CN1597930B - 自养黄色杆菌及其杀螺剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自养黄色杆菌及其杀螺剂。一种杀钉螺细菌，即自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)为自养黄色杆菌II(Xanthobacterautotrophicus II)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为AB204050，保藏日期为2003.08.13。用蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基分离菌株，摇瓶发酵方法获得具有杀钉螺作用的自养黄色杆菌菌液(亿级/ml)，该自养黄色杆菌用作杀螺剂的应用，即用该菌液与植物材料附型剂经超声波处理混合配制成新型生物杀螺剂。该杀螺剂具有：①迅速击杀钉螺作用，有效防治钉螺上爬逃逸；②对非靶生物及鱼类无毒害，自然降解迅速，无环境污染问题；③对人畜无毒副作用，维持灭螺药效时间长(15天)；④保藏、运输、使用方便；⑤比已有生物类灭螺制剂及灭螺植物药剂更具独到迅杀显效特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有杀钉螺作用的细菌及其培养方法、用为杀螺剂的用途和用其制备的杀钉螺剂，具体地是一种杀钉螺自养黄色杆菌及其杀螺剂。
背景技术
钉螺是血吸虫的中间宿主，是传染血吸虫病的重要媒介，因而杀灭钉螺是控制阻断血吸虫病传播的有效途径之一；目前世界各国所使用的杀螺剂，多为化学杀螺剂，如早期使用的五氯酚钠，近年来推广应用的溴乙酰胺和烟酰苯胺及氯硝柳胺等，这些杀螺剂不同程度地存在着选择性较弱、持久性差、易造成环境污染等问题，为了避免化学合成灭螺剂对环境的污染，人们一直想获得纯天然的植物灭螺药物。自Archibsld(1933)第一次用Balanites aegyptiace的果实进行灭螺以来，至今已有1000余种植物用于灭螺试验(Marstor，1985；Amusan et al.，1995；belot et al.，1993；Cepleanu et al.，1994；Yamamoto et al.，1996；El-Sawy et al.，1981；糜留西等，1997；陈光，1995；孙振中等，1957)，发现其中20多种植物具有强烈的灭螺作用(Guo，1987)；又如武汉植物研究所和湖北省血防研究所用盾叶薯蓣和根茎粉末来灭螺，取得灭螺率达98.8％的效果(崔天义等，1998)；近年，武汉市血吸虫防治研究所、同济医大寄生虫病教研室、德国海德堡大学热带研究所、武汉市血吸虫病地方病防治办公室等单位的专家联手攻关，用“植物杀手”麻疯树素灭螺取得胜过化学药物的好效果(高霞，1999)，但植物的干品或提取物虽少污染，却基本上与化学合成灭螺剂一样，效果仅一次性，作用不能持久，不能防止钉螺的迁入(李顺意等，1999；马安宁等，1999c，2000)，尤其对于江河湖库洲滩钉螺迁入机会多的螺区，其费工费资与实际灭螺效果就更难令人满意了。
为了弥补化学杀螺剂这些方面的不足，进行生物灭螺方法研究及生物灭螺剂的开发，筛选有效的杀螺微生物日显必要，且对环境保护十分有意义。
经过多年研究工作者的不懈寻找和实验，迄今为止，已经筛选出一些能有效杀灭钉螺的微生物菌株，并且进行了相关方面的研究，如凸形假单胞菌(Psudomonas conrexa chester)是1967年湖南省寄生虫病防治研究所从活田螺体内分离出一株Thp1菌株，1971年又从自然死亡率高达48％的病态钉螺中分离出一株Lb菌株，这两个菌株经鉴定(中科院北京微生物研究所)均为假单胞菌属的凸形假单胞菌，灭螺实验及结果表明：使用浸泡法和喷洒感染钉螺，无论哪一种方法，凸形假单胞菌杀灭钉螺的效果均非常显著，钉螺死亡率均达90％以上，被感染的钉螺一般在2～4天内大部分死亡。但用浸泡法时，每毫升菌液含菌数需要达千万级(千万/mL)时，才显示灭螺效果；用喷洒法，每平方米含菌数需要达万亿级(万亿/m2)时，灭螺效果才稳定。喷洒时，当土壤含水量低于45％，灭螺效果下降；
