CN114606155A - 苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用 - Google Patents

苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用，属微生物生物防治领域。本发明的苏云金芽孢杆菌Bt79和Bt80菌株采用常规方法制备，已保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏编号分别为CCTCC No:M 2022079 Bt79和CCTCC No:M 2022080 Bt80。本发明的苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80在6‑24h内，能显著诱导南方根结线虫发生逃避反应。在番茄根尖滴加苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌液，与南方根结线虫共培养48小时后，番茄根尖侵染率为6.18％‑10.59％，较对照组下降2.76‑4.73倍。以上结果证明苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80可以通过南方根结线虫J2幼虫的逃避反应，降低对根尖的侵染率，从而对宿主植物根系达到良好的防治效果。

Description

苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线 虫中的应用
技术领域
本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用，属微生物生物防治领域。
背景技术
植物根结线虫是一类分布于世界各地的定居型内寄生植物病原线虫，危害粮食、蔬菜、水果、经济作物等3000多种植物，是最具破坏性的植物病原体之一。根结线虫侵染破坏植物根系结构，影响植物对水分和营养物质的吸收，并引起其他病原菌的复合侵染，最终造成植物生长减弱，严重的甚至死亡。据不完全统计，根结线虫每年对农业生产造成的损失高达 1000多亿美元。
目前，对根结线虫的防控措施以化学防治为主。但随着根结线虫抗药性的累积，化学杀虫剂的剂量不断增加，毒性大，残效期长，严重影响农产品的质量安全，同时还造成生态环境的污染。来自微生物和植物的次生代谢物的天然杀虫剂，以减少有害农药的非靶点暴露和抑制抗药性的发展，成为生物防治剂的研究热点。根结线虫的天敌微生物有细菌、真菌和病毒等。其中，细菌资源丰富，生长周期短，繁殖速率高，且能促进植株生长而备受青睐。
目前，在提升根结线虫的生物防治效果的相关研究中，尚无利用生防细菌诱发的根结线虫的逃避反应的相关报道及其进一步的防治应用。
发明内容
本发明的目的在于提供苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和/或Bt80 菌株在防治植物南方根结线虫中的应用。
发明人经过实验证明，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株能够有效诱导南方根结线虫发生逃避反应，能够降低南方根结线虫对番茄根系的侵染，从而提供其在防治植物南方根结线虫中的应用。
本发明所采用的生防细菌是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80 菌株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022 年1月17日；保藏编号分别为CCTCC No:M 2022079Bt79和CCTCC No:M 2022080Bt80。
本发明采用常规方法制备苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79菌株和Bt80 菌液至OD600为2.0，利用Pluronic F-127凝胶分别对峙培养苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79、Bt80和南方根结线虫进行逃避实验。6、12和24小时后，计算南方根结线虫的逃避指数。6h时，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80 对南方根结线虫的逃避指数分别为31.32％和28.11％。12h时，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80对南方根结线虫的逃避指数分别为16.99％和31.45％。24h时，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80对南方根结线虫的逃避指数分别为38.74％和35.07％。在番茄根尖滴加苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt79和 Bt80菌液，与南方根结线虫共培养48小时后，用品红对根尖进行染色，镜检，计算南方根结线虫对番茄根尖的侵染率。当在番茄根尖滴加苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) Bt79时，侵染率为10.59％，较对照组下降了2.76倍。当在番茄根尖滴加苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)Bt80时，侵染率为6.18％，较对照组下降了4.73倍。以上结果证明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和/或Bt80可以通过南方根结线虫J2幼虫的逃避反应，降低对番茄根尖的侵染率，从而对宿主植物根系达到良好的防治效果。
本发明的技术方案为：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用。
进一步地，该苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和/或Bt80菌株用于降低南方根结线虫对番茄根尖的侵染。
本发明的有益效果：
本发明通过发现苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株可以诱导南方根结线虫发生逃避应答，进一步证实苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt79 和Bt80菌株能够显著降低南方根结线虫对番茄根尖的侵染率，从而对宿主植物根系达到良好的防治效果，最终提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt79和Bt80 菌株在防治植物南方根结线虫中的应用方法，对南方根结线虫的生防提供了一种环境友好、绿色安全的生物防控方法。
本发明的有益效果：
