RU2737321C1 - Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки - Google Patents
Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2737321C1 RU2737321C1 RU2019142673A RU2019142673A RU2737321C1 RU 2737321 C1 RU2737321 C1 RU 2737321C1 RU 2019142673 A RU2019142673 A RU 2019142673A RU 2019142673 A RU2019142673 A RU 2019142673A RU 2737321 C1 RU2737321 C1 RU 2737321C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- freezing
- storage
- bacterial cultures
- bacteria
- temperature
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выделенных из фекальной микробиоты, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах. Способ включает смешивание 0,1 г пробы в криопробирке на 2 мл в соотношении 1:2 с криозащитной средой, состоящей из дистиллированной воды 500 мл, бактериологического сухого Европейского агара 2 г, NaCl 2,5 г, дрожжевого экстракта 1 г, L-цистеина 0,2 мг, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, декстрозы 5 г с добавлением 10% глицерина, перемешивание на вортексе в течение 2-5 мин. Завинченные крышкой криопробирки помещают в соответствующее хранилище. Оттаивание криопробирок производят непосредственно перед проведением исследований. Способ обеспечивает сохранение титра и жизнеспособности бактерий при хранении в условиях низких температур. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры человека, бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника, а также сохранения бактерий в рабочей коллекции для проведения микробиологических исследований.
Изобретение можно также отнести к области биотехнологии, в частности к способам сохранения бактерий в фекалиях кишечника человека и бактерий в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации.
Предлагаемое техническое решение позволяет сохранять бактерии в фекалиях человека в естественных условиях и бактериальные культуры, выделенные из фекальной микробиоты в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации. Методика отвечает критериям высокой выживаемости бактерий - на уровне 85-90%, а также сохранения исходного соотношения различных групп микроорганизмов после размораживания.
Проблема сохранения микрофлоры человека охватывает как медицинские, так и экологические аспекты сохранения биоразнообразия микроорганизмов для последующего использования в промышленных и биомедицинских технологиях.
Самым надежным во всех отношениях способом сохранения кишечной микрофлоры человека на сегодняшний день является замораживание и сохранение симбиотических микробных сообществ в условиях низких температур, в том числе в жидком азоте.
Однако, несмотря на огромные достижения криомикробиологии, проблема замораживания и сохранения в жидком азоте сложных микробиоценозов до сих пор не решена. Отсутствие универсального метода криоконсервации для широкого спектра микроорганизмов, населяющих желудочно-кишечный тракт, делает проблему криоконсервации чрезвычайно актуальной в плане сохранения микроэкологических ресурсов человека. Уже сейчас можно однозначно сказать, что низкотемпературная консервация сложных симбиотических сообществ человека возможна, несмотря на индивидуальную вариабельность по количеству и соотношению микроорганизмов в составе микробиома в зависимости от возраста, пола, образа жизни и состояния здоровья человека.
Есть данные о замораживании микробиоты кишечника человека до криогенных температур -70°С, -196°С в криозащитных средах с глицерином, с ДМСО, природными и синтетическими полимерными веществами. Выбор криопротектора или их комбинации, а также выбор правильного режима замораживания и оттаивания лежат в основе разработки технологии сохранения микроорганизмов симбиотической микробиоты человека в условиях криоконсервации при низких температурах, рассчитанной на годы и десятилетия хранения микроэкологических ресурсов в криобанке.
В настоящее время используют эмпирические подходы для подбора режимов замораживания и оттаивания конкретных объектов, так как выживаемость и стойкость бактерий при замораживании в жидком азоте зависит от ряда факторов, в частности, от вида бактериальных клеток и их концентрации в суспензии, чувствительности бактерий к замораживанию и оттаиванию в зависимости от их принадлежности к таксономической группе. Немаловажное значение имеют физико-химические свойства; количественное содержание бактерий и ряд других свойств бактериальной биомассы, подлежащей замораживанию; состав защитной среды для криозамораживания (для сохранения бактерий при замораживании существенным является выбор защитной среды, природы и химического строения присутствующего в ней криопротектора и физико-химические особенности его взаимодействия с компонентами жидкой и твердой фаз замораживаемых бактериальных клеток); режим охлаждения (при замораживании бактериальных клеток происходит образование микрокристаллов льда как внутри бактериальных клеток, так и снаружи, при этом характер их изменений зависит от свойств криопротектора, и, главным образом, от скорости охлаждения); режим хранения (при температуре -70°С или в жидком азоте при температуре - 196°С). При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию бактериальной клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении бактериальные клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки.
