CN105104433A - 降低植物中根结线虫侵害的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请关于降低植物中根结线虫(ROOT-KNOT？NEMATODE)侵害的方法。本发明提供用于防治有害生物的源自色杆菌属物种培养物的生物活性化合物和代谢物、包含这些化合物的组合物、获得这些化合物的方法以及使用这些化合物和组合物来防治有害生物的方法。

Description

降低植物中根结线虫侵害的方法
本申请是申请日为2011年10月24日、申请号为201180051656.0、发明名称为“色杆菌生物活性成份与代谢物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明公开了用于防治有害生物的源自色杆菌属(Chromobacterium)的生物活性成分和代谢物，特别是Chromobacteriumsubstugae培养物，以及它们用于防治有害生物(pest)的方法。
背景技术
天然产物是由微生物、植物和其它生物产生的物质。微生物天然产物提供了丰富的化学多样性来源，并且将天然产物用于医药目的已有悠久的历史。虽然着重于用于人类治疗的天然产物(其中50％以上来自天然产物)，但仅有11％的农药来自天然来源。然而，天然产物农药可能在传统农场和有机农场中发挥防治有害生物的重要作用。微生物(细菌、放线菌和真菌)产生的次生代谢物提供新化合物，其可单独使用或与已知化合物联合使用，以有效防治昆虫类有害生物并减少产生耐药性的风险。有许多公知的成功用作农业杀虫剂的微生物天然产物的实例(Thompson等人，2000；Arena等人，1995；Krieg等人1983)。
微生物农药的开发始于纯培养物中微生物的分离。然后，使用体外试验、体内试验或在温室或田野中的中试规模试验有效进行波谱筛选。同时，对微生物产生的活性化合物进行分离和鉴定。对于微生物农药的商品化，需通过在工业规模下发酵以经济地生产微生物，并与生物相容且批准的添加剂配制以提高药效并将在田野条件下的施用容易性和储存稳定性增至最大。
随着农民期待扩大他们的杀虫剂范围并随着在市场上出现新的微生物产品，在新旧杀虫剂间存在各种相互作用的可能性。目前经常使用2种或更多种杀虫剂的组合，将其同时或按序施加到单一作物上。为解决这些问题，科学家已使用外用和饲喂的方法来检验油类农药、真菌农药和化学农药对有害生物和益虫的相互作用(例如参见Chalvet-Monfray，Sabatier等人；Meunier，Carubel等人1999；Hummelbrunner和Isman2001；Wirth，Jiannino等人2004；Farenhorst，Knols等人2010；Shapiro-Ilan，Cottrell等人2011等)。但目前尚未对所有的相互作用进行研究。
色杆菌属
β-色杆菌菌株(即Chromobacteriumsubstugae)对许多昆虫表现出杀虫活性(Martin，Blackburn等人2004；Martin2004；Martin，Gundersen-Rindal等人2007；Martin，Hirose等人2007；Martin，Shropshire等人2007)。作用模式表现为拒食素和毒素活性的结合，在亚致死剂量下观察到饲喂抑制(feedinginhibition)(Martin，Gundersen-Rindal等人2007)。具体而言，已发现Chromobacteriumsubstugae有效防治科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsedecemlineata)成虫、西部玉米根虫(Diabroticavirgifera)成虫、南方玉米根虫(Diabroticaundecimpunctata)成虫和幼虫、小蜂房甲虫(Aethinatumida)幼虫、小菜蛾(Plutellaxyllostella)幼虫、甘薯粉虱(Bernisiatabaci)成虫和幼虫以及南绿椿象(Nezaraviridula)成虫。
自Martin及其同事发现Chromobacteriumsubstugae以来，至少已分离和表征出三个色杆菌的新物种；Young等人(2008)自台湾泉水样本中分离出一个新的色杆菌物种(C.aquaticum)，而Kampfer等人(2009)也自马来西亚收集的环境样本中分离出二个物种(C.piscinae和C.pseudoviolaceum)。
色杆菌属的次生代谢物
在所有已知的色杆菌物种中，对于紫色色杆菌(C.violaceum)有最多的研究，关于色杆菌产生的次生代谢物的公布信息仅基于对紫色色杆菌的研究。Durán和Menck(2001)已就紫色色杆菌(来自土壤和水中的革兰阴性腐生生物)的药理和工业前景发表了综述。此物种通常被认为对人类无致病性，但作为机会致病菌，其偶而在人类和动物中成为败血症和致命感染的病原体。已知紫色色杆菌产生一种紫色色素(紫色杆菌素)，其是通过在氧的存在下使2个L-色氨酸分子稠和而生成(Hoshino等人，1987；Ryan和Drennan；2009)。紫色杆菌素的生物合成受到群体感应(quorum-sensing)的调节，所述群体感应是一种在革兰氏阴性菌中调节各种其它次级代谢途径的常见机制(McClean等人，1997)。
由Durán和Menck(2001)总结的紫色色杆菌的其它已知代谢物包括氢氰酸、(高)铁氧胺E(ferrioxamineB)、B-丙氨酸糖肽(B-lactamicglycopeptides)SQ28，504和SQ28，546、抗生素(如aerocyanidin、aerocavin、3，6-二羟基-1，2-苯异唑(3，6-dihydroxy-1，2-indoxazene)和单酰胺菌素SB-26.180)和抗肿瘤缩酚酸肽FR901228。依据Durán和Menck(2001)的综述文章，紫色色杆菌也产生不寻常的糖化合物，如胞外多糖和脂多糖。
线虫和杀线虫剂
线虫是不分节两侧对称的蠕虫状无脊椎动物，其具有体腔和完整的消化系统，但无呼吸和循环系统。其体壁由多层的角质层、具有四条纵线的皮下组织和内部肌肉组织组成(Chitwood，2003)。其身体大部份为消化和生殖系统。大部分的线虫可自由生活，但有少数物种是动物或植物的遍在寄生虫。
根结线虫(Meloidogynespp.)寄生于许多的一年生和多年生作物中，同时影响市场收率的产量和品质。该属的线虫被认为是最具经济重要性的植物寄生线虫(Whitehead，1998)。植物寄生线虫每年造成的作物损失估计超过1000亿美元(Koenning等人1999)，超过一半是根结线虫属造成的。该品系的接种物来自虫卵，其在有利条件下孵化以释出感染性第二阶段幼虫(J2S)，所述幼虫在土壤中迁移到宿主植物的根上。藉由根尖渗透而发生感染，然后幼虫移至维管组织(线虫在该处常驻)，直接自植物细胞中得到养分。植物因而产生形成虫瘿(根节)的巨细胞。在整个生殖阶段(reproductivelife)中，雌虫保持埋入植物组织中，只有虫卵自根中伸出。
防治根结线虫最有效的方法是使用抑制虫卵孵化、幼虫活动和/或植物感染性的杀线虫剂。因为以下环境和生理上的原因，开发化学防治植物寄生线虫的农药是具有挑战性的工作：1.大部份植物寄生性线虫生活在靠近根部的土壤的狭窄区域中，从而难以递送化学杀线虫剂。2.线虫的外表面是不良生化靶，无法渗透到许多有机分子中(Chitwood，2003)。此外，口服递送有毒化合物是几乎不可能的，因为大多数植物寄生线虫物种在其侵入和感染植物根系后才摄取宿主养分。因此，杀线虫剂往往是具有高挥发性或具有促进它们在土壤中的流动性的其它化学和物理性质的广谱毒素。
在过去十年中，卤代烃(如二溴乙烯、溴甲烷)是世界各地使用最频繁的杀线虫剂。因为它们具有人体高毒性且对平流臭氧层具有有害作用，因而在蒙特利尔公约中已禁止使用这些化合物，但因为缺乏替代品，所以仍可使用溴甲烷用于防治线虫和植物病原体。随着有机磷的使用，氨基甲酸酯是最有效的非熏蒸类杀线虫剂。可惜的是，大部分氨基甲酸酯如涕灭威和杀线威等也属剧毒物。2010年8月，涕灭威的制造商拜耳公司已同意取消在美国马铃薯和柑橘中的所有产品注册，而在2018年8月底时，涕灭威将彻底淘汰。近日，阿维菌素(由阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)产生的两种除虫菌素的混合物)已注册用于杀线虫用途(Faske和Starr，2006)。Syngenta公司将该活性成分以商标名投放到市场中，作为棉花和蔬菜的种子处理剂。