本发明通过发现苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株可以诱导南方根结线虫发生逃避应答，进一步证实苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt79 和Bt80菌株能够显著降低南方根结线虫对番茄根尖的侵染率，从而对宿主植物根系达到良好的防治效果，最终提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt79和Bt80 菌株在防治植物南方根结线虫中的应用方法，对南方根结线虫的生防提供了一种环境友好、绿色安全的生物防控方法。
附图说明
图1为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80诱发南方根结线虫发生逃避反应的Pluronic F-127逃避实验加样示意图。
图2为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80对南方根结线虫的逃避指数。
图3为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株降低南方根结线虫对番茄根尖的侵染效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
实施例1：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株的制备。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株的纯化和培养(以下为重量百分比)：
1.固体平板纯化制备苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80
LB固体培养基制备：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％氯化钠，1.5-2％Agar，其余为水，pH自然，121℃灭菌20min。将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株接种到固体培养基上，37℃过夜培养，获得单菌落。
2.液体扩大制备苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80
LB液体培养基制备：0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％氯化钠，余下的为水，pH自然， 121℃灭菌20min。将固体平板上的单菌落接种到试管液体培养基中(每管装5ml)，恒温摇床温度为37℃，转速为200rpm，培养到OD600为2.0。
实施例2：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌株诱发南方根结线虫的趋避应答，包括以下步骤：
(1)平板制备：取直径60mm的平板，在平板底部按图1所示做好标记。将4℃的23％PF-127凝胶平铺在平板底部，在25℃培养箱中放置至PF-127凝胶为半固体状态。
(2)加样：按照图1所示标记进行加样，A处加5μL苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌液，B处加5μL LB液体培养基作为对照，将100～200条南方根结线虫 J2幼虫加在平板的正中间，在25℃培养箱中静置6h、12h和24h。
(3)计数：在光学显微镜下观察，分别统计6h、12h和24h时A和B两边的J2数量，计算逃避指数(avoid index，AI)＝(B-A)/(A+B)×100％，-5<AI<5为随机情况，AI﹥5为逃避。
如图2所示，与对照组相比，加入苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80菌液在6～24小时内，具有显著的诱导南方根结线虫发生逃避反应的作用，其中24 h时的逃避效果最强，分别为38.74％和35.07％。
实施例3：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80抑制南方根结线虫对番茄根尖的侵染，包括以下步骤：
(1)番茄根尖准备：将番茄种子在水中浸泡过夜或在温水中浸泡2h，将吸饱水的种子均匀且分散地铺垫在有湿润滤纸的9cm平板上，在28℃培养箱中进行催芽，在这个过程中要保持滤纸湿润，待根尖长到1-2cm时，备用。
(2)侵染：在直径3cm的培养皿上加入4mL 23％PF-127凝胶，室温放置至半固体状态。将准备好的根尖放在培养基上，再加适量的PF-127凝胶覆盖根尖。待其凝固后，在每一个根尖的左右两边都加5uL苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌液，对照组加LB液体培养基。在距离根尖1.5cm处加大约300条南方根结线虫J2幼虫，将培养皿置于25℃培养箱中48h。
(3)显色：线虫侵染48h后，用镊子将番茄根尖从PF-127凝胶中取出，放入冰水混合物中漂洗干净，再用无菌水清洗数遍。加入适量的5％NaClO溶液浸泡根尖40-60min，随后用适量无菌水清洗数次至无味道。在25mL小烧杯中加入适量的无菌水，再加入3mL 酸性品红溶液(若此时酸性品红溶液颜色变浅，说明还有次氯酸钠残留，应继续漂洗干净，再进行后续实验)，煮20-25min，直至根被染成紫红色，用无菌水漂洗数次。压片，在显微镜下进行拍照观察，并统计进入根尖的线虫数量。
(4)侵染率计算：每个平板中起始线虫数目控制为300条，计为N2，48h后统计每个平板中侵染进入根尖的线虫总数计为N1，按以下公式计算线虫的侵染率。设置3次重复，求平均值。
侵染率％＝N1/N2×100％
N1＝侵染进入根尖内部的J2线虫数量
N2＝参与侵染实验的全部J2线虫数量
如图3所示，当在番茄根尖滴加苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt79时，侵染率为10.59％，较对照组下降了2.76倍；当在番茄根尖滴加苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt80时，侵染率为6.18％，较对照组下降了4.73倍，说明苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)Bt79和Bt80可以通过诱导南方根结线虫J2幼虫的逃避反应，显著降低南方根结线虫对番茄根尖的侵染率，从而对宿主植物根系达到良好的防治效果。

Claims (2)

1.苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用，所述苏云金芽孢杆菌Bt79和Bt80菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年1月17日；保藏编号分别为CCTCC No:M 2022079 Bt79和CCTCC No:M 2022080 Bt80。
2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株在防治植物南方根结线虫中的应用，其特征在于，该苏云金芽孢杆菌Bt79和/或Bt80菌株用于降低南方根结线虫对番茄根尖的侵染。
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