又如浅灰链霉菌230(Streptomyces griseolus 230)该菌株是1978年从湖南岳阳市楼西湾湖洲土壤中分离出的一株编号为230的放线菌株，经鉴定为浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus 230)[2～4]。通过实验室和现场反复试验，发现其培养物均有较好的杀钉螺作用，实验证明其杀钉螺有效成份是在菌丝体内，为吲哚咔唑并氧杂环化合物(C28H26N4O3)。浅灰链霉菌230的杀螺有效成份称之为抗生素230。抗生素230杀钉螺效果与环境湿度有一定的关系。湿度高杀螺效果好，特别是施用后第一天尤为重要，这可能与抗生素230在水中分解作用快有关，因此毒杀作用主要在施用后第一天。但对鱼具有一定的毒性；
一株杀螺有效微生物的灭螺效果，与其施用方法密切相关，一般而言，由于灭螺必须使微生物与螺体接触才能充分发挥效用，这一点极大地限制了微生物灭螺剂的施用方法，并且由于微生物的株系不同，其生物学特性也不同，同时由于多方面理化因素的影响，例如温度、光照、土壤含水量、灭螺剂的剂型、pH值等，因此微生物灭螺至今还未真正意义的实际应用，大多数试验均为实验室，少数进行现场试验的菌种或制剂，使用的也多是粗粉，现场喷洒实验用量较大，但其中培养基的成份较多；另外所使用的多是现场直接分离的野生菌株，未经选种。而使用微生物制剂灭螺，有效菌种的筛选是关键的步骤。此外，其剂型的选择，减少用量、使用微生物杀螺剂与环境相溶也是能否真正使用其推广使用的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于：提供一种具有较强毒杀钉螺作用的自养黄色杆菌及其培养方法，尤其是提供一种自养黄色杆菌作为杀螺剂的应用和提供一种灭螺效果好的自养黄色杆菌杀螺剂。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：一种自养黄色杆菌，所述的自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)为自养黄色杆菌II(Xanthobacter autotrophicus II)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为AB 204050，保藏日期为20030813。
一种制备自养黄色杆菌的方法：自养黄色杆菌的培养和发酵方法如下：
第一，菌种分离：取频病态钉螺洗洁消毒后研碎，8-12倍水稀释后接种到蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基上，或将从血吸虫和非血吸虫病流行区采集的土壤用8-12倍水稀释后接种到蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基上，26-30℃培养，避光，48-96小时后挑单株分离菌种；第二，菌种培养：将挑单株分离菌种接种到蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基上作平板或斜面增菌培养，26-30℃培养，避光，48-96小时；第三，菌液摇瓶发酵培养：用消毒300ml三角瓶，装120ml摇瓶发酵培养液，取0.5-1cm2平板或斜面增菌活化菌株，纱布棉塞封瓶口，摇瓶转速120-180转/分，26-28℃，72-96小时；得具有杀钉螺作用的自养黄色杆菌菌液；
上述蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基是将蛋白胨6-10g、牛肉胨浸膏2-5g、琼脂20g、加蒸馏水1000ml配制而成，摇瓶发酵培养液是将蛋白胨12-18g、牛肉胨浸膏5.2-8.5g、磷酸氢二钾1-2g、碳酸钙3-6g、硫酸镁1-2g、氯化钠1-2g、硫酸铵2-4g、酵母粉6-12g、玉米粉45-72g、植物油(金龙鱼食用调和油)2-4ml及水2000ml混合；上述蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面菌种分离培养基和摇瓶发酵培养液均用氢氧化钠或碳酸氢钠调pH7.2～7.4，120-131℃灭菌20-30min，冷却后至室温备用；
