酵培养的微生物配比(按实施例二获得的三角瓶中菌液重量比)：枯草芽孢杆菌10％；球形芽孢杆菌5％；荧光假单胞菌10％；苏云金芽胞杆菌10％；侧孢短芽孢杆菌5％；多粘类芽孢杆菌属10％；穿刺巴氏杆菌10％；淡紫拟青霉10％；厚垣轮枝菌10％；白僵菌5％；烟曲霉15％。
3：将复合发酵培养基与各微生物菌液同时置入发酵罐中，然后加入纯净水，使得发酵罐内培养液体积：纯净空气体积＝1:1.2；微生物菌液总的接种量为复合发酵培养基重量的10％；保持发酵罐密封；搅拌转速180r/min；培养时间：49小时；检测到90％菌体形成芽孢，结束培养，即为防治番茄、黄瓜根结线虫复合液体菌剂。
经检测GB20287-2006规定的方法检测，获得的液体菌剂中各菌种的活菌数比例与复合发酵培养投入的微生物重量比相当。液体菌剂总的活菌量达到1*1011CFU/g。
实施例四
发酵罐混菌培养：
1：发酵罐复合发酵培养基组成(重量比)：
糖蜜3％；玉米淀粉4％；豆粕粉2％；葡萄糖0.5％；蛋白胨0.2％；硫酸亚铁0.008％；硝酸铵0.3％；酵母膏0.1％；硫酸铵0.2％；复合氨基酸粉3％；麦麸皮3％；磷酸二氢钾0.02％；碳酸钙0.1％；过磷酸钙0.1％；氯化钠0.2％；硫酸镁0.02％；碳酸钠0.8％；硫酸锰0.003％；消泡剂0.02％。
2：复合发酵培养的微生物配比(按实施例二获得的三角瓶中菌液重量比)：枯草芽孢杆菌10％；球形芽孢杆菌5％；荧光假单胞菌10％；苏云金芽胞杆菌10％；侧孢短芽孢杆菌5％；多粘类芽孢杆菌属10％；穿刺巴氏杆菌10％；淡紫拟青霉10％；厚垣轮枝菌10％；白僵菌5％；烟曲霉15％。
3：复合发酵培养基与各微生物菌液同时置入发酵罐中，然后加入纯净水，使得发酵罐内培养液体积：纯净空气体积＝1:1.2；微生物菌液总的接种量为复合发酵培养基重量的20％；保持发酵罐密封；搅拌转速180r/min；培养时间：60小时；检测到93％菌体形成芽孢，结束培养，即为防治番茄、黄瓜根结线虫复合液体菌剂。
经检测GB20287-2006规定的方法检测，获得的液体菌剂中各菌种的活菌数比例与复合发酵培养投入的微生物重量比相当。液体菌剂总的活菌量达到1*1011CFU/g。
实施例五
固体粉剂的制备方法：
将实施例三、四培养好的复合菌剂作为原液分别与白炭黑、经灭过菌完全腐熟的有机肥、轻质碳酸钙、生物质炭粉等载体混合。混合比例为：液体菌剂：载体＝＝1:1.2；载体重量百分比为：有机肥15％、轻质碳酸钙20％、生物质炭粉5％、白炭黑60％；用搅拌机充分搅拌均匀，放入通风干燥室低温烘干，温度控制在45度以下，干燥到水分低于10％左右时粉碎至80目以上；包装即得到固体微生物复合固体粉剂A、B，检测活菌数达到1*1011CFU/g。
注意事项：
1：菌剂要保存在干燥通风处，避免阳光直射，防止雨淋。
2：稀释时禁止用自来水，可以使用河水、井水、地下水等未经消毒的水。
3：禁止与杀菌剂、除草剂混合使用。
4：性状：灰白色粉剂，2公斤一袋，保质期2年。
实施例六
使用方法步骤：
1：防治番茄、黄瓜根结线虫，每亩用菌剂2—3公斤；稀释300倍灌根或滴灌。
2：严重地块每亩使用3—5公斤；稀释150倍灌根或滴灌。
3：每隔5—7天罐根一次，整个生育期灌2—3次为佳。
实施例七
防治效果展示：
1：材料与方法
1.1供试药剂：
实施例六获得的复合菌剂粉剂A、B，经检测含活菌数均达1*1011CFU/g；对照：使用无污染的深井水。
1.2实验设计：
按番茄、黄瓜每667㎡使用本发明的“防治番茄、黄瓜根结线虫复合菌剂”2000克的剂量，深井水稀释150倍灌根，每株灌药300ml；用深井清水做空白对照。番茄、黄瓜各做5个处理，每个处理4个重复，共设置20个小区，一个对照；每个小区30㎡；番茄的4个重复A1、A2、A3、A4、作为标记，对照用CK1作为标记；黄瓜的4个重复用B1、B2、B3、B4作为标记，对照用CK2作为标记。
1.3试验地点：