据报导有些微生物植物/线虫病原体对植物寄生线虫具有活性(Guerena2006)。这些生物防治剂包括以下细菌：苏云金芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、穿刺巴氏菌(Pasteuriapenetrans)和P.usgae。PasteuriaBiosciences已开始在美国南部使用P.usgae来防治草地线虫(stingnematodes)。杀线虫真菌包括木霉菌(Trichodermaharzianum)、线虫寄生菌(Hirsutellarhossiliensis)、食线虫真菌(H.minnesotensis)、厚垣轮枝孢菌(Verticilliumchlamydosporium)、线虫捕捉菌(Arthrobotrysdactyloides)和淡紫拟青霉(Paecilomyceslilanicus)(Prophyta公司的产品名称为和)。另一种真菌疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)可用于商业制剂(ValentBiosciences公司的产品)。这是杀线虫真菌，由于杀线虫化合物而具有活性。其它市售的生物杀线虫剂包括和(B.cepacia)、(Bacilluschitinosporus)(Quarles，2005)和以色列的产品(Bacillusfirmus)(目前由拜耳公司以种子处理剂销售)(Terefe等人2009)。据假定，微生物分离物对线虫虫卵孵化、幼虫活动和感染性的有害作用可归因于这些生物体产生的毒素(Hallman和Sikora，1996；Marrone等人，1998；Siddiqui和Mahmood，1999；Saxena等人，2000；Meyer和Roberts，2002)寄生或甚至扑杀线虫(Siddiqui和Mahmood，1996；Kerry，2001；Jaffee和Muldoon，1995)、引发系统抵抗作用(Hasky-Gunther等人1998)、改变线虫行为(Sikora和Hoffman-Hergarter，1993)或干扰植物识别功能(Oostendorp和Sikora，1990)的能力。
植物杀线虫剂如植物提取物和精油可用于防治线虫(Kokalis-Burrelle和Rodriguez-Kabana，2006)。Chitwood在其最近的综述文章中总结了利用源自植物的化合物防治线虫的选择(Chitwood，2002)。Siddiqui和Alam(2001)证明，用印楝树(Azadirachtaindica)和苦楝树(Meliaazadirah)的植物部分改造的盆栽土壤抑制番茄的根结线虫产生。但目前在美国没有印楝产品注册用于防治线虫。基于含皂苷的皂树(Quillajasaponaria)提取物(在C-3处被三糖取代并在C-28处被寡糖取代的皂树酸的bidesmosidic衍生物)的来自智利的新植物产品最近已经美国环保署注册为有机杀线虫剂，并由有机物质检查委员会(OMRI)登录用于有机农业。经MontereyAgResources市售。
通常对非宿主作物的轮作本身足以防止线虫种群达到经济损害水平(Guerena2006)。信息素(allelochemicals)是影响植物环境中的生物行为的由植物产生的化合物。杀线虫信息素包括polythienyls、硫配糖体(glucisonolates)、生物碱、脂质、萜类、甾体、三萜类和酚类化合物(Kokalis-Burrelle和Rodriguez-Kabana，2006；Chitwood，2002)。当成长为覆盖作物时，来自化感植物(allelopathicplant)的生物活性化合物在生长期中渗出和/或在生物质分解过程中释出到土壤中。芸苔属作物可用于生物熏蒸，所述生物熏蒸是基于在分解土壤掺入组织(soil-incorporatedtissue)过程中释放杀生物挥发物的有害生物防治策略(Kirkegaard和Sarwar，1998)。但Roubtsova等人(2007)在绿花椰菜腐败组织对南方根结线虫数量的影响的研究中指出为了适当防治，需彻底混合植物组织与完全被线虫感染的土壤体积。
在农业土壤中的线虫防治的未来有赖于两个因素：培育抗线虫作物和发现并开发新的广谱低毒杀线虫剂。研究、开发和注册新的化学杀线虫剂的成本非常高(超过2亿美元)，从而限制了它们的开发。从1967-1997年中，在497种注册用作农药的新活性成份中，只有7个注册为杀线虫剂(Aspelin和Grube，1999)。除了传统的化学方法外，也建议使用RNA干扰(RNAi)作为防治线虫的方法。藉由RNAi的基因沉默作用最初被证明用于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)，而最近也被证明用于植物寄生线虫如根结线虫(Bakhetia等人2005)。为了降低植物寄生线虫造成的显著经济损失以及降低目前注册用于线虫防治的有毒化合物的使用，寻找用作生物杀线虫剂的新的微生物株成为重要的目标。
根据Sasser和Freckman(1987年)的研究，线虫对世界各地的主要作物造成的作物损失为8％至20％。植物寄生线虫可导致相当大的作物损失，估计全球每年损失约870亿美元(Dong和Zhang，2006)。抗线虫作物物种和化学杀线虫剂是目前线虫防治的主要选择。诸如溴甲烷的熏蒸剂对防治土壤传播的植物病害和线虫非常有效，但因为对哺乳动物具有高毒性、臭氧耗减效应和其它残留效应，许多国家已禁止使用溴甲烷，并经国际协商计划将其完全撤出市场(Oka等人，2000)。化学替代品如碘甲烷、1，3-二氯丙烯和氯化苦(cholorpicrin)对哺乳动物和环境也有安全上的问题。目前正逐渐淘汰和禁用化学非熏蒸杀线虫剂。最近，美国环保署宣布将淘汰涕灭威。
发明内容
本文提供新用途和新组合，具体提供包含色杆菌属物种的菌株，特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种(Chromobacteriumsubstugaesp.Nov.)的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株的组合物。
由此，本文提供调节植物中的线虫侵害的方法，其包括向植物和/或其种子和/或用于使所述植物生长的基质施用有效调节所述线虫侵害的量的以下物质：色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的上清液、滤液和/或提取物，和/或所述上清液、滤液和/或提取物的一种或多种代谢物，以及任选存在的另一种杀线虫物质。
本发明也提供对至少一种有害生物具有协同作用的农药组合，其包含作为活性成份的以下物质：(a)色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的上清液、滤液和/或提取物，和/或所述色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的上清液、滤液和/或提取物的一种或多种代谢物，和(b)另一种农药物质，其中(a)和(b)以协同量存在。在一具体实施方案中，所述有害生物可以是昆虫类有害生物，但也可以包括但不限于线虫、植物真菌、植物病毒、植物细菌和杂草。此外，所述组合可以是组合物。所述农药物质可能：(a)源自微生物；(b)是天然产物和/或(b)是化学农药，尤其是化学杀线虫剂。
具体而言，所述组合可包含色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的上清液、滤液和/或提取物和源自微生物的农药物质，所述微生物包括但不限于芽孢杆菌(Bacillussp.)(如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种(Bacillusthuringiensisvar.kurstaki))和多杀菌素。或者，所述组合可包含色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的上清液、滤液和/或提取物和源自天然产物如除虫菊(pyrethrum)的农药物质。或者，所述组合可包含色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的上清液、滤液和/或提取物和农药物质，所述农药物质是化学农药，特别是杀虫剂，其中所述杀虫剂包括但不限于除虫菊酯、螺虫乙酯(spirotetramet)和邻甲酰氨基苯甲酰胺(anthranilicdiamide)。
在相关方面，本文提供协同调节植物中的至少一种有害生物或有害生物物种侵害的方法，其包括向植物和/或其种子和/或用于使所述植物生长的基质施用有效调节所述有害生物或有害生物物种侵害的量的上述组合。本文还提供可获自或源自色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的分离的化合物，或者能够产生这些化合物的生物体，所述化合物可用于防治各种有害生物，特别是线虫类有害生物。
在一实施方案中，所述化合物具有以下特征：(a)具有农药活性；(b)经液相色谱/质谱法(LC/MS)测定具有约840-900的分子量；(c)使用水∶乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20分钟；90-0％CH3CN水溶液，20-24分钟；100％CH3CN，24-27分钟；0-90％CH3CN水溶液，27-30分钟；90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线检测下，其在反相C-18HPLC柱上的高压液相色谱(HPLC)保留时间为约7-12分钟；和(d)任选地可获自色杆菌属(Chromobacterium)物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)。在一实施方案中，所述化合物可以是肽。
在一具体实施方案中，经13CNMR测定，所述化合物具有43个碳，包括7个甲基碳、10个亚甲基碳、12个次甲基碳、6个烯属次甲基(olefinicmethines)碳和8个季碳。