Наилучший эффект достигается обычно при замораживании в жидком азоте при температуре - 196°С. Одним из преимуществ быстрого охлаждения является условия действия концентрированных солевых растворов после выделения льда, которое занимает менее продолжительный период времени до достижения их эвтектической точки.
Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений бактериальных клеток при охлаждении, замораживании и последующем оттаивании. Механизм защитного действия криопротекторов основан на создании ими более прочной связи с молекулами воды, что препятствует формированию правильной кристаллической решетки льда и задерживает начало роста кристаллов. Криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания криопротектор удаляют из бактериальных клеток путем последовательных отмываний и центрифугирования.
Известен способ замораживания бактерий в гранулах с применением стерильного расплавленного 10%-ного раствора желатина в 0,9% физиологическом растворе (NaCl). Суспензию бактериальных клеток смешивают с 10%-ным раствором желатина в отношении 1:1 для формирования при замораживании желатиновых шариков с достаточным количеством бактериальных клеток. Для создания анаэробных условий азот продувают через подготовленный раствор с клетками. Суспензию бактериальных клеток при помощи дозатора по 50 и/или 100 мкл наносят на охлажденную в парах жидкого азота фторопластовую пластину. Получившиеся замороженные гранулы "сбрасывают" в жидкий азот, собирают в находящиеся в азоте промаркированные пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками и переносят на сохранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (криохранилище) (см. патент РФ №2123044).
Недостатком данного способа является необходимость создания анаэробных условий путем продувания клеток через пары жидкого азота; хранение должно осуществляться только в жидком азоте, и, следовательно, требует наличия криохранилищ; при оттаивании бактериальные клетки должны быть освобождены от желатина.
Известен способ замораживания бактерий, предусматривающий отделение бактерий центрифугированием, смешивание суспензии бактериальных клеток с защитной средой в соотношении 1:1, содержащей глицерин, сахарозу, лимоннокислый натрий и замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул. Бактериальный концентрат, полученный таким способом, сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре не выше -18°С (см. авторское свидетельство СССР №457727). Недостаток этого изобретения заключается в том, что при оттаивании бактерий необходимо использовать центрифугирование для отделения бактериальных клеток от криозащитной среды. Однако при использовании этого способа криозаморозки в процессе хранения происходит слипание гранул, что затрудняет процесс получения исходного титра бактериальных культур.
Известен способ замораживания молочнокислых бактерий, предусматривающий смешивание в соотношении 1:1 молочнокислых бактерий с защитной средой, содержащей глицерин и лимоннокислый натрий и замораживания полученной смеси в жидком азоте в виде гранул, отличием которого от предыдущего изобретения является то, что защитную среду готовят на основе фосфатного буфера с рН 7,2. При этом дополнительно в защитную среду вводят лактозу и желатин, обеспечивающие исключение слипания гранул молочнокислых бактерий после оттаивания (см. патент РФ RU 2427624).
Недостаток этого изобретения заключается в том, что при оттаивании необходимо использовать центрифугирование для отделения бактериальных клеток от криозащитной среды, что затрудняет процесс получения исходного титра бактериальных культур.
Анализ известных технических решений из уровня техники показал, что на данный момент наиболее близких аналогов предлагаемому техническому решению не выявлено.
Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является создание оптимальных условий сохранения бактерий в фекалиях кишечника человека или бактериальных культур, выделенных из фекалий человека, выращенных на плотных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур (-80°С и -196°С), для обеспечения сохранения исходного титра микроорганизмов после замораживания и оттаивания.
Технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе сохранения бактерий в фекалиях кишечника человека или бактериальных культур, выделенных из фекалий человека, выращенных в чашках Петри на плотных питательных или дифференциальных средах, помещают в стерильные условия, отбирают 0,1 г фекалий человека или бактериальные культуры, смытые ватным тампоном со всей поверхности питательной среды, помещают в криопробирки, рассчитанные на 2 мл, смешивают в соотношении 1:2 с криозащитной средой, состоящей из: дистиллированной воды 500 мл, бактериологического сухого Европейского агара 2 г, NaCl 2,5 г, дрожжевого экстракта 1 г, L-цистеина 0,2 мг, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, декстрозы 5 г с 10% глицерином, перемешивают на вортексе в течении 2-5 минут до получения однородной массы, затем криопробирки завинчивают крышкой и помещают в соответствующее хранилище, где первоначально подвергают заморозке, а затем оставляют для хранения при низких температурах до тех пор, пока не потребуется использовать хранящийся материал, при этом оттаивание криопробирок с бактериальными культурами и фекалиями производят непосредственно перед проведением исследований, для чего требуемые для исследования образцы вынимают из низкотемпературного хранилища, размораживают в течение 45 сек. на прогретой заранее до температуры +37°С водяной бане, затем образцы вынимают из водяной бани и оставляют при комнатной температуре до полного оттаивания.
