CN102911881B - 拟除虫菊酯类农药残留降解菌及降解菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟除虫菊酯类农药残留的降解菌及降解菌剂和应用。所述菌株为酵母菌(Candidasp.)ZS-02，菌种保藏号为CCTCCM2011383。应用所述酵母菌(Candidasp.)ZS-02制备得到的降解菌剂生产成本低，使用方便，降解效果好，直接施用可使土壤和作物中农药残留量降低75%以上，解决了农业生产中农药残留超标问题，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积使用，对促进生产无公害农产品、绿色食品具有重要的意义。

Description

拟除虫菊酯类农药残留降解菌及降解菌剂和应用

技术领域

本发明属于生物高技术领域，涉及一种利用微生物的方法降解化学农药残留的技术，具体涉及一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌及降解菌剂，以及在现代农业生产领域绿色无公害农产品的生产与加工方面的应用。 

背景技术

拟除虫菊酯农药是一类高效杀虫剂，广泛应用于农作物及家庭卫生害虫防除。目前其品种数和使用量位居杀虫剂市场的第2位，约占世界农药市场的1/4，在我国的使用面积已占杀虫剂总施用面积的1/3以上。第二代以后的拟除虫菊酯类农药具有对光、热稳定的特点，在环境中半衰期较长，很难在自然条件下快速降解，加之长期频繁使用，有关其残留超标问题日趋严重，目前已成为我国出口蔬菜、水果中主要的3 类农药残留之一。 

发明内容

大量研究表明，拟除虫菊酯类农药低剂量残留具有显著的生物毒性，对多种动物，包括人类的内分泌系统、生殖系统、神经系统和免疫系统可产生严重危害。另外，部分拟除虫菊酯类农药还具有蓄积毒性，长期接触可引起某些慢性疾病。因此，联合国粮食与农业组织（FAO）和世界贸易组织（WTO）对拟除虫菊酯类农药在农产品中的残留作出严格的限量标准，欧盟、美国、日本等发达国家和地区相应的要求更为严格，最大残留限量标准提高了几十到上百倍，对我国部分农副产品出口带来严重的影响。 

近年来随着人们生活水平的提高，人们迫切需要无农药残留污染的清洁绿色食品。利用微生物降解剂处理农产品，是农药残留控制处理的新领域、新途径，具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点，是国际上残留农药处理技术研究的前沿和热点。目前许多发达国家和大公司企业都投入巨资以从事农药残留高效降解菌的研究开发。实验室和实际应用研究都表明利用微生物降解果蔬中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。 

但是，利用微生物实现对农药进行降解，机理十分复杂，具有很强的针对性。目前还没有发现针对拟除虫菊酯类农药的降解菌以及相关生物制剂。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有拟除虫菊酯类农药的生物降解技术的空白，提供一株拟除虫菊酯类农药残留降解菌，其具有很好的拟除虫菊酯类农药降解活性。 

本发明的另一个目的是提供一种新的生物制剂，应用所述拟除虫菊酯类农药残留降解菌制备得到一种新的菌剂。 

本发明还有一个目的是提供所述菌剂的应用，所述菌剂可以应用于使联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药及其主要中间产物间苯氧基苯甲酸的残留量降低75%以上，具有很好的降解效果，生产和使用成本低。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 

本发明提供一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌，所述菌株为酵母菌（Candida pelliculosa）ZS-02，于2011年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为湖北武汉市武昌珞珈山），菌种保藏号为CCTCC M 2011383。

所述菌株经鉴定为假丝酵母属(Candida sp.)，细胞椭圆形，长3～4 μm，宽2～3 μm；菌落乳白色，圆形，边缘规则整齐；接触酶试验、氧化酶试验阳性；可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、木糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、山梨醇、棉子糖、α-甲基-D-葡萄糖苷；该菌株的18S rDNA 的GenBank 登录号为JN700989。 

所述拟除虫菊酯类农药残留降解菌可应用于去除拟除虫菊酯类农药及其中间物残留。具体可用于制备去除去除拟除虫菊酯类农药及其中间物残留的降解菌剂。 

   所述拟除虫菊酯类农药残留降解菌剂的生产工艺流程为：斜面种——摇瓶种——种子罐培养——生产罐培养——包装为液体剂型。 

具体地，所述降解菌剂的制备方法包括以下步骤： 

（1）将拟除虫菊酯类农药残留降解菌ZS-02的菌种接种于YPD培养基摇瓶中，32 ℃振荡培养至对数期； 

所述YPD培养基质量百分比组成为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%。

（2）将步骤（1）培养好的菌种按种子罐培养基的体积比的8%～10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用质量百分比培养基配方为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%，pH值为7.2； 