在一具体实施方案中，化合物“A”具有以下特征：(a)可获自色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)；(b)对有害生物具有毒性；(c)经液相色谱/质谱法(LC/MS)测定具有约840-890，更特别是860的分子量；(d)1HNMR的δ值为8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80，并且13CNMR的δ值为173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80；(e)使用水∶乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20分钟；90-0％CH3CN水溶液，20-24分钟；100％CH3CN，24-27分钟；0-90％CH3CN水溶液，27-30分钟；90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线检测下，其在反相C-18HPLC柱(Phenomenex，Luna5μC18(2)100A，100x4.60mm)上的高压液相色谱(HPLC)保留时间为约7-12分钟，更特别为约9分钟。具体而言，13C-NMR谱显示了43个碳的信号，包括7个甲基碳、10个亚甲基碳、12个次甲基碳、6个烯属次甲基碳和8个季碳，和/或1HNMR谱显示典型的肽的特征，显示了5个酰胺NH信号[δH：8.89、8.44、8.23、8.22、7.96]、一个胺NH2基信号[δH：7.64、6.65]、6个α-氨基质子[δH：4.07、4.06、3.96、3.95、3.88、3.72]，并且在13C-NMR谱中，有6个/7个酰胺或酯共振[δc：173.62、172.92、172.25、1.72.17、171.66、171.28、170.45]。
在另一具体实施方案中，化合物“B”具有下列特征：(a)可获自色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)；(b)对有害生物具有毒性；(c)经液相色谱/质谱法(LC/MS)测定具有约850-890，更特别是874的分子量；(d)使用水∶乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20分钟；90-0％CH3CN水溶液，20-24分钟；100％CH3CN，24-27分钟；0-90％CH3CN水溶液，27-30分钟；90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线检测下，其在反相C-18HPLC柱(Phenomenex，Luna5μC18(2)100A，100x4.60mm)上的高压液相色谱(HPLC)保留时间为约7-12分钟，更特别为约9分钟，甚至更特别为约9.54分钟。
在更具体的实施方案中，提供包括但不限于以下的化合物：
(A)具有##STR001##结构的化合物
或其农药可接受的盐或立体异构体，其中R是-H、含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基基团的低级链烷基(1owerchainalkyl)、芳基或芳基烷基基团、取代低级烷基；X是O、NH、NR或S；n是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为H，它们相同或不同，并独立地为氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基，-C(O)H、酰基、氧酰基(oxyacyl)、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
(B)具有##STR001a##结构的化合物
其中R是-H、含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基基团的低级链烷基、芳基或芳基烷基基团、取代低级烷基；X是O、NH、NR或S；R2a、R2b独立地选自-H、烷基、低级烷基、取代烷基和取代低级烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为H，它们相同或不同，并独立地为氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
(C)具有##STR001b##结构的化合物
其中R是-H、含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基基团的低级链烷基、芳基或芳基烷基基团、取代低级烷基；X是O、NH、NR或S；n是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；R2a、R2b独立地选自-H、烷基、低级烷基、取代烷基和取代低级烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为H，它们相同或不同，并独立地为氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基；
(D)具有##STR001c##结构的化合物
其中R是-H、低级链烷基、芳基或芳基烷基基团、含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基基团的取代低级烷基；X是O、NH、NR或S；n是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；R2a、R2b独立地选自-H、烷基、低级烷基、取代烷基和取代低级烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11各自独立地为H，它们相同或不同，并独立地为氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或砜基。
在一更具体的实施方案中，所述化合物是chromamideA(1)。
可通过以下操作获得这些化合物：(a)在足以产生所述化合物的条件下，在培养基或全细胞培养液中培养色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)，从而获得色杆菌属培养物；(b)从(a)中的全细胞培养液中分离产生的所述化合物。具体而言，可通过以下操作来分离步骤(b)中的化合物：(i)将所述全细胞培养液施加到离子交换柱、尺寸排阻柱或反相HPLC柱中的任意一种以得到柱流分；(ii)测定所述柱流分的农药活性；和(iii)浓缩(ii)中的柱流分以得到分离的化合物。
本文还提供组合物特别是农药组合物，其包含所述化合物以及具有农药活性的可获自色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)的其它化合物。这些其它化合物可具有以下特性：(a)经液相色谱/质谱法(LC/MS)测定具有约315-360的分子量；(b)使用水∶乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20分钟；90-0％CH3CN水溶液，20-24分钟；100％CH3CN，24-27分钟；0-90％CH3CN水溶液，27-30分钟；90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线检测下，其在反相C-18HPLC柱上的高压液相色谱(HPLC)保留时间为约8-15分钟，并且可通过以下操作获得：(A)在足以产生所述化合物的条件下，在培养基中培养色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)，从而获得色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)培养物；(B)从所述全细胞培养液中分离(A)中产生的所述化合物。
在一具体实施方案中，用于上述组合物中的一种化合物(化合物“C”)具有以下特征：(a)可获自色杆菌属物种的菌株(特别是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特别是色杆菌新物种的菌株，甚至更特别是与美国专利7,244,607中所述的NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株)；(b)对有害生物具有毒性；(3)经液相色谱/质谱法(LC/MS)测定具有约约325-360，更特别是343的分子量；(d)使用水∶乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20分钟；90-0％CH3CN水溶液，20-24分钟；100％CH3CN，24-27分钟；0-90％CH3CN水溶液，27-30分钟；90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线检测下，其在反相C-18HPLC柱(Phenomenex，Luna5μC18(2)100A，100x4.60mm)上的高压液相色谱(HPLC)保留时间为约8-14分钟，更特别为约10分钟，甚至更特别为约10.88分钟。在一具体实施方案中，化合物“C”可以是紫色杆菌素(2)，其为先前分离自紫色色杆菌的已知化合物。
在另一具体实施方案中，用于上述组合物中的另一种化合物(化合物“D”)具有下列特征：(a)可获自色杆菌属物种；(b)对有害生物具有毒性；(3)经液相色谱/质谱法(LC/MS)测定具有约315-350，更特别是327的分子量；(d)使用水∶乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20分钟；90-0％CH3CN水溶液，20-24分钟；100％CH3CN，24-27分钟；0-90％CH3CN水溶液，27-30分钟；90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线检测下，其在反相C-18HPLC柱(Phenomenex，Luna5μC18(2)100A，100x4.60mm)上的高压液相色谱(HPLC)保留时间为约10-15分钟，更特别地为约12分钟，甚至更特别地为约12.69分钟。在一具体实施方案中，化合物“D”可以是脱氧紫色杆菌素(deoxyviolacein)(3)，其为先前分离自紫色色杆菌的已知化合物。