Для создания стерильных условий используют ламинарный или анаэробный бокс.
В качестве хранилища для заморозки и хранения используют морозильную камеру с температурой от - 70°С до - 80°С или сосуд Дьюара с температурой -196°С.
Для замораживания образцы фекалий человека или бактериальных культур, выделенные из фекалий помещают в криопробирки в соотношении 1:2 с криозащитной средой. Такая пропорция используется потому, что количество микроорганизмов, снятых с чашки тампоном со всей поверхности питательной среды, помещенное в криопробирку должно быть полностью покрыто и размешано с криосредой. Для этого 0,1 г фекалий помещают в криопробирку и смешивают в соотношении 1:2 с криозащитной средой. Полученные суспензии гомогенизируют на вортексе в соответствующих каждому микроорганизму условиях: анаэробный или ламинарный бокс, затем помещают в низкотемпературный морозильник на -80°С, исключая предварительное замораживание при других более низких температурах, что обеспечивает защиту микроорганизмов от повреждающего действия замораживания, сохранность жизнеспособность разных таксономических групп микроорганизмов как в чистой культуре, так и в условиях симбиоза в фекальной микробиоте с сохранением титра; снижение риска или исключение формирования внутриклеточного льда и обезвоживания микроорганизмов в условиях низких температур.
По мере необходимости, требуемые для исследования образцы, вынимают из низкотемпературного хранилища и осуществляют размораживание путем оттаивания криопробирок с бактериальными культурами и фекалиями, которое производят непосредственно перед проведением исследований.
Содержимое аликвот (криопробирок) проверяют на наличие живых микробных клеток. Дифференциацию живых и мертвых бактериальных клеток в аликвотируемых образцах микробиоты человека проводят по методу Виноградского-Брида путем прямого подсчета живых и мертвых бактериальных клеток в гетерогенной суспензии с использованием камеры Горяева. Пригодные к исследованию аликвоты с образцами используют для дальнейших исследований.
Использование предлагаемого способа заморозки и разморозки обеспечивает сохранение микроорганизмов разных таксономических групп, поскольку при реализации предлагаемого способа: используется специализированная среда, в которой в качестве непроникающего криопротектора имеется панкреатический гидролизат казеина и декстроза; для восстановления культуральных и ростовых качеств бактериальных культур после заморозки в состав входит дрожжевой экстракт и L-цистеин; в качестве проникающего криопротектора используется 10% глицерин. Все перечисленные компоненты позволяют защитить микроорганизмы от повреждающего действия замораживания, а также предложенный способ заморозки и разморозки биологического материала и бактериальных культур способствует сохранению их титра, так как при использовании предложенного способа микроорганизмы имеют возможность восстановить свою жизнеспособность после замораживания. Примеры реализации способа:
Пример 1.
Суточные бактериальные культуры Escherichia coli, Escherichia coli hem+, Enterococcus faecalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Salmonella spp., Enterobacter aerogenes, E. durans, Parabacterodes mirdae, K. pneumoniae, K. oxytoca, K. varicolla, C. freundii, Enterobacter cloaceae, P.mirabilis, E. casseliflavus, Weissella confusa, S. haemolyticus, S. pasteuri, Clostridium perfringens hem+, выделенные из нативного кала, пассировались на агаризованной дифференциальной среде при температуре 37°С в течение 24 часов.
Готовили миллиардную взвесь каждой культуры по оптическому стандарту мутности. Для осуществления контроля готовили серийные разведения с дальнейшим высевом на соответствующие каждому микроорганизму плотные - дифференциальные среды. Бактерии высевали методом прямого посева по 0,1 мл на соответствующие плотные питательные среды.
В качестве криопротекторов использовали составную агаризованную среду для заморозки, состоящую из 500 мл дистиллированной воды, бактериологического сухого Европейского агара, NaCl, дрожжевого экстракта, L-цистеина; панкреатического гидролизата казеина, декстрозы и 10% глицерина.
Миллиардную взвесь каждой культуры объемом 100 мкл помещали в криопробирки, затем в эти же пробирки добавляли составную среду для заморозки в соотношении 1:2. Затем криопробирки гомогенизировали на вортексе, помещали в сосуд Дьюара на -196°С или в низкотемпературный морозильник на -70°С.