试验安排在河南安阳鹏锦种植有限公司(安阳市内黄县高堤乡西渡村)，选择在番茄、黄瓜温室大棚各一个，土质是沙壤土，肥力中等，PH7.5；有机质含量3.16；根结线虫发生严重地块。
1.4试验时间：
2015年10月28日，黄瓜品种为：迷你2号，定值密度为：3500株/667㎡；番茄品种为：绿宝石；番茄定值密度2100株/667㎡，覆盖地膜并采取罐根的方法，分别于移栽后第7天罐根一次；结果前再罐根一次。
1.5调查与统计：
根据国标农药田间药效试验准则GB/T17980—2000杀线虫剂—防治根部线虫病中规定的分级标准进行分级，记录各级病株数；每小区对角线五点取样，每个点调查4株，计算病情指数和防治效果。
病株分级方法：0级：一根系完整，无根结；
1级：有少量根结，占跟系数的25％以下。
2级：一根结数，占根系数的26％—50％；
3级：一根结数，占根系数的51％—75％；
4级：一根结数，占根系数的76％—100％。
计算方法：
病情指数(％)＝Σ(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×7)×100
防治效果(％)＝(空白对照区病情指数－处理区病指数)/(空白对照区病情指数)×100
“复合菌剂”防治番茄根结线虫的防治效果如下表：
处理小区 菌剂 根结百分率(％) 病结指数 防治效果(％)
A1 A 10.6 20.1 79.9
A2 A 12.0 22.6 77.4
A3 B 11.2 21.7 78.3
A4 B 13.0 23.2 76.8
CK1 90.1 98 ____
“复合菌剂”防治黄瓜根结线虫的防治效果如下表：
处理小区 菌剂 根结百分率(％) 病结指数 防治效果(％)
B1 A 9.2 19.2 80.8
B2 A 10.5 20.1 79.9
B3 B 10.9 21.5 78.5
B4 B 11.8 22.2 77.8
CK2 91 98 ____
“本发明的番茄黄瓜根结线虫复合菌剂”对番茄、黄瓜根结线虫病表现出较好的防治效果。表1：番茄做了四个处理区、一个对照区，病情指数分别为：20.1、22.6、21.7、23.2，清水对照区CK1：98。防治效果分别为：79.9％、77.4％、78.3％、76.8％。
表2：黄瓜也做了四个处理区、一个对照区，病情指数分别为：19.2、20.1、21.5、22.2、；清水对照CK2为：98.防治效果分别为：80.8％、79.9％、78.5％、77.8％。
实践证明，实施例三、四获得的菌剂A、B结果没有明显差异，证明本发明的复合菌剂效果稳定。
根结线虫是一种危害十分严重的土传病害，设施土壤一旦感染上则不易根治。因此，预防工作十分重要，在生产中一定要加强“净苗”的培育、种子消毒、土壤消毒和田间卫生清理等预防措施，阻止根结线虫的传染，建议：在育苗时用“复合菌剂”浸种，移栽前一周使用“防治根结线虫复合菌剂”罐根一次。

Claims (10)

1.一种防治作物根结线虫的复合菌剂及其制备方法，其特征在于：微生物组成为：枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽胞杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌属、穿刺巴氏杆菌、淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉。
2.根据权利要求1所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：各菌活菌数比例为：枯草芽孢杆菌10％；球形芽孢杆菌5％；荧光假单胞菌10％；苏云金芽胞杆菌10％；侧孢短芽孢杆菌5％；多粘类芽孢杆菌属10％；穿刺巴氏杆菌10％；淡紫拟青霉10％；厚垣轮枝菌10％；白僵菌5％；烟曲霉15％。