所述组合物还可任选地包含第二物质和/或载体、稀释剂、表面活性剂或辅剂中的至少一种，其中所述第二物质为化学农药或生物农药。
本文还提供使用上述化合物(如化合物“A”、“B”、“C”和“D”)和组分调节植物中的有害生物(特别是线虫类有害生物)侵害的方法，其包括向所述植物施用有效调节所述有害生物侵害的量的所述化合物或组合物以及任选存在的第二化学农药或生物农药。本文还上述化合物在配制用于调节植物中的有害生物侵害的组合物中的用途。
附图说明
图1是用于从培养液中获得本发明化合物的纯化路线的示意图。
图2图示chromamideA(1)的ESI-LCMS色谱。
图3图示chromamideA(1)的HRMS数据。
图4图示在600MHz下chromamideA(1)在DMSO-d6中的1HNMR。
图5图示在600MHz下chromamideA(1)在DMSO-d6中的13CNMR。
图6图示化合物B(MW874)的HPLC色谱。
图7图示chromamideA(1)、紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的化学结构。
图8为用过滤的消毒Chromobacteriumsubstugae培养液处理24小时后的活动线虫的百分比(1x：未稀释；0.1x：稀释10倍)。
图9为用过滤的消毒Chromobacteriumsubstugae培养液处理48小时后的活动线虫的百分比值(1x：未稀释；0.1x：稀释10倍)。
具体实施方式
虽然上述组合物和方法容易进行各种修改和存在替代形式，但是本文会详细说明示例性实施方案。但是应当了解，并不意图将本发明限于公开的特定形式，相反的是，本发明意图涵盖落在所附权利要求限定的本发明精神和范围内的所有修改、等同和替代物。
当提供数值范围时，应当理解为，在该范围的上限与下限以及该指定范围中任何其它确定值或中间值之间的，除非上下文另有明确规定，至下限的单位的十分之一的各中间值均包括在其中。也包括较小的范围。其中还包括这些较小的范围的上下限，受指定范围中任何具体排除的限制。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。虽然在实施或测试本发明中还可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。
应当注意到，除非上下文明确指出，如本文和所附权利要求所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数含义。
如本文所定义，“源自”表示直接分离或获得自特定来源，或者具有与分离或获得自特定来源的物质或生物体相同的特征。在“来源”是生物体的情况下，“源自”表示可分离或获得自生物体本身或用于培养所述生物体或使其生长的培养基。
如本文定义，“全培养液(wholebrothculture)”是指含有细胞和培养基二者的液体培养基。若使细菌在培养板上生长，则可在水或其它液体全培养基中收集细胞。
术语“上清液”是指当在来自琼脂培养板的另一液体中收集在培养液中生长的细胞并经离心、过滤、沉淀或本领域公知的其它方法去除时所残留的液体。
如本文定义，“滤液”是指来自穿透膜的全培养液的液体。
如本文定义，“提取物”是指藉由溶剂(水、洗涤剂、缓冲剂)从细胞中去除并经离心、过滤或其它方法从细胞中分离的液体物质。
如本文定义，“代谢物”是指微生物发酵的化合物、物质或副产物，或从具有农药活性特别是杀虫活性的微生物获得的上清液、滤液或提取物。如本文定义，“分离的化合物”基本不含其它化合物或物质，例如经分析方法(包括但不限于色谱法和电泳法)测定具有至少约20％的纯度，优选约40％的纯度，更优选约60％的纯度，甚至更优选约80％的纯度，最优选约90％的纯度，甚至最优选约95％的纯度。
如本文定义，“载体”是这样的惰性的有机或无机物质，其与活性成份混合或配制，以促进活性成分向植物或其它待治疗对象的施用或活性成分的储存、运输和/或处理。
所用的术语“调节(modulate)”表示改变有害生物侵害的量或有害生物侵害的传播速率。
如本文定义，术语“有害生物侵害”是导致有害影响(包括宿主族群的疾病和感染，或生长系统出现不期望的杂草)的量的有害生物的存在。
如本文定义，“农药”是增加植物有害生物的死亡率或抑制其生长速率的源自生物产品或化学物质的物质，包括但不仅限于杀线虫剂、杀昆虫剂、植物杀菌剂和植物杀病毒剂。
如本文定义，术语“烷基”是指具有1至约12个碳原子的单价直链或支链烃基团，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基等。
如本文定义，“取代烷基”是指还带有一个或多个取代基的烷基，所述取代基选自羟基、烷氧基、巯基、环烷基、取代环烷基、杂环基、取代杂环基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、芳氧基、取代芳氧基、卤素、氰基、硝基、氨基、酰氨基、-C(O)H、酰基、氧酰基(oxyacyl)、羧基、磺酰基、磺酰胺、砜基等。
如本文定义，“烯基”是指其具有一个或多个碳-碳双键并具有约2-12个碳原子的直链或支链烃基团，并且“取代烯基”是指还带有一个或多个上述取代基的烯基。
如本文定义，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键并具有约2-12个碳原子的直链或支链烃基团，并且“取代炔基”是指还带有一个或多个上述取代基的炔基。
如本文定义，“芳基”是指具有6-14个碳原子的芳族基团，并且“取代芳基”是指还带有一个或多个上述取代基的芳基。
如本文定义，“杂芳基”是指包含一个或多个杂原子(如N、O、S等)作为环结构的一部分，并具有3-14个碳原子的芳族环，并且“取代杂芳基”是指还带有一个或多个上述取代基的杂芳基。
如本文定义，“烷氧基”是指-O-烷基-基团，其中烷基如上文定义，并且“取代烷氧基”是指还带有一个或多个上述取代基的烷氧基。
如本文定义，“硫代烷基”是指-S-烷基-基团，其中烷基如上文定义，并且“取代硫代烷基”是指还带有一个或多个上述取代基的硫代烷基。
如本文定义，“环烷基”是指包含约3-8个碳原子的包含环的烷基，并且“取代环烷基”是指还带有一个或多个上述取代基的环烷基。
如本文定义，“杂环基”是指包含一个或多个杂原子(如N、O、S等)作为环结构的一部分，并具有3-14个碳原子的环状(即包含环的)基团，并且“取代杂环基”是指还带有一个或多个上述取代基的杂环基。
生产方法
如上所述，可获得化合物或代谢物，所述化合物或代谢物可获自或源自与色杆菌属物种具有相同特征的生物体，更特别地获自或源自与Chromobacteriumsubstugae具有相同特征的生物体，更特别地获自或源自与NRRLB-30655具有相同特征的色杆菌新物种的菌株，或获自或源自任意其它微生物。本发明的方法包括培养这些生物体，以及通过从这些生物体的培养基中分离这些化合物从而获得这些化合物和/或成份。
具体而言，使用本领域已知的方法在营养培养基中培养这些生物体。可通过摇瓶培养、在适合的培养基中并在允许细胞生长的条件下在实验室或工业发酵罐中进行的小规模或大规模发酵(包括但不限于连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)来培养生物体。可在含碳源、氮源和无机盐的适当营养培养基中，使用本领域已知的操作进行培养。合适的培养基可自商业来源获得，或可根据公布的组成进行制备。
在培养后，可使用色杆菌属物种的上清液、滤液和/或提取物和/或源自色杆菌属物种的上清液、滤液和/或提取物来配制农药组合物。
或者，在培养后，可从培养液中提取化合物和/或代谢物。
可通过色谱法来分级提取物。可使用本领域已知的方法测定色谱流分对例如粉纹夜蛾(Trichoplusiani)或甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的毒活性。可使用相同或不同的色谱法重复此过程一次或多次。
组合物
组合物可包含色杆菌属物种的菌株(例如与色杆菌新物种具有相同特征的菌株，更特别地，与NRRLB-30655(见美国专利7,244,607)具有相同特征的菌株)的全培养液、液态培养基或悬浮液，以及获自色杆菌属物种的菌株(例如与色杆菌新物种具有相同特征的菌株，更特别地，与NRRLB-30655(见美国专利7,244,607)具有相同特征的菌株)的上清液、滤液或提取物，或源自色杆菌属物种的菌株或特别具有杀线虫活性的前述菌株的组合的上清液、滤液或提取物。
上述组合物可以用任何方式配制。非限制性制剂实例包括但不限于可乳化浓缩物(EC)、可湿性粉末(WP)、可溶性液体(SL)、气溶胶、超低容量浓缩液(ULV)、可溶性粉末(SP)、微胶囊、水分散颗粒、流动剂(flowable，FL)、微乳液(ME)、纳米乳液(NE)等。在本文所述的任何制剂中，活性成分的百分比范围为0.01％-99.99％。
所述组合物可以是液体、凝胶或固体的形式。
可以通过将固体载体悬浮于一种或多种活性成分的溶液中，并将所述悬浮液在温和条件(例如在室温下蒸发或者在65℃或更低温度下真空蒸发)下干燥来制备固体组合物。