（3）将达到对数期的种子液按照8%～10%的接种量接种入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同； 

在种子罐和生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0.45～0.60 m³/min，搅拌速度为180～240 r/min，温度32 ℃，全流程培养时间为60～72 h，经生产罐培养所获培养液即为本发明所述降解菌剂。

本发明所述拟除虫菊酯类农药残留降解菌可以用于降解拟除虫菊酯类农药及其主要中间产物的残留，优选地，应用于降解联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯、间苯氧基苯甲酸等。 

在应用中，优选的应用量是每平方米农田施用50mL浓度为1.0×10⁷ CFU/mL的降解菌菌液。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 

 [0020]（1）本发明提供了一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌ZS-02，有效解决了联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药及其主要中间产物间苯氧基苯甲酸降解难题，可使所述农药的残留量降低75%以上。

（2）本发明进一步提供了使用本发明降解菌生产制备得到的菌剂，高效安全，具有生产成本低，使用方便，降解效果好的优点，适合在全国果蔬生产出口基地或有绿色食品标志的地方大面积使用，为生产出无毒、无公害的绿色食品做出贡献； 

  [0022]（3）本发明促进协调统一病虫害防治用药与食品安全，对于大规模推广使用果蔬农药微生物处理，生产无公害果蔬、绿色食品具有重要的意义。

附图说明

图1  降解菌ZS-02对拟除虫菊酯类农药和间苯氧基苯甲酸的降解曲线图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中所采用的材料试剂和方法，为本技术领域常规的材料试剂和方法。 

实施例1降解菌ZS-02的获得 

本发明人在2010年6月从中国广东省中山市土壤中通过常规的富集培养法分离得到一株酵母菌菌株（Candida pelliculosa）ZS-02，于2011年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为湖北武汉市武昌珞珈山），菌种保藏号为CCTCC M 2011383。

所述菌株经鉴定为假丝酵母属(Candida sp.)，细胞椭圆形，长3～4 μm，宽2～3 μm；菌落乳白色，圆形，边缘规则整齐；接触酶试验、氧化酶试验阳性；可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、木糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、山梨醇、棉子糖、α-甲基-D-葡萄糖苷；该菌株的18S rDNA 的GenBank 登录号为JN700989。 

实施例2 降解菌剂的制备 

将降解菌ZS-02的菌种按照常规方法在固体平板上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。将拟除虫菊酯类农药残留降解菌ZS-02的试管种接种于含250 mL的YPD培养基1000 mL摇瓶中，所述YPD培养基质量百分比组成为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%；32℃恒温振荡至对数期，准备接种种子罐；种子罐100 L，投料量80 L，培养基质量百分比配方为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%，pH值为7.2。投料完成后在1.1 Kg/cm³的压力下、121 ℃条件下高压湿热灭菌，冷却至32 ℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按8%～10%的接种量接种于100 L种子罐，无菌空气的通气量为0.45～0.60 m³/min，搅拌速度为180～240 r/min，培养至对数生长期备用。将到达对数期的种子液按照8%～10%的接种量投入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量1吨，投料量为0.08～0.1吨。投料后的生产罐，在1.1 Kg/cm³的压力下、121 ℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30 ℃后，通无菌空气，通气量为0.45～0.60 m³/min，搅拌速度为180～240 r/min，培养温度控制在30～35 ℃，整个工艺培养流程时间为60～72 h。 

所获培养液直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。 

实施例3 对拟除虫菊酯类农药残留的降解实验 

在基础盐培养基（组分为：NH₄NO₃ 1.0 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 1.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄  ^. 7H₂O 0.5 g，水1000 mL，pH 值为7.2）中分别加入联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和间苯氧基苯甲酸，使其终浓度为50 mg/L；接种降解菌ZS-02浓度为1.0×10⁷ CFU/mL菌液，并设不接菌的培养基为对照，摇床培养0-5 天，定期取样，应用高效液相色谱法（HPLC）检测农药的残留量，结果见表1所示。降解曲线图如附图1所示。 

