CN109182129B - 一种细菌保护剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌保护剂，其特征在于：由包含脱脂奶粉、蔗糖、菊粉、海藻糖的原料制备而成，原料中还含有甲基‑α‑D‑吡喃葡萄糖苷。本发明的细菌保护剂能够显著提高植物乳酸菌、粪链球菌和干酪乳杆菌的冻干存活率，在各成分比例最佳的情况下，冻干存活率均为95％以上。本发明中的细菌保护剂有效解决了细菌冻干粉中细菌存活率低的问题，并且对多种细菌均有较好的保护作用。

Description

一种细菌保护剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细菌保护剂及其应用。

背景技术

真空冷冻干燥技术于上世纪70年代初期开始研发，现已商业化生产。冷冻干燥是将菌体在共溶点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空状态下，使菌品中的冰升华，最后达到干燥的目的。但是在冷冻干燥过程中，易造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，许多研究发现在细菌冻干前加入适当的物质能起到保护作用，即有效保护剂的使用对于细菌的冷冻干燥是成功的关键。在冻干过程中添加保护剂，在很大程度上可减轻或避免冷冻干燥对细胞带来的损伤。保护剂可以减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持其原有的生理、生化特性和生物活性。

保护剂中主要含有蛋白质、有机聚合物、糖类等成分。其中蛋白质或有机聚合物能够在冷冻过程中形成无定形结构，可以减少化学损伤。但是不同的蛋白由于其性质不同，保护效果也不同，筛选保护效果好的蛋白质是提高冻干存活率的先决条件。糖类被认为具有通过氢键替代稳定脂质膜和蛋白的效果，同时也可以通过玻璃化过程形成无定形的非晶结构。

现有的保护剂已经能够取得较好的保护效果，但是大部分保护剂仅对特定的细菌具有保护效果，无法应用到其他细菌冻干技术中。比如CN102234621A中公开了一种乳酸菌的冻干保护剂，组成为：脱脂乳粉20g/L-150g/L、海藻糖30g/L-150g/L、麦芽糊精30g/L-150g、菊粉30g/L-120g/L，能使乳酸菌冻干菌粉在常温下保存20天，活菌存活率达到75％以上。CN106047709A公开了一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法，冻干粉包括分离乳清蛋白，山梨醇，菊粉，抗坏血酸钠和植物乳杆菌，该冻干保护剂较常规保护剂显著提高了植物乳杆菌的存活率，其制备的植物乳杆菌冻干粉中，植物乳杆菌CCFM8610、植物乳杆菌CCFM8661等植物乳杆菌的冻干存活率达到100％。CN103451099A公开了一种假交替单胞菌属细菌的冻干保护剂及冻干方法，冻干保护剂为液体，其组成成份为：脱脂乳粉、乳糖、蔗糖、维生素C、明胶、NaCl和水，该发明中冻干后的假交替单胞菌属细菌平均存活率超过30％，可置于常温下长期保存。

因此，合理搭配保护剂中的各种成分，制备一种能有效保护多种细菌的保护剂是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌保护剂及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种细菌保护剂，由包含脱脂奶粉、蔗糖、菊粉、海藻糖的原料制备而成。

进一步地，以质量份数计，原料中含有95～105份脱脂奶粉、45～55份蔗糖、95～105份海藻糖、50～200份菊粉。

进一步地，以质量份数计，原料中含有100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100～200份菊粉。

进一步地，以质量份数计，原料中含有100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100份菊粉。

进一步地，原料中还含有甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷。

进一步地，以质量份数计，原料中含有95～105份脱脂奶粉、45～55份蔗糖、95～105份海藻糖、50～200份菊粉、25～100份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷。

进一步地，以质量份数计，其原料为以下任意一种：

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100份菊粉、50份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100份菊粉、100份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、200份菊粉、50份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、200份菊粉、25份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、50份菊粉、100份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、200份菊粉、100份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100份菊粉、25份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷。