自养黄色杆菌作为杀螺剂的应用，利用自养黄色杆菌的杀螺作用与植物附形剂制备成具有良好杀钉螺效果的自养黄色杆菌杀螺剂。
自养黄色杆菌的杀螺剂是：
将用上述方法制备的具有杀钉螺作用的自养黄色杆菌菌液与植物附形剂混合组成一种自养黄色杆菌杀螺剂，其中，菌液∶植物附形剂＝1000ml∶1000g；混合物经800-1500Hz超声震荡处理。
上述植物附形剂为具有杀钉螺作用植物的细屑粉末，即将具杀钉螺作用的植物茎叶、干燥研磨或微波杀菌干燥研磨成粉末，粉末过60-120目筛。
上述具有杀钉螺作用的植物附形剂为虾钳草(又名空心莲子草)和夹竹桃叶的粉末混合物；虾钳草与夹竹桃叶重量比例为70∶30。
本发明自养黄色杆菌具有较强的杀螺作用，用其菌液与植物附形剂配制的杀螺剂具有下述优点：1、对环境无毒副无污染，自然降解迅速；2、对钉螺能迅速击杀，有效降低了钉螺上爬逃逸现象；3、对人畜无毒副作用，对非靶生物及鱼类无毒杀作用，维持灭螺时间长(15天以上)；4、保藏，运输、使用方便；5、比纯菌液或植物粗粉末灭螺效果好，且减少了用药量。
下面结合具体实施方式进一步说明本发明的优点及制造方法和用途。
具体实施方式：
1.材料和方法
1.1杀螺菌株自养黄色杆菌II(Xanthobacter autotrophicus II)是从湖南岳阳洞庭湖畔的钉螺孳生地洲滩土壤和自然死病螺体中筛选分离出的具有较强杀螺效果的菌株之一，自养黄色杆菌属(Xanthobacter Wiegel et al.，1978)，自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)。
1.2菌种检测
菌落：圆形、微隆起、均匀、表面光滑、湿润、黄色；细胞杆状、多形、产粘液、革兰氏染色阴性、接触酶阳性、能利用丙酸盐、吐温40、吐温80和琥珀酸、乙酸、丙酮酸甲酯、奎尼酸、D一葡糖二酸、硝酸盐还原阳性、自养。
1.3培养基及方法
分离菌种用培养基配方：蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基
取频病态钉螺5-10只，洗洁后用1‰汞水溶液表层涮洗消毒，用蒸馏水涮洗后迅速研碎，10倍水稀释后涂抹法接种上述平板或斜面培养基上，或取5g从湖南岳阳洞庭湖畔的钉螺孳生地洲滩土壤中到的细土置三角烧瓶加45ml蒸馏水，充分混均，作连续10倍稀释后倾注法接种到上述平板或斜面培养基上，28℃培养，避光，3d后挑单株分离菌种。
斜面增菌(活化菌株)用培养基同分离菌种用培养基配方。
将挑单株分离菌种接种到上述培养基上28-30℃，72-96h，常压通气培养，昼夜光照3600Lox12h。
杀螺菌株摇瓶发酵培养基配方：
用NaHCO3或NaOH调pH7.2-7.4，121℃灭菌30min，冷却室温后接种；消毒300ml三角瓶，装120ml摇瓶发酵培养液，0.5cm2平板或斜面活化菌株，纱布棉塞封瓶口，摇瓶转速120转/分，28℃，72-96h。含菌数：5000万-1亿菌/1ml。
2.实验结果
2.1水浸杀螺效果
取2ml上述摇瓶发酵4d后菌液，滴入998ml去氯水烧杯中搅拌均匀，自养黄色杆菌液室内浸杀钉螺试验，室温28℃，(每样处理30只螺，实验重复3次平均值)
实验中发现当每毫升菌液含菌数达千万级(如3-5千万菌/ml)时，显示灭螺效果，达亿级(亿/ml)时，效果显著均为100％，死螺测定用敲击法。
2.2现场粗提菌粉喷洒效果
现场试验在武汉市东郊天兴乡三队堤外水洼处，选择钉螺密度较高地带，实验时间为2003年10-11月，气温16-24℃间，土表pH7.5，较潮湿，土壤含水量达40％。自养黄色杆菌培养3-5d后，拌沙真空干燥(W∶W＝100ml∶100g)，砂菌粉30g/m2，喷洒10m2样地，试验第3d、7d、12d、15d统计死螺数，杀螺效果不明显，死螺绝对数不高，15d最高仅达20％左右，但抑螺较明显，即多数螺闲厣，不活动停食。
3.讨论