表1  降解菌ZS-02对拟除虫菊酯类农药和间苯氧基苯甲酸的降解效果 

结果表明，降解菌ZS-02可有效去除联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药和其主要中间产物间苯氧基苯甲酸的残留，具有较好的降解效果。 

实施例4  应用本发明的菌剂进行土壤模拟农药残留降解试验 

   在田间选取未经施药的表层土壤（0～20 cm），准确称取每份200 g土壤，在每一份中分别加入联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯和间苯氧基苯甲酸，使其质量终浓度分别为25、50和100 mg/kg，接种降解菌剂，浓度为1.0×10⁷ CFU/g土壤，并设不接菌的土壤为对照，置于32 ℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，15天后测定联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯农药和间苯氧基苯甲酸在土壤中的残留量，结果见表2所示。结果表明，降解菌剂可以有效去除土壤中对拟除虫菊酯类农药及其主要中间产物的残留，具有很好的去除效果。 

表2  降解菌剂去除土壤中拟除虫菊酯类农药和间苯氧基苯甲酸残留的效果 

实施例5 应用本发明的菌剂进行蔬菜模拟农药残留降解试验 

选取未经施药的菜心（4～5叶期），置于32 ℃光照培养箱中恒温培养，生长过程中喷施联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯农药和间苯氧基苯甲酸，处理浓度分别为25、50和100 mg/L。喷施农药1天后接种降解菌剂，接种量为每株菜心5 mL（1.0×10⁷ CFU/mL），并以喷洒等量清水的菜心为对照。喷施菌液5天后，按5点取样法取菜心样品，用气相色谱法（GC）测定农药残留量，结果见表3所示。结果表明，降解菌剂可以有效去除菜心中拟除虫菊酯类农药及其主要中间产物的残留，具有较好的去除效果。 

表3  降解菌剂去除菜心中拟除虫菊酯类农药和间苯氧基苯甲酸残留的效果 

实施例6 应用本发明不同剂量的菌剂进行蔬菜模拟农药残留降解试验 

选取未经施药的菜心（4～5叶期），置于32℃光照培养箱中恒温培养，生长过程中喷施联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯农药和间苯氧基苯甲酸，处理浓度为50 mg/L，喷施农药1天后接种降解菌剂，接种量为每株菜心5 mL，接种浓度分别设置为1.0×10⁵ CFU/mL，1.0×10⁷ CFU/mL，1.0×10⁹ CFU/mL；并以喷洒等量清水的菜心为对照。喷施菌液5天后，按5点取样法取菜心样品，用气相色谱法（GC）测定农药残留量，结果见表4所示。结果表明，不同浓度的降解菌剂都具有一定的去除菜心中拟除虫菊酯类农药及其主要中间产物残留的活性，施用浓度为1.0×10⁷ CFU/mL的降解菌菌液具有较好的去除效果。 

表4  不同剂量降解菌剂去除菜心中拟除虫菊酯类农药和间苯氧基苯甲酸残留的效果 

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Claims (7)

1.一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌，所述菌株为酵母菌(Candida sp.)ZS-02，于2011年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2011383。

2.权利要求1所述拟除虫菊酯类农药残留降解菌在去除拟除虫菊酯类农药及其中间物残留方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于应用于制备去除拟除虫菊酯类农药及其中间物残留的降解菌剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解菌剂的制备方法包括以下步骤：

（1）将拟除虫菊酯类农药残留降解菌ZS-02的菌种接种于YPD培养基摇瓶中，32 ℃振荡培养至对数期；

所述YPD培养基质量百分比组成为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%；

（2）将步骤（1）培养好的菌种按种子罐培养基的体积比的8%～10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用培养基配方质量百分比为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%，pH值为7.2； 

（3）将达到对数期的种子液按照8%～10%的接种量接种入生产罐培养即得所述降解菌剂；生产罐所用培养基配方质量百分比为：酵母膏 1%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%，pH值为7.2；

根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤（2）所述培养为：

无菌空气的通气量为0.45～0.60 m³/min，搅拌速度为180～240 r/min，温度32 ℃，全流程培养时间为60～72 h。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤（3）所述培养为：

无菌空气的通气量为0.45～0.60 m³/min，搅拌速度为180～240 r/min，温度32 ℃，全流程培养时间为60～72 h。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于应用于制备去除联苯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯或间苯氧基苯甲酸的残留的降解菌剂。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的应用量是每平方米农田施用50 mL浓度为1.0×10⁷ CFU/mL的降解菌菌液。

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