组合物可包含凝胶封装的活性成份。可以通过将凝胶形成剂(如明胶、纤维素或木质素)与活的或灭活的色杆菌属的培养物或悬浮液、或色杆菌属培养物或悬浮液的无细胞滤液或细胞流分、或喷雾干燥或冷冻干燥的培养物、细胞或细胞流分、或本发明方法中所用的农药化合物的溶液混合；并诱导所述物质的凝胶形成来制备这样的凝胶封装的材料。
所述组合物可以额外地包含表面活性剂以用于乳化、分散、湿润、铺展、整合、崩解控制、稳定活性成分，以及改善流动性或抑制锈蚀。在一具体实施方案中，表面活性剂为对植物无毒的无毒表面活性剂，其优选属于EPAList4B。在另一具体实施方案中，非离子型表面活性剂为聚氧乙烯(20)单月桂酸酯。表面活性剂的浓度可以是总制剂的0.1-35％，优选5-25％。分散剂和乳化剂的选择如非离子、阴离子、两性和阳离子分散剂和乳化剂以及用量由组合物的性质和所述物质促进这些组合物分散的能力决定。
所述组合物还可以包含其它微生物和/或农药(如杀线虫剂、杀真菌剂、杀虫剂)。所述微生物可以包括但不限于源自芽孢杆菌、假单胞菌(Pseudomonassp.)、短芽孢杆菌(Brevabacillussp.)、轮枝菌(Lecanicilliumsp.)、非白粉寄生菌(non-Ampelomycessp.)、二形性酵母菌(Pseudozymasp.)、链霉菌(Streptomycessp)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp)、木霉菌(Trichodermasp)、粘帚霉(Gliocladiumsp.)的物质(agent)。或者，所述物质可以是具有杀真菌和/或杀虫活性的天然油或油产物(如石蜡油、茶树油、香茅油、丁香油、肉桂油、柑橘油、迷迭香油、pyrethram)。此外，所述农药可以是单位点抗真菌剂，其可以包括但不限于苯并咪唑、脱甲基化抑制剂(DMI)(如咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯胺基嘧啶、硫代磷酸酯(phosphorothiolate)、醌外部抑制剂(quinoneoutsideinhibitor)、喹啉、二羧酰亚胺、羧酰亚胺、苯基酰胺、苯胺基嘧啶、苯基吡咯、芳族烃、肉桂酸、N-羟基酰苯胺(hydroxyanilide)、抗生素、多氧菌素、酰胺(acylamine)、邻苯二甲酰亚胺、苯型化合物(benzenoid)(二甲苯基丙氨酸)、脱甲基化抑制剂(选自咪唑(如氟菌唑)、哌嗪、嘧啶和三唑(如联苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、四氟醚唑))、腈菌唑、邻甲酰氨基苯甲酰胺(anthranilicdiamide)(如氯虫酰胺(chlorantranilipole))和醌外部抑制剂(如strobilurin)。strobilurin可包括但不限于腈嘧菌酯、苯氧菊酯(kresoxim-methyl)或布洛芬(trifloxystrobin)。在另一具体实施方案中，抗真菌剂可为醌，如快诺芬(quinoxyfen)(5，7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。抗真菌剂也可以源自虎杖属(Reynoutria)提取物。
杀真菌剂还可以是多位点非无机化学杀真菌剂，其选自氯腈(chloronitrile)、喹喔啉、硫酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、chloralkythios、苯基吡啶胺(phenylpyridin-amine)、氰基乙酰胺肟。
如上所述，所述组合物还可以包含杀虫剂。所述杀虫剂可以包括但不限于阿维菌素、苏云金芽孢杆菌(Bt(例如苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种)、印楝油(neemoil)、多杀菌素、WO2011/106491中提及的伯霍尔德杆菌、昆虫致病性真菌(如球孢白僵菌(Beauveriabassiana))以及化学杀虫剂(其包括但不限于有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、除虫菊酯和新烟碱类)。
如上所述，所述组合物还可以包含杀线虫剂。所述杀线虫剂包括但不限于阿维菌素、微生物产物(如Biome(坚硬芽孢杆菌(Bacillusfirmus))、巴斯德氏芽菌(Pasteuriaspp))和有机产物(如皂苷)。
所述组合物可以利用本领域已知的方法施用。特别地，这些组合物可以施用于植物或植物部分。植物在本发明的上下文中应当理解为表示所有的植物和植物群体，例如期望和不期望的野生植物或作物(包括天然存在的作物)。作物可以是可通过常规植物育种和优化方法或者通过生物技术和遗传工程方法或者通过这些方法的组合获得的植物，包括转基因植物并且包括可以被植物育种者的权利保护或不被保护的植物物种。植物部分应当理解为表示植物的地上和地下的所有部分和器官，例如枝条、叶、花和根，其实例可以描述为叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实、种子、根、块状茎和根状茎。植物部分还包括收获的材料以及营养和生殖繁殖材料，例如插条、块状茎、根状茎、蘖枝和种子。
用上述组合物处理植物和植物部分可以直接进行，或者通过使所述组合物作用于它们的周围环境、栖生地或存储空间进行，例如通过浸泡、喷洒、蒸发、喷雾、散布、涂抹、注射。在将组合物施用于种子的情况下，所述组合物可以作为一种或多种包衣施用于所述种子，然后将所述种子通过本领域已知的方法利用一种或多种包衣进行种植。
用途
上述组合物、培养基、上清液、代谢物和农药化合物可用作为农药。具体而言，上述组合物、培养基、上清液、代谢物和农药化合物可单独使用或与一种或多种上述农药物质组合使用，用作杀昆虫剂和杀线虫剂。
特别地，可以利用上述方法控制的线虫包括但不限于寄生线虫，如根结、胞囊和病变的线虫，包括但不限于根结线虫、矮化线虫(Tylenchorhynchussp.)、纽带线虫(Hoplolaimussp.)、短体线虫(Pratylenchussp.)、孢囊线虫(Heteroderasp.)、孢囊线虫(Globoderasp)、毛刺线虫(Trichodorussp)、拟毛刺线虫(Paratrichodorussp)、剑线虫(Xiphinemasp)和轮刺线虫(Criconemasp)；尤其是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)以及马铃薯黄金线虫(Globoderarostochiensis)和马铃薯胞囊线虫(globoderapailida)、大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)；和燕麦胞囊线虫(Heteroderaavenae)(谷胞囊线虫)。
通过本发明方法控制的植物致病性昆虫包括但不限于以下目的昆虫：(a)鳞翅目，如卷蛾(Aclerisspp.)、茶姬卷叶蛾(Adoxophyesspp.)、透翅蛾(Aegeriaspp.)、地老虎(Agrotisspp.)、棉树叶虫(Alabamaargillaceae)、Amyloisspp.、黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、卷叶蛾(Archipsspp.)、卷蛾(Argyrotaeniaspp.)、夜蛾(Autographaspp.)、玉米楷夜蛾(Busseolafusca)、粉斑螟蛾(Cadracautella)、桃小食心虫(Carposinanipponensis)、水稻螟虫(Chilospp.)、色卷蛾(Choristoneuraspp.)、葡萄果蠹蛾(Clysiaambiguella)、野螟蛾(Cnaphalocrocisspp.)、Cnephasiaspp.、Cochylisspp.、落叶松鞘蛾(Coleophoraspp.)、大菜螟(Crocidolomiabinotalis)、苹果异形小卷蛾(Cryptophlebialeucotreta)、蠹蛾(Cydiaspp.)、蔗螟(Diatraeaspp.)、苏丹棉铃虫(Diparopsiscastanea)、金刚钻(Eariasspp.)、粉斑螟(Ephestiaspp.)、卷叶蛾(Eucosmaspp.)、环针单纹蛾(Eupoeciliaambiguella)、毒蛾(Euproctisspp.)、夜蛾(Euxoaspp.)、食心虫(Grapholitaspp.)、Hedyanubiferana、棉花实夜蛾(Heliothisspp.)、菜螟(Hellulaundalis)、美国白蛾(Hyphantriacunea)、番茄蠹蛾(Keiferialycopersicella)、旋纹潜叶蛾(Leucopterascitella)、细蛾(Lithocollethisspp.)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesiabotrana)、毒蛾(Lymantriaspp.)、潜叶蛾(Lyonetiaspp.)、天幕毛虫(Malacosomaspp.)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、烟草天蛾(Manducasexta)、尺蛾(Operophteraspp.)、欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、银杏超小卷叶蛾(Pammenespp.)