3.1自养黄色杆菌II水浸实验杀螺效果明显，启效快，48h后杀螺效果可达95％以上，但要求水浸杀螺菌液的含菌数需达3000万菌/1ml才显示杀螺效果，达5000万菌/1ml以上杀螺菌液，杀螺效果显著。
3.2自养黄色杆菌II粗砂搅拌真空干燥(50℃以内烘干)菌粉，现场杀螺效果不佳，虽然砂拌可达均匀泼洒目的，但菌粉发挥效力还需借潮湿和水传播，尤其在洲难水线上，实验中可见粗砂菌粉若洒入水边水线处，杀螺效果明显好于旱地，洒入草滩中可见明显抑螺效果，即螺普遍闭厣，爬行不活跃。
使用上述自养黄色杆菌菌液杀螺效果好，但其用量大，运输、使用不方便；用菌粉则灭螺效果欠佳。由于杀螺植物的茎叶等粗屑粉末已有人试验，但粗提物杀螺应用用量大，效果欠佳，源料植物资源也存问题。能否降低用量，增强效果，既解决部分源料困难，又提高杀螺效果，为此我们把植物粉末作为杀螺微生物菌液的附形物，制造成粉末状新型杀螺剂，不仅便于运输、包装、耐贮存，也便于使用增效，现场试验显示灭螺效果良好。
自养黄色杆菌作为杀螺剂的应用，利用自养黄色杆菌的杀螺作用与植物附形剂制备成具有良好杀钉螺效果的自养黄色杆菌杀螺剂。
自养黄色杆菌杀螺剂：
1.材料与方法
1.1自养黄色杆菌II(Xanthobacter autotrophicus II)
蛋白牛肉胨摇瓶培养基，300ml三角瓶，装入100-120ml培养基，150转/分，28℃，通气培养4-7d收获，镜检5000万菌以上/ml即可。
1.2杀螺植物粉末：虾钳草(Alternanthera philoxeroides)夹竹桃(Nerium undicum)新鲜叶，茎表皮微波迅速干燥。分别研碎，粉末通过60～120目筛(颗粒0.20mm以下)均一粉末。50℃以内真空干燥粉末含水量不得超过3％。夹竹桃叶粉末∶虾钳草粉末：(W.W.W重量比)30∶70。
1.3自养黄色杆菌杀螺剂：
杀螺植物混合干粉末与自养黄色杆菌液1∶1搅拌混合，即1000ml菌液加1000g植物混合粉末，800-1500Hz超声震荡，充分搅拌后，50℃以下真空干燥12h，塑料封口包装，贮藏或现场应用。
2.结果
2.1自养黄色杆菌杀螺剂室内浸泡杀螺试验：
自养黄色杆菌杀螺剂5克粉末倒入1000ml去氯水中，每烧杯分装100ml杀螺剂液，置入一袋阴性成螺，每袋装30螺，室温28℃.，浸泡24-72h，实验重复4次取平均值，检查比较结果如下：
死螺检验用水测法和敲击法。
2.2现场试验及效果比较
30g/m2自养黄色杆菌杀螺剂，均匀喷洒潮湿水线上密螺带，或江滩密螺草滩处，单位面积内查螺计数，并辅助人工投螺，满足实验要求；试验时，当地气温16-24℃、微风、天气多为阴天、晴天、小雨，转换频繁；试验结果如下：
试验日期2004.4.5-7.2，当地气温22-34℃，土表pH 7.5。
| 杀螺剂 | 用量(g/m2) | 喷洒面积(m2) | 钉螺数量(只) | 3d死螺率(％) | 7d死螺率(％) | 15d死螺率(％) |
| 紫红链霉菌(砂拌) | 30 | 3 | 100 | 2 | 15 | 20 |
| 夹竹桃叶粗粉 | 30 | 3 | 100 | 16 | 58 | 75 |
| 枫扬树叶粗粉 | 30 | 3 | 100 | 3 | 15 | 30 |
| 银杏果皮粗粉 | 30 | 3 | 100 | 3 | 17 | 54 |
| 紫红链霉菌杀螺剂 | 30 | 3 | 100 | 26 | 86 | 92 |
| 自养黄色杆菌杀螺剂 | 30 | 3 | 100 | 80 | 98 | |
| Napcp | 10 | 3 | 100 | 70 | 95 | |
| 氯硝柳胺 | 2 | 3 | 100 | 52 | 77 |
试验重复二次，水浸法测试螺死活。
2.3潮湿水浸土表较草丛旱地杀螺效果好
粉末状药剂洒在潮湿土表或隔天洒水浸润土表，可以增强药效，增加杀螺效果，喷洒杀螺植物粉末和自养黄色杆菌杀螺剂后的土表钉螺，全部闭厣不活动，停食，数天内原位不移动，但水浸检测时，仍有活螺，可见生物杀螺剂首先作用是抑螺，随着施药后天数增加，有效成分溶化至环境地表，约3天后才多见杀螺效果显现。
本发明杀螺剂具有制造原料充足、用量低，速杀药效好，时效长特点。