Через трое суток криопробирки вынимали, помещали на 45 секунд в подготовленную и разогретую заранее до 37°С водяную баню и затем оставляли при комнатной температуре до полного размораживания.
После полной разморозки содержимое криопробирок гомогенизировали на вортексе и готовили бактериальные суспензии методом серийных разведений для бактериологического посева по 0,1 мл на агаризованные среды. После суточной инкубации при 37°С посевов учитывали результаты путем подсчета выросших колоний на чашках с учетом разведений.
Пример 1 реализации предлагаемого способа поясняется диаграммами и графиками, показанными на фиг. 1, фиг. 2
На фиг. 1 - показано, что титр бактериальных культур Salmonella spp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Parabacterodes mirabilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum после хранения при низких температурах был сохранен за счет использования криосреды и технологии заморозки и разморозки бактериальных культур. Исключение составил штамм бактерии Escherichia coli, который сохранился после разморозки в титре 106 КОЕ, что можно объяснить тем, что бактериальная смесь была недостаточно гомогенизирована со средой для замораживания на вортексе, что привело к изменению их титра при оттаивании на 3 логарифма.
На фиг. 2 - показано, что титры бактериальных культур K. pneumoniae, K. oxytoca, K. varicolla, C. freundii, P.mirabilis, Е. casselinavus, S. pasteuri, Clostridium perfringens hem+после хранения при низких температурах сохранились за счет использования криосреды и способа заморозки и разморозки бактериальных культур. Исключение составили штаммы бактерий Enterobacter cloaceae, Weissella confusa, S. haemolyticus, которые сохранились после разморозки с потерей титра на 1 lg, что можно объяснить тем, что эти бактерии были недостаточно гомогенизированы со средой для замораживания на вортексе перед процессом их заморозки, что привело к изменению их титра при оттаивании.
Предлагаемый способ сохранения бактерий, выделенных из фекальной микробиоты в условиях хранения в сосуде Дьюара на -196°С и в низкотемпературном морозильнике на -70°C с использованием составной среды для заморозки, а также в предложенном способе заморозки и разморозки, позволяет сохранить титр и увеличить возможность восстановления жизнеспособности бактерий после хранения в условиях низких температур.
Пример 2.
Проверку содержимого аликвот (криопробирок с фекалиями микробиоты) проверяли на наличие живых микробных клеток. Дифференциация живых и мертвых бактериальных клеток в аликвотах образцов фекальной микробиоты человека проводили используя метод Виноградского-Брида путем прямого подсчета живых и мертвых бактериальных клеток в гетерогенной суспензии с использованием камеры Горяева.
Исследования проводили при комнатной температуре (24-26)°С в ламинарном боксе, соблюдая правила асептики.
Пример 2 реализации предлагаемого способа поясняется диаграммой, показанной на фиг. 3
Проверка содержимого аликвот с микроорганизмами в образцах фекальной микробиоты и бактерий, выделенных из фекальной микробиоты на жизнеспособность служит дополнительным контролем к определению пригодности к дальнейшему их хранению.
На фиг. 3 - показано количество жизнеспособных клеток каждого из 11 исследуемых образцов, окрашенных с использованием красителя трипанового синего, из всей совокупности бактериальных клеток существенно выше, чем мертвых, что является достоверным и подтверждается методом математической статистики.
Пример 3
Были проведены исследования более 100 проб нативного кала и определен бактериальный состав и титр фекальной микробиоты кишечника. Для этого 0,1 г биологического материала от каждой пробы фекальной микробиоты кишечника помещался в криопробирки в соотношении 1:2 с составной криозащитной средой для заморозки, состоящей из 500 мл дистиллированной воды, 2 г бактериологического сухого Европейского агара, 2,5 г - NaCl, 1 г - дрожжевого экстракта, 0,2 мг L-цистеина, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, 5 г декстрозы и 10% глицерина и гомогенизировали на вортексе, затем помещали в сосуд Дьюара на -196°С и в низкотемпературный морозильник на -70°С. Через трое суток криопробирки вынимали, помещали на 45 секунд в заранее подготовленную и разогретую до 37°С водяную баню, вынимали и оставляли при комнатной температуре до полного размораживания. После полной разморозки содержимое криопробирок гомогенизировали на вортексе и готовили бактериальные суспензии методом серийных разведений для бактериологического посева по 0,1 мл на агаризованные среды.
После суточной инкубации при 37°С посевов учитывали результаты путем подсчета выросших колоний на чашках с учетом разведений (таблица 2 - Исходный видовой состав проб фