CN101974454B

CN101974454B - 一种拟除虫菊酯类农药降解菌及其菌剂

Info

Publication number: CN101974454B
Application number: CN 201010284118
Authority: CN
Inventors: 胡美英; 钟国华; 陈少华; 杨柳; 林庆胜
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2030-09-15
Also published as: CN101974454A

Abstract

本发明公开了一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌，所述降解菌为HP-S-01，经鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)，菌种保藏号为CCTCC M 2010096，该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM016873；本发明同时公开了采用所述降解菌制备菌剂的方法。本发明菌剂生产成本低，使用方便，降解效果好，直接施用可使作物中的高效氯氰菊酯农药残留量降低80％以上，解决了农业生产中高效氯氰菊酯农药残留超标的问题，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积使用，对促进生产无公害蔬菜、绿色食品具有重要的意义。

Description

一种拟除虫菊酯类农药降解菌及其菌剂

技术领域

本发明提供一种拟除虫菊酯类农药降解菌及其菌剂，属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产。

背景技术

拟除虫菊酯类农药是20世纪70年代在农业上推广应用的一类仿生杀虫剂，它以神经钠离子通道为作用靶标，具有高效、低毒等特点，在农业害虫和卫生害虫防治中得到广泛应用。目前其品种数和使用量仅次于有机磷农药，占杀虫剂市场的第二位，约占世界农药市场的1/4，在我国的使用面积已占杀虫剂总施用面积的1/3以上。高效氯氰菊酯是拟除虫菊酯类农药的一种，广泛用于防治果树、蔬菜、禾谷类、烟草等作物的鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫。由于高效氯氰菊酯对光、热较稳定，加上长期大量使用，不仅造成农产品污染和环境污染，而且残留的农药通过食物链富集，直接或间接地危害人体健康。近年来随着人们生活水平的提高，人们对食品安全问题及环境生态日益重视，果蔬农药残留亦成为公众关注的焦点之一。

果蔬农药残留治理新技术是食品安全生产的关键配套技术。控制农药污染源以及残留治理新技术研究是解决食品中农药残留的基本方法。目前减少农药残留污染的研究大多集中在选用高效低毒低残留的化学农药和生物农药、改进剂型及应用技术方面，但是收效甚微。农产品生产过程中农药的不可减少，寻求高效、安全、经济的农产品农药残留处理新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾，已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的重大科研命题。利用微生物降解剂处理农产品，是农药残留控制处理的新领域、新途径，具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点，目前许多发达国家和大公司企业都投入巨资以从事农药残留高效降解菌的研究开发。实验室和实际应用研究都表明利用微生物降解果蔬中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。现有技术中本课题组已拥有降解菌的发明专利(200710030304.2，公开号：CN 101157901A，公开日2008年4月9日)，该专利是一株枝孢菌属Hu-01，能有效降解毒死蜱农药残留。

高效氯氰菊酯是近年来使用非常广泛的一种拟除虫菊酯类农药，目前还没有发现专门针对高效氯氰菊酯农药的降解菌剂。

发明内容

本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种新的拟除虫菊酯类农药降解菌及其菌剂。得到的菌剂可以使高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯(功夫)等拟除虫菊酯类农药的残留量降低80％以上，具有较高的降解效果，生产和使用成本低。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明的技术方案是提供一种拟除虫菊酯类农药降解菌，其特征在于所述降解菌为HP-S-01，经鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)，于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉大学保藏中心)保藏，保藏日为2010年4月21，保藏编号CCTCC M 2010096，该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM016873。

该菌是采用富集培养法筛选获得：将100mL的基础培养基装到250mL三角瓶中灭菌，冷却后无菌条件下加入菊酯农药使其终浓度为100mg·L^-1，同时加入于广东省采集污泥土样10g于30℃、180r·min^-1摇床培养7d后，按10％的接种量转接到第二批含250mg·L^-1菊酯农药的基础培养基中。相同条件培养7d后，再按10％的接种量转接到含菊酯农药均为500mg·L^-1的基础培养基中，继续培养7d。此时取0.1mL基础培养基发酵液反复进行平板划线分离，直至得到单菌落，将单菌落接种到试管斜面培养基上，于4℃冰箱内保存。其中的基础培养基为：NH₄NO₃ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O 1000mL，pH 7.0。

所述除虫菊酯类农药降解菌制备方法包括以下步骤：

菌种采用砂土管保存法保存。将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的菌种在固体平板上活化，接种于试管斜面，按照以下配方配制高氏合成1号培养基：硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，可溶性淀粉20g，蒸馏水1000mL。在pH 7.5的液体高氏合成1号培养基中，接入0.1g湿菌体，在26℃，150r·min^-1的摇床中培养1-7d。

本发明还提供了一种拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，是由以下制备方法获得：

(1)将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的菌种在固体平板上活化，接种于试管斜面；

(2)将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的斜面菌种接种于高氏合成1号培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

(3)将步骤(2)菌种按照8％～10％的接种量种入种子罐，培养至对数生长期；

(4)将达到对数期的种子液按照8％～10％的接种量接种入生产罐培养；

(5)培养液经离心取上清菌液，菌液立即加入保护剂，分装成液体剂型。

步骤(3)所述种子罐培养条件为无菌空气的通气量为0.45～0.60m³/min，搅拌速度为200～300r·min^-1，温度26℃。

步骤(3)种子罐所用的培养基配方为：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，NaCl0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄ 0.05％，FeSO₄ 0.001％。

步骤(3)所述种子罐按容积量80％投料，投料完成后在1.1Kg/cm³的压力下、121℃条件下灭菌，冷却至26℃后备接种。

步骤(4)所述生产罐的培养条件是无菌空气的通气量为0.45～0.60m³/min，搅拌速度为100～200r·min^-1，培养温度为26～28℃，培养时间为112～120h。

步骤(4)所述生产罐所用培养基配方为：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，NaCl0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄ 0.05％，FeSO₄ 0.001％。

步骤(4)所述生产罐按照投料量∶容量＝0.08～0.1∶1的比例投料，投料后在1.1Kg/cm³的压力下、121℃条件下灭菌，冷却至26℃后，通无菌空气保持无菌状态备接种。

步骤(5)所述保护剂组成为氯化钠质量分数为0.7％，甘氨酸质量分数为0.35％，苯甲酸钠质量分数为0.03％，凯松体积分数为0.17076％，甘油的体积分数为8.37801％。

使用所述除虫菊酯类农药降解菌生产菌剂的工艺步骤为：斜面种-摇瓶种-种子罐培养-生产罐培养-包装为液体剂型。

该拟除虫菊酯类农药降解菌可以应用于降解拟除虫聚酯类农药残留。包括降解高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯或高效氯氟氰菊酯。应用时，施用量为每平方米农田施用50mL含0.3g干菌丝的降解菌菌液。

本发明的有益效果是：

(1)拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01能使高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯(功夫)等拟除虫菊酯类农药的残留量降低80％以上，使用该降解菌剂，成功解决了农产品生产过程中农药的使用与高效、安全、经济的防治病虫害的矛盾，又可生产出无毒无公害的绿色农产品，可以再果蔬的正常生长过程中使用化学农药防治病虫害而保证果蔬中农药残留量符合绿色食品要求。

(2)本发明生产的农药残留高效降解菌剂具有生产成本低，使用方便，降解效果好的优点，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品标志的地方大面积使用。

(3)本发明促进协调统一病虫害防治用药与食品安全，大规模推广使用果蔬农药微生物处理，生产无公害蔬菜、绿色食品具有重要的意义。

本发明所提供一种拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01，经鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)，于2010年4月21日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC M 2010096。主要生物学特征为：在高氏合成1号平板培养基上菌落较小，圆形，质地致密，表面褶皱，呈粉状，边缘整齐，具同心环，周围具辐射状菌丝，新鲜菌落白色，随着生长时间的增加，菌落颜色逐渐加深，最终气生菌丝呈鼠灰色；基内菌丝呈黄色，基丝、气丝发育良好，基丝不断裂；孢子丝螺旋形，孢子近圆形，大小为0.9555～1.4815μm，外壁光滑。在高氏合成1号液体培养基上培养呈小球形，颜色浅黄色。革兰氏染色阳性。具有明胶液化快，纤维素上生长良好，淀粉水解，牛奶凝固与弱胨化，还原硝酸盐，产生褐色色素，不产生硫化氢气体，同时能够强利用葡萄糖、麦芽糖、L-鼠李糖、D-半乳糖；弱利用甘露醇、D-果糖、甘油、蔗糖、D-木糖；不利用D-海藻糖。该菌株的16S rDNA的Genbank登录号为HM016873。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的制备方法及生长状况测定：

将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的菌种在固体平板上活化，接种于试管斜面。按照以下配方配制高氏合成1号培养基(

Synthetic MediumNo.1)：硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，可溶性淀粉20g，蒸馏水1000mL。在pH 7.5的液体高氏合成1号培养基中，接入0.1g湿菌体，在26℃，150r·min^-1的摇床中培养1-7d。

培养时间与降解菌HP-S-01的生长状况的关系见表1。

表1培养时间对拟除虫菊酯类农药降解菌菌丝体干重的影响

注：以上结果3次重复平均值(

±标准误SE)。

实施例2

降解菌HP-S-01对高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯(功夫)的降解效果：

在基础盐培养基(组分为：NH₄NO₃ 1.0g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，水1000mL，pH 7.5)中分别加入终浓度为50mg.L^-1的高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯(功夫)等拟除虫菊酯类农药，接种降解菌HP-S-01，并设不接菌的培养基为对照，摇床培养2d后高效液相色谱法检测农药的降解情况，结果见表2。结果表明降解菌可以有效去除高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯(功夫)等拟除虫菊酯类农药残留，具有很好的降解效果。

表2降解菌HP-S-01对高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氟氰菊酯的降解效果

注：以上结果3次重复平均值(

±标准误SE)。

降解率(％)＝(1-C₁/C₀)×100％

C₁：降解菌处理农药残留浓度(mg.L^-1)；C₀：对照处理农药残留浓度(mg.L^-1)。

实施例3

(1)将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的菌种在固体平板上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用；

(2)试管接种于含250mL的高氏合成1号培养基1000mL摇瓶中，恒温振荡至对数期，准备接种种子罐；

(3)种子罐100L，投料量80L，培养基配方为：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，NaCl 0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄ 0.05％，FeSO₄ 0.001％，投料完成后在1.1Kg/cm³的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至26℃后，将上述培养好的接菌菌种按8％～10％的接种量接种于100L种子罐，培养至对数生长期，无菌空气的通气量为0.45～0.60m³/min，搅拌速度为200～300r·min^-1。

(4)将到达对数期的种子液按照8％～10％的接种量投入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量1吨，投料量为0.08～0.1吨。投料后的生产罐，在1.1Kg/cm³的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至26℃后，通无菌空气，通气量为0.45～0.60m³/min，搅拌速度为100～200r·min^-1，培养温度为26～28℃，本步骤整个工艺培养流程时间为112～120h。

(5)发酵完成后培养液经12000r·min^-1培养液条件下离心取上清菌液，菌液立即加入保护剂：氯化钠质量分数为0.7％，甘氨酸质量分数为0.35％，苯甲酸钠质量分数为0.03％，凯松体积分数为0.17076％，甘油的体积分数为8.37801％，分装成液体剂型。

1.在以50mg·L^-1的高效氯氰菊酯农药为唯一碳源的基础盐培养基中，接种0.2％生长至对数期的HP-S-01菌液，并设不接菌的培养基为对照，在不同时间测定其对高效氯氰菊酯农药的降解性能。摇床培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后高效液相色谱法分别检测农药的残留量，结果见表3。结果表明降解菌菌液可以有效去除高效氯氰菊酯农药残留，具有很好的降解效果。

表3降解菌HP-S-01对高效氯氰菊酯的降解性能

注：以上结果3次重复平均值(

±标准误SE)。

2.用本发明的菌剂进行田间农药残留降解试验示范

在田间选取未经施药的菜心，划出18个小区，每小区6m²，分别用手提式喷雾器喷施1000X、1500X、2000X的4.5％的高效氯氰菊酯乳油，施药量约为1g/667m²，对照和处理相间排列。施药后2天均匀喷施降解菌菌液，每小区300mL，以清水做对照，喷施菌液1、2、3天后按五点取样法取菜心样气相色谱法测定其农药残留含量，结果见表4。结果表明降解菌菌剂可以有效去除高效氯氰菊酯农药残留，具有很好的降解效果。

表4降解菌HP-S-01田间高效氯氰菊酯降解试验

注：1)以上结果3次重复平均值(

±标准误SE)。

2)表中同列数据后标有相同字母者表示在5％水平差异不显著(DMRT法)。计算公式如下：

式中：

C＝标准品浓度(mg·L^-1)

S₁＝标准品峰面积

S₂＝样品峰面积

V₁＝标准品进样体积(μL)

V₂＝样品进样体积(μL)

G＝样品质量(g)

V＝定容体积(mL)。

Claims

1.一种拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01，经鉴定为链霉菌属（Streptomyces sp.），于2010年4月21日寄存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏号为CCTCC M 2010096，该菌株的16S rDNA 的Genbank 登录号为HM016873。

2.一种培养权利要求1所述拟除虫菊酯类农药降解菌的方法，其特征在于包括以下步骤：菌种采用砂土管保存法保存，将高效氯氰菊酯降解菌HP-S-01的菌种在固体平板上活化，接种于试管斜面，按照以下配方配制高氏合成1号培养基：硝酸钾 1g，磷酸氢二钾 0.5g，硫酸镁 0.5g，氯化钠 0.5g，硫酸亚铁 0.01g，可溶性淀粉 20g，蒸馏水 1000mL；在pH 7.5的液体高氏合成1号培养基中，接入0.1g湿菌体，在26 ℃，150 r·min^-1的摇床中培养1-7d。

3.一种拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，其特征在于由以下制备方法获得：

⑴ 将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的菌种在固体平板上活化，接种于试管斜面；

⑵ 将拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01的斜面菌种接种于高氏合成1号培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

⑶ 将步骤⑵菌种按照8%～10%的接种量种入种子罐，培养至对数生长期；

⑷ 将达到对数期的种子液按照8%～10%的接种量接种入生产罐培养；

⑸ 培养液经离心取上清菌液，菌液立即加入保护剂，分装成液体剂型；

所述拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01于2010年4月21日寄存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏号为CCTCC M 2010096。

4.根据权利要求3所述拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，其特征在于步骤⑶所述种子罐培养条件为无菌空气的通气量为0.45～0.60 m³/min，搅拌速度为200～300 r·min^-1，温度26℃；所述种子罐按容积量80%投料，投料完成后在1.1Kg/cm³的压力下、121℃条件下灭菌，冷却至26℃后备接种。

5.根据权利要求3所述拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，其特征在于步骤⑶所述种子罐或步骤（4）所述生产罐所用的培养基配方为：可溶性淀粉 2%，KNO₃ 0.1%，NaCl 0.05%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，FeSO₄ 0.001%。

6.根据权利要求3所述拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，其特征在于步骤⑷所述生产罐的培养条件是无菌空气的通气量为0.45～0.60 m³/min,搅拌速度为100～200 r·min^-1，培养温度为26～28℃，培养时间为112～120h；所述生产罐按照投料量：容量=0.08～0.1:1的比例投料，投料后在1.1Kg/cm³的压力下、121℃条件下灭菌，冷却至26℃后，通无菌空气保持无菌状态备接种。

7.根据权利要求3所述拟除虫菊酯类农药降解菌菌剂，其特征在于步骤⑸所述保护剂组成为氯化钠质量分数为0.7%，甘氨酸质量分数为0.35%，苯甲酸钠质量分数为0.03%，凯松体积分数为0.17076%，甘油的体积分数为8.37801%。

8.权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药降解菌HP-S-01在降解拟除虫菊酯类农药残留方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的拟除虫菊酯类农药为高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、溴氰菊酯或高效氯氟氰菊酯。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于应用量为每平方米农田施用含0.3g干菌丝的降解菌菌液。