、卷叶蛾(Pandemisspp.)、冬夜蛾(Panolisflammea)、棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)、马铃薯块茎蛾(Phthorimaeaoperculella)、菜粉蝶(Pierisrapae)、马醉木(Pierisspp.)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、巢蛾(Praysspp.)、白禾螟(Scirpophagaspp.)、紫螟(Sesamiaspp.)、卷叶蛾(Sparganothisspp.)、夜蛾(Spodopteraspp.)、透翅蛾(Synanthedonspp.)、异舟蛾(Thaumetopoeaspp.)、Tortrixspp.、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)和巢蛾(Yponomeutaspp.)；(b)鞘翅目，如叩甲(Agriotesspp.)、花象(Anthonomusspp.)、谷类蚜虫(Atomarialinearis)、凹胫跳甲(Chaetocnematibialis)、球茎象鼻虫(Cosmopolitesspp.)、麻栎果实象鼻虫(Curculiospp.)、皮蠹(Dermestesspp.)、叶甲(Diabroticaspp.)、食植瓢虫(Epilachnaspp.)、Eremnusspp.、科罗拉多金花虫(Leptinotarsadecemlineata)、象甲(Lissorhoptrusspp.)、鳃角金龟(Melolonthaspp.)、谷盗(Orycaephilusspp.)、葡萄黑耳喙鼻(Otiorhynchusspp.)、Phlyctinusspp.、丽金龟(Popilliaspp.)、跳甲(Psylliodesspp.)、谷蠹(Rhizoperthaspp-)、金龟子科(Scarabeidae)、米象(Sitophilusspp.)、麦蛾(Sitotrogaspp.)、拟步虫(Tenebriospp.)、面象虫(Triboliumspp.)和褐拟谷盗(Trogodermaspp.)；(c)直翅目，如蜚蠊(Blattaspp.)、姬蠊(Blattellaspp.)、蝼蛄(Gryllotalpaspp.)、马德拉蜚蠊(Leucophaeamaderae)、飞蝗(Locustaspp.)、大蠊(Periplanetaspp.)和沙漠蝗(Schistocercaspp.)；(d)等翅目，如堆沙白蚁(Reticulitermesspp.)；(e)啮虫目、如书虱(Liposcelisspp.)；(f)虱目，如吸血虱(Haematopinusspp.)、颚虱(Linognathusspp.)、体虱(Pediculusspp.)、瘿绵蚜(Pemphigusspp.)和根瘤蚜(Phylloxeraspp.)；(g)食毛目，如叮咬虱(Damalineaspp.)和啮毛虱(Trichodectesspp.)；(h)缨翅目，如蓟马(Frankliniellaspp.)、蓟马(Hercinotnripsspp.)、带蓟马(Taeniothripsspp.)、南黄蓟马(Thripspalmi)、烟蓟马(Thripstabaci)和非洲橘硬蓟马(Scirtothripsaurantii)；(i)异翅亚目，如臭虫(Cimexspp.)、可可瘤盲蝽(Distantiellatheobroma)、棉红蝽(Dysdercusspp.)、Euchistusspp.、扁盾蝽(Eurygasterspp.)、稻緣椿(Leptocorisaspp.)、蛛缘蝽(Nezaraspp.)、皮蝽(Piesmaspp.)、锥蝽(Rhodniusspp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergellasingularis)、黑椿(Scotinopharaspp.)和锥蝽(Tniatomaspp.)；(j)同翅目，如丝绒粉虱(Aleurothrixusfloccosus)、菜粉虱(Aleyrodesbrassicae)、盾蚧(Aonidiellaspp.)、蚜虫科(Aphididae)、蚜虫(Aphisspp.)、圆蚧(Aspidiotusspp.)、烟粉虱(Bemisiatabaci)、蜡蚧(Ceroplasterspp.)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalusaonidium)、网籽草叶圆蚧(Chrysomphalusdictyospermi)、扁坚介壳虫(Coccushesperidum)、叶蝉(Empoascaspp.)、绵蚜(Eriosomalarigerum)、叶蝉(Erythroneuraspp.)、Gascardiaspp.、灰飞虱(Laodelphaxspp.)、介壳虫(Lecaniumcorni)、蛎盾蚧(Lepidosaphesspp.)、长管蚜(Macrosiphusspp.)、蚜虫(Myzusspp.)、黑尾叶蝉(Nephotettixspp.)、褐飞虱(Nilaparvataspp.)、Paratoriaspp.、瘿绵蚜(Pemphigusspp.)、动球菌(Planococcusspp.)、白盾蚧(Pseudaulacaspisspp.)、粉蚧(Pseudococcusspp.)、梨木虱(Psyllaspp.)、Pulvinariaaethiopica、圆蚧(Quadraspidiotusspp.)、缢管蚜(Rhopalosiphumspp.)、硬介壳虫(Saissetiaspp.)、带叶蝉(Scaphoideusspp.)、二叉蚜(Schizaphisspp.)、蚜(Sitobionspp.)、温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、非洲木虱(Triozaerytreae)和桔矢尖蚧(Unaspiscitri)；(k)膜翅目，如切叶蚁(Acromyrmex)、切叶蚁(Attaspp.)、麦茎蜂(Cephusspp.)、松叶蜂(Diprionspp.)、松叶蜂科(Diprionidae)、Gilpiniapolytoma、李实蜂(Hoplocampaspp.)、Lasiusspp.、小家蚁(Monomoriumpharaonis)、新松叶蜂(Neodiprionspp.)、红火蚁(Solenopsisspp.)和胡蜂(Vespaspp.)；(1)双翅目，如伊蚊(Aedesspp.)、高粱芒蝇(Antherigonasoccata)、全北毛蚊(Bibiohortulanus)、红头丽蝇(Calliphoraerythrocephala)、蜡实蝇(Ceratitisspp.)、丽蝇(Chrysomyiaspp.)、库蚊(Culexspp.)、黄蝇(Cuterebraspp.)、寡毛实蝇(Dacusspp.)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、厕蝇(Fanniaspp.)、胃蝇(Gastrophilusspp.)、舌蝇(Glossinaspp.)、牛蝇(Hypodermaspp.)、Hyppoboscaspp.、斑潜蝇(Liriomyzaspp.)、绿蝇(Luciliaspp.)、根潜蝇(Melanagromyzaspp.)、家蝇(Muscaspp.)、牛虻(Oestrusspp.)、瘿蚊(Orseoliaspp.)、黑麦秆蝇(Oscinellafrit)、甜菜潜叶蝇(Pegomyiahyoscyami)、草种蝇(Phorbiaspp.)、苹果实蝇(Rhagoletispomonella)、菇蚋(Sciaraspp.)、螫蝇(Stomoxysspp.)、虻(Tabanusspp.)、Tanniaspp.和大蚊(Tipulaspp.)；(m)蚤目，如角叶蚤(Ceratophyllusspp.)和印鼠客蚤(Xenopsyllacheopis)；以及(n)缨尾目，如衣鱼(Lepismasaccharina)。本发明的活性成分还可以用于防治含油种子作物如油菜、芥菜籽及其杂交种以及稻和玉米中的十字花科跳甲(黄条跳甲(Phyllotretaspp.))、根蛆(Deliaspp.)、卷心菜象鼻虫(seedpodweevil)(Ceutorhynchusspp.)和蚜虫。在一具体实施方案中，所述昆虫可以是夜蛾(Spodoptera)的成员，更特别是甜菜夜蛾、桃蚜(Myzuspersicae)、小菜蛾或椿象(Euschistussp.)。
本文提供了有效农药防治量的含有农药活性的代谢物或色杆菌属产生的分离的化合物的上清液、滤液或提取物的施用，或上述物质的组合的施用。以有效防治有害生物的量或杀虫量单独施用菌株、上清液、滤液、提取物、代谢物和/或化合物，或与另一农药物质联合施用。有效量被定义为足以调节有害生物侵害的单独的或与另一农药物质联合的微生物细胞、上清液、滤液或提取物、代谢物和/或化合物的量。有效率可受到存在的有害生物物种、有害生物生长阶段、有害生物群聚密度和环境因素(如每天和每季的气温、风速、雨、时间)所影响。可通过实验室或现场测试来测定具体实例中的落入有效范围的量。
实施例
在以下的非限制性实施例中进一步示例上文所述的组合物和方法。所述实施例对于本文所述的材料、条件、重量比、工艺参数等仅示例各种实施方案，并不限制所要求保护的发明。
实施例1：提取源自Chromobacteriumsubstugae的化合物
下列操作用于纯化从Chromobacteriumsubstugae培养基中提取的化合物：
使用AmberliteXAD-7树脂(Asolkar等人，2006)，通过在室温及225rpm下将细胞悬浮液与树脂振摇2小时，从而提取来自在L-培养液中的10-L的Chromobacteriumsubstugae发酵液的培养液。通过纱布过滤收集树脂和细胞群，使用去离子水洗涤以去除盐。然后在丙酮/甲醇(50/50)中浸泡树脂、细胞群和纱布，持续2小时，然后滤除丙酮/甲醇，使用旋转蒸发仪真空干燥，得到粗提取物。然后使用SephadexLH20排阻色谱法将粗提取物分级(CH2C12/CH3OH；50/50)，从而得到7个流分(图1)。然后将这些流分用旋转蒸发仪浓缩至干燥，然后使用粉纹夜蛾或甜菜夜蛾的饲喂测定来筛选所得干燥残留物的生物活性。然后使活性流分进行反相HPLC(SpectraSystemP4000(ThermoScientific)以得到纯化合物，然后在上述生物测定中筛选以找到/确定活性化合物。为了确认该化合物的鉴别，记录其它波谱数据如LC/MS和NMR。
chromamideA(1)和化合物B分别分离自流分1和2，而紫色杆菌素(2)及脱氧紫色杆菌素分离自流分5，所有物质均获自SephadexLH20色谱法。这些化合物的结构示于图7。
化合物的纯化
通过使用HPLCC-18柱(Phenomenex，Luna10uC18(2)100A，250x10)以及水∶乙腈梯度溶剂系统(0-10分钟；80-75％CH3CN水溶液；10-45分钟；75-60％CH3CN水溶液；45-55分钟；60-50％CH3CN水溶液；55-65分钟；50-100％CH3CN水溶液；65-70分钟；100％CH3CN；55-70分钟；0-80％CH3CN水溶液)，在2.5毫升/分钟的流速下和210nm的紫外线检测下，进行chromamideA(1)的纯化。活性化合物chromamideA(1)的保留时间为23.19分钟。
通过使用HPLCC-18柱(Phenomenex，Luna10UC18(2)100A，250×10)以及水∶乙腈梯度溶剂系统(0-10分钟，80-75％CH3CN水溶液；10-45分钟，75-60％CH3CN水溶液；45-55分钟，60-50％CH3CN水溶液；55-65分钟，50-100％CH3CN水溶液；65-70分钟，100％的CH3CN；55-70分钟，0-80％CH3CN水溶液)，在2.5毫升/分钟的流速下和210nm的紫外线检测下，进行本发明化合物B的纯化，活性化合物B的保留时间为26.39分钟(见图6)。
通过使用HPLCC-18柱(Phenomenex，Luna10UC18(2)100A，250×10)，以及水∶乙腈梯度溶剂系统(0-10分钟；70-60％CH3CN水溶液；10-40分钟；60-20％CH3CN水溶液；40-60分钟；20-0％CH3CN水溶液；60-65分钟；100％CH3CN；65-75分钟；0-70％CH3CN水溶液)，在2.5毫升/分钟的流速和210nm的紫外线测定下，进行紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的纯化，活性化合物紫色杆菌素(2)的保留时间为7.86分钟，而脱氧紫色杆菌素(3)的保留时间为12.45分钟。
化合物的质谱分析
在LCQDECAXPplus质谱仪(ThermoElectronCorp.，SanJose，CA)上，利用全扫描模式的正和负电离模式(m/z100-1500Da)，在ThermoFinniganLCQDecaXPPlus电喷射(ESI)装置上，进行活性峰的质谱分析。热高效液相色谱(HPLC)装置配有FinniganSurveyorPDAplus检测器、自动进样器plus、MS泵和4.6mmx100mmLunaC185μm柱(Phenomenex)。溶剂系统由水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。流动相以10％溶剂B开始，在20min内线性增加至100％溶剂B，并保持4min，最后在3min内返回10％溶剂B，并保持3min。流速为0.5mL/min。进样体积为10μL，并且在室温下将样品保持在自动进样器中。利用LC和反相色谱，通过LC-MS来分析化合物。本发明的化合物的质谱分析在如下条件下进行：对于夹套气(sheath)和辅助/吹扫气(aux/sweep)流速，氮气的流速分别固定为30和15arb。电喷射电离用设定为5000V的喷射电压和35.0V的毛细管电压进行。毛细管温度设定为400℃。数据用Xcalibur软件分析。在正电离模式中，chromamideA(1)的分子量为860(见图2)。另一个活性化合物B的LC-MS色谱在正电离模式中表现出874的分子量。紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)在正离子模式中的分子量分别为313和327。
化合物的NMR波谱分析
在Bruker600MHz梯度场分光计上测量NMR波谱。在内标四甲基硅烷上设定参照(TMS，0.00ppm)，使用Hitachi8800氨基酸分析仪进行氨基酸分析。
关于结构鉴定，使用600MHzNMR仪器进一步分析分子量是860的纯化的chromamideA，其1HNMR的δ值是8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80(见图4)，并且13C-NMR值是173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80(见图5)。以白色固体形式分离chromamideA，通过ESI高分辨率质谱法(实测M+m/z861.5376，理论M+m/z861.5343)分析其分子式为C43H68N6O12(不饱和度为13度)。chromamideA在DMSO-D6中的1HNMR波谱数据显示出68个质子信号，其中9个质子[δH：8.89，8.44，8.23，8.22，7.96，7.64，6.65，5.10，4.13]归属NH或OH，因为在异核关联NMR(HMQC)分析中缺少碳相关。13C-NMR波谱显示7个羰基信号[δC：173.62，172.92，172.25，172.17，171.66，171.28，170.45]，并且在1HNMR波谱中，观察到证明chromamideA是一种肽的6个特征性α-氨基质子信号[δH：4.07、4.06、3.96、3.95、3.88、3.72]。
2DNMR数据的解释使所述6个信号的3个氨基酸单元(1个亮氨酸(LEU)、1个缬氨酸(VAL)和1个谷氨酰胺(Gln))得到归属。氨基酸分析结果证实了这些氨基酸的存在，也显示了上述3种氨基酸的存在。DEPT和2DNMR波谱数据(COSY、HSQC和HMBC)的进一步分析证实如下所示的3个结构I、II和III的存在。
通过常规HMBCNMR分析，使用α-氨基质子和/或仲酰胺质子以及羰基碳共振和化学位移的相关性，证明在1中的3个子结构的连接。通过从CH3-40[δH：1.00]和丙氨酸α-氨基质子[δH：3.42]到C-10碳[δC：70.11]的HMBC相关性，证明子结构I的C-9与结构II的C-10的连接。这通过从[δH：5.10]处的羟基到[δC：49.78]处的C-9的三键HMBC相关性得到进一步的证实。子结构III的[δH：3.50]处的亚甲基显示出与C-19[δc：68.31](连接子结构I和II)的三键HMBC相关。C-3[δC：98.09]处的季碳与C-21[δC：64.40]通过H-21[δH：3.95]与它们的化学位移值的弱关联连接以形成一个环结构。最后，通过从H3-36[δH：1.43]到C-1[δC：172.17]的三键HMBC相关确保了环封闭键，使得chromamideA(1)形成平面的结构。
分子量是874的化合物B表现出类似的NMR和UV数据，表明化合物B也属于肽类。
通过将紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的数据与文献中公开的数据相比较而确定这些化合物的结构。chromamideA、紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的结构如图7所示。
实施例2：chromamideA的氨基酸分析
通过使用液相水解(6N盐酸、1％苯酚，110℃，24小时，真空)来水解chromamideA(0.05mg)。冷却后，将反应混合物干燥，并将水解产物溶于Norleu稀释缓冲液中至体积为1.0mL。将50μL的样本上样到离子交换柱中上以供分析。
关于标准和校准，使用Na基Hitachi8800(Sigma，A-9906)上的蛋白质水解物的氨基酸标准溶液来测定反应因子，并由此对所有氨基酸校准Hitachi8800分析仪。各注射液包含NorLeucine作为内标以就样本体积和色谱变量的变化进行结果修正。系统利用PickeringNa缓冲液、PierceSequanal级盐酸(水解)、Transgenomic离子交换柱和MolecularStructureFacility(MSF)开发的优化方法(UCDavis)来报告样本中存在的各氨基酸。发现样本中存在的氨基酸(chromamideA)是Glx(谷氨酰胺/谷氨酸)、leu(亮氨酸)和Val(缬氨酸)。
实施例3：确定对粉纹夜蛾的毒性
使用一龄粉纹夜蛾幼虫作为测试对象，在体外测定中确定流分1(F1)中的所关注化合物的毒性。