3.根据权利要求1所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂由初始活菌数比例为：枯草芽孢杆菌10％；球形芽孢杆菌5％；荧光假单胞菌10％；苏云金芽胞杆菌10％；侧孢短芽孢杆菌5％；多粘类芽孢杆菌属10％；穿刺巴氏杆菌10％；淡紫拟青霉10％；厚垣轮枝菌10％；白僵菌5％；烟曲霉15％的微生物，经复合发酵培养，获得菌体90％形成芽孢而成。
4.根据权利要求3所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：所述复合发酵培养中，发酵罐内培养液体积：纯净空气体积＝1:1.2；搅拌转速180r/min；培养时间：40小时—72小时。
5.根据权利要求3所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：所述复合发酵培养的所用复合发酵培养基重量组成为：糖蜜3％；玉米淀粉4％；豆粕粉2％；葡萄糖0.5％；蛋白胨0.2％；硫酸亚铁0.008％；硝酸铵0.3％；酵母膏0.1％；硫酸铵0.2％；复合氨基酸粉3％；麦麸皮3％；磷酸二氢钾0.02％；碳酸钙0.1％；过磷酸钙0.1％；氯化钠0.2％；硫酸镁0.02％；碳酸钠0.8％；硫酸锰0.003％；消泡剂0.02％。
6.根据权利要求3所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：所述用于复合发酵培养的微生物中，所述枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、荧光假单胞菌、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、穿刺巴氏杆菌菌种分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行母种斜面试管培养获得，培养温度32℃---34℃，培养2--3天；然后分别接种于灭菌的500ml三角瓶中进行培养，瓶内有牛肉膏蛋白胨肉汤培养基，每瓶装液量200ml；温度设定为32℃--34℃，在200r/min的摇床中进行培养，时间2--3天。
7.根据权利要求3所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：所述用于复合发酵培养的微生物中，所述淡紫拟青霉、厚垣轮枝菌、白僵菌、烟曲霉菌种分别在马玲薯蔗糖固体营养培养基上进行母种斜面试管培养，培养温度28℃--30℃，培养3--5天；然后分别接种于灭过菌500ml三角瓶中，马铃薯蔗糖液体培养基中进行培养，每瓶装液量200ml；温度设定28度—30度，摇床设定160r/min。
8.根据权利要求3所述的一种防治作物根结线虫的复合菌剂，其特征在于：所述复合培养后的菌剂制备为固体粉剂，具体制备方法：培养好的复合菌剂作为原液与白炭黑、经灭过菌完全腐熟的有机肥、轻质碳酸钙、生物质炭粉等载体混合；
混合比例为：液体菌剂：载体＝＝1:1.2；载体重量百分比为：有机肥15％、轻质碳酸钙20％、生物质炭粉5％、白炭黑60％；用搅拌机充分搅拌均匀，放入通风干燥室低温烘干，温度控制在45度以下，干燥到水分低于10％左右时粉碎至80目以上；包装即得到固体微生物复合固体粉剂。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的防治作物根结线虫的复合菌剂在防治南方根结线虫引起的番茄或黄瓜根结线虫病害中的应用。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的防治作物根结线虫的复合菌剂的使用方法，步骤包括：
1)：防治番茄或黄瓜根结线虫，每亩用菌剂2—3公斤；稀释300倍灌根或滴灌；
2)：严重地块每亩使用3—5公斤；稀释150倍灌根或滴灌；
3)：每隔5—7天罐根一次，整个生育期灌2—3次。
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