Claims (4)
1.一种自养黄色杆菌，其特征在于自养黄色杆菌(Xanthobacter autrophicus)为自养黄色杆菌II(Xanthobacter autrophicus II)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：AB204050，保藏日期为20030813。
2.一种自养黄色杆菌的生产方法，其特征在于其培养和发酵方法如下：
第一，菌种分离：取频病态钉螺洗洁消毒后研碎，8-12倍水稀释后接种到蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基上，或将从血吸虫和非血吸虫病流行区采集的土壤用8-12倍水稀释后接种到蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基上，26-30℃培养，避光，48-96小时后挑单株分离菌种；第二，菌种培养：将挑单株分离菌种接种到蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基上作平板或斜面增菌培养，26-30℃培养，避光，48-96小时；第三，菌液摇瓶发酵培养：用消毒300ml三角瓶，装120ml摇瓶发酵培养液，取0.5-1cm2平板或斜面增菌活化菌株，纱布棉塞封瓶口，摇瓶转速120-180转/分，26-28℃，72-96小时；得具有杀钉螺作用的自养黄色杆菌菌液；
上述蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面培养基是将蛋白栋6-10g、牛肉浸膏2-5g、琼脂20g、加蒸馏水1000ml配制而成，摇瓶发酵培养液是将蛋白胨12-18g、牛肉浸膏5.2-8.5g、磷酸氢二钾1-2g、碳酸钙3-6g、硫酸镁1-2g、氯化钠1-2g、硫酸铵2-4g、酵母粉6-12g、玉米粉45-72g、植物油2-4ml及水2000ml混合；上述蛋白牛肉胨琼脂平板或斜面菌种分离培养基和摇瓶发酵培养液均用氢氧化钠或碳酸氢钠调pH7.2～7.4，120-131℃灭菌20-30min，冷却后至室温备用。
3.一种自养黄色杆菌的用途，其特征在于如权利要求1所述的自养黄色杆菌作为杀螺剂应用。
4.一种自养黄色杆菌杀螺剂，其特征在于所述杀螺剂由如权利要求1所述的自养黄色杆菌菌液与植物附形剂组成，菌液∶植物附形剂＝1000ml∶1000g；植物附形剂为具有杀钉螺作用植物的细屑粉末，粉末为60-120目，或为虾钳草植株和夹竹桃叶粉末的混合物，虾钳草粉末与夹竹桃叶粉末重量比为70∶30。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: HUBEI UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: YANG JIANMING Effective date: 20090807 |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20090807 Address after: Department of science and technology, Hubei University, Xueyuan Road 11, Hubei, Wuhan Province, China: 430062,: () Applicant after: Hubei University Address before: School of life science, Hubei University, Wuchang 11, Wuhan, Hubei Province, Xueyuan Road: 430062 Applicant before: Yang Jianming |
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Granted publication date: 20110202 Termination date: 20110818 |