在96孔微量培养板的各孔中分配200微升的市售粉纹夜蛾饲料。在饲料凝固后，将含50μL提取物(对应于流分1中发现的4个峰：H1-H4)的100μL溶液、350μLEtOH和600μL无菌去离子水移液到各孔中，然后将培养板使用手持风扇进行干燥。各培养孔中的提取物的量为10微克。每个处理重复8次，并使用纯乙醇和水的混合物作为阴性对照。
在各孔中放入1只测试用昆虫(一龄粉纹夜蛾幼虫)，并将培养板用密封胶密封。将密封打孔以供透气，并将密封的培养板在26℃孵育4天。
下表1所示的结果显示峰H1的化合物具有良好的活性(＞60％的死亡率)。该特别峰对应chromamideA(1)(图1)。
表1：10ug/孔下的粉纹夜蛾死亡率(％)
F1H1 66.7
F1H2 11.1
F1H3 33.3
F1H4 11.1
实施例4-粉纹夜蛾的紫色杆菌素的LC50测定
使用前述实施例中所述的96孔培养板来测定杀死50％的一龄粉纹夜蛾幼虫所需的纯紫色杆菌素的浓度。在26℃下孵育4天后记录的死亡率值如下表2所示。基于此数据，紫色杆菌素是强效杀虫剂，在体外饲料覆盖(diet-overlay)测定中，估计对粉纹夜蛾幼虫的LC50值为每孔7*10-6微克。
表2：紫色杆菌素对粉纹夜蛾死亡率的影响
紫色杆菌素ug/孔 第4天的％死亡率
10 100
1 100
0.1 100
0.01 100
0.001 100
0.0001 100
0.00001 71.4
0.000001 14.2
1E-07 0
实施例5-Chromobacteriumsubstugae(MBI-203)培养液对根结线虫幼虫的毒性
为评价经过滤灭菌的Chromobacteriumsubstugae对根结线虫幼虫(VW6)(J2)根结线虫死亡率的影响，在24孔塑料细胞培养板上进行下列测试：
将300μL等份的各测试溶液(1倍或0.1倍过滤消毒培养液)加入到适合的孔中，然后将分配于10μL去离子水中的15只线虫加入各孔中，将培养板上盖，在25℃下孵育24小时。水和20,000倍稀释的Avid(阿维菌素)分别用作阴性对照和阳性对照。在24小时后，通过用针探测每只线虫来检测各化合物对线虫活动力的影响，并且将每个处理中不动的线虫的比例以％标度记录在笔记本中。为评价每次处理中的线虫活动力的恢复，从每个孔移除200ul的体积，并且通过加入2mL的去离子水来稀释每个孔中的剩余溶液。将平板如上文所述再温育24小时，然后进行第二次活动力评价(48小时)。
图8和9所示的结果显示未稀释的过滤灭菌的培养液可以固定自由生活的幼年根结线虫。此效果持续48小时，这表明Chromobacteriumsubstugae的培养液具有杀线虫活性。
实施例6：Chromobacteriumsubstugae(MBI-203)培养液对黄瓜根的虫瘿的影响
在两次小型雨淋(minidrench)测试中，测试MBI-203抗根结线虫的内在活性。
材料和方法
具体来说，在45mL盆中进行MBI-203的温室检测。将黄瓜种子cv.Toshka直接播种在装有砂壤土的盆中。10天后，将盆各自用5ml悬浮液处理。然后将盆用根结线虫的3000个卵接种。每种处理和比例准备4个重复。试验施用和接种后14天收获试验。根据Zeck虫瘿指数(zeck，1971)评价根瘿(rootgalling)。具体条件列于下表3中。
与对照组相比，测量作为长出的黄瓜苗生长的降低的植物毒性。
结果：
小型雨淋测试编号1
处理活性非常高，当以50ml/L(MBI-203)的浓度施用后观察到几乎100％的减少。对MBI-203观察到轻微植物毒性。噻唑磷表现照常(在20ppm下100％防治)。
小型雨淋测试编号2
在50ml/L和25ml/L的最高浓度下，MBI-203表现出植物毒性，在这些浓度下无法进行评价。
在12.5ml/L浓度下的线虫防治率超过95％，而在3ml/L浓度下防治率下降到33％。在1.5ml/L的浓度下未记录到任何防治效果。
噻唑磷表现照常(在20ppm下100％防治)。
实施例8：与Chromobacteriumsubstugae(MBI-203)培养液的协同作用研究
在96孔板中，通过处理人工饲料并向线虫幼虫饲喂经处理的饲料来进行协同作用测试。将100μL的处理液移液至各板的多个孔中。使用预设的LC50浓度或其流分来测试单独的MBI-203(浓缩至7.6％细胞干重的全细胞培养液)、单独的市售杀虫剂和二者的组合。将饲料风干以除去过多的水分。将甜菜夜蛾或粉纹夜蛾转移到各孔中。用胶粘板密封器覆盖受到侵染的板，并在每个密封器上钻有1个小孔以供通气。将板存放在26℃培养箱中，在16小时光照/8小时黑暗的循环下持续3天。在侵染后第3天和第4天记录死亡率。
使用(Colby1967)的方法测定协同作用、拮抗作用或加和作用。由于在生物检测上的变化，比率0-0.9视为拮抗关系，比率0.9-1.1视为加和关系，比率超过1.1视为协同关系。
测试MBI-203与杀虫剂对粉纹夜蛾的协同作用。测试氯虫酰胺(商标名为Dupont)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种(Dipel，ValentBiosciences)、多杀菌素(商标名为DowAgroSciences)、螺虫乙酯(商标名为Bayer)和除虫菊/除虫菊酯(商标名为ArbicoOrganics)与MBI-203的协同作用。如上所述，除非另有说明，否则使用MBI-203和杀虫剂的LC50浓度。结果如表4所示。除苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种和一实例外，所有的LC50浓度证明具有协同作用。
表4：MBI-203+杀虫剂：对粉纹夜蛾的效果
测试MBI-203与杀虫剂对甜菜夜蛾(BAW)的协同作用。测试氯虫酰胺(商标名为Dupont)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种(Dipel，ValentBiosciences)、多杀菌素(商标名为DowAgroSciences)、螺虫乙酯(商标名为Bayer)和除虫菊/除虫菊酯(商标名为ArbicoOrganics)与MBI-203的协同作用。如上所述，除非另有说明，否则使用MBI-203和杀虫剂的LC50浓度。结果如表5所示。MBI-203和氯虫酰胺具有加和作用，但苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种和多杀菌素与MBI-203对BAW的防治表现出协同作用。除虫菊与MBI-203的组合具有拮抗作用。螺虫乙酯与MBI-203的组合主要对甜菜夜蛾具有拮抗作用。
表5：MBI-203+杀虫剂：对甜菜夜蛾的防治效果
虽然本发明已记载参考具体实施方案，但其细节不能解释为对本发明具有限制性，对于本领域技术人员显而易见的是可以使用各种等同替代、变化和修改，这些等同替代、变化和修改仍落在本发明范围内。
本文所引用的各种参考文献整体援引加入本文。
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Claims (11)

1.一种降低植物中根结线虫(root-knotnematode)侵害的方法，其包括向所述植物和/或其种子和/或用于使所述植物生长的基质施用有效降低所述根结线虫侵害的量的以下物质：Chromobacteriumsubstugaesp.nov.(NRRLB-30655)的分离菌株的全细胞培养液、或者所述全细胞培养液的上清液、滤液或提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括施用Chromobacteriumsubstugaesp.nov.(NRRLB-30655)的分离菌株的全细胞培养液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括施用所述全细胞培养液的上清液、滤液或提取物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述全细胞培养液、或者所述全细胞培养液的上清液、滤液或提取物施用至所述基质，并且所述基质是土壤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述全细胞培养液、或者所述全细胞培养液的上清液、滤液和/或提取物通过土壤雨淋(drench)施用。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述全细胞培养液、或者所述全细胞培养液的上清液、滤液或提取物施用至所述植物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述全细胞培养液、或者所述全细胞培养液的上清液、滤液或提取物施用至所述种子。
8.一种降低植物中根结线虫(root-knotnematode)侵害的方法，其包括向所述植物和/或其种子和/或用于使所述植物生长的基质施用有效降低所述根结线虫侵害的量的组合物，所述组合物基本由Chromobacteriumsubstugaesp.nov.(NRRLB-30655)的分离菌株的全细胞培养液组成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物施用至所述植物。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物施用至所述种子。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物施用至所述基质，且所述基质是土壤。
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