一种细菌冻干粉，含有上述细菌保护剂。

进一步地，冻干前菌液的体积与细菌保护剂的体积比为100:1～1:1。

进一步地，冻干前菌液的体积与细菌保护剂的体积比为10:1。

本发明的有益效果是：本发明的细菌保护剂能够显著提高植物乳酸菌、粪链球菌和干酪乳杆菌的冻干存活率，在各成分比例最佳的情况下，冻干存活率均为95％以上。本发明中的细菌保护剂有效解决了细菌冻干粉中细菌存活率低的问题，并且对多种细菌均有较好的保护作用。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1～12如下表所示：

表1

保护剂保护效果验证

为检测保护剂的技术效果设计了如下试验，并设置对照例进一步说明本发明的技术效果。

试验步骤如下：

1.菌体的活化与培养：将待测菌株于MRS液体培养基中活化，待生长情况稳定后，以体积比为1％的接种量培养于MRS液体培养基中。

2.冻干前活菌计数：采用菌落平板计数法，即在无菌操作条件下，取1mL的菌液，加9mL的灭菌生理盐水，制成1∶10的均匀稀释液，再依次进行10倍递增稀释，至适当稀释度10^-6、10^-7、10^-8后，分别取各稀释浓度100μL于固体培养皿中，用涂布棒使菌体分散均匀，倒置，放入37℃恒湿的培养箱中培养36h，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每毫升原始样品中所含细菌菌落总数，来表示活菌数。每个稀释度做3个平行，重复3次。

3.菌体的收集及保护剂的添加：取300mL菌液于已灭菌且编号的离心瓶中5000r/min离心30min，去上清，加入300mL的已灭菌的PBS清洗，5000r/min离心30min，去上清，再于各管中分别加入已灭菌的30mL保护剂，涡旋震荡充分混匀，放置1～2min后，以1mL分装于2mL冻存管中，并对应编号。

4.冷冻干燥：将已分装的各个样品放置于-80℃冰箱中预冻24h后，开盖，用保鲜膜缠绕，再用灭菌注射器针头戳孔，放入冻干机冻干。

5.冻干菌粉的保藏实验：将-80℃真空冷冻干燥24h制备的冻干菌粉室温和37℃分别保存1周，采用平板菌落计数法测定保存前、后乳杆菌数。

6.细菌复活及活菌计数：将冷冻干燥后的样品加入1mL MRS培养基复溶，接种于75mLMRS培养基中(接种量为体积比3％)，摇床培养24h。釆用平板菌落计数法，分别测定不同处理过程前、后的细菌数；处理后的菌体复溶至1mL，取100μL全部转接至MRS平皿中，37℃过夜培养，然后计数，每个项目均以三管作为平行，独立进行。由瑞典的阿伦尼乌斯所创立，表示化学反应速率常数(k)对温度(T)的依赖关系的经验公式。37.0℃保存1周，加速细菌老化试验，相当于常温保存1个月左右。

实施例1～11的实验结果如下：

实验中使用的细菌为植物乳杆菌。

表2

对照例设置如下

表3

对照例1～17的实验结果如下：

实验中使用的细菌为植物乳杆菌。

表4

使用实施例4中的保护粪链球菌和干酪乳杆菌，效果如下：

表5

Claims (3)

1.一种细菌保护剂，其特征在于：由脱脂奶粉、蔗糖、海藻糖、菊粉、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷的原料制备而成；

以质量份数计，所述细菌保护剂选自以下任意一种：

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100份菊粉、50份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、100份菊粉、100份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷；

100份脱脂奶粉、50份蔗糖、100份海藻糖、200份菊粉、50份甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷。

2.一种细菌冻干粉，其特征在于：含有权利要求1所述的细菌保护剂，其中冻干前菌液的体积与细菌保护剂的体积比为100:1~1:1。

3.根据权利要求2所述的细菌冻干粉，其特征在于：冻干前菌液的体积与细菌保护剂的体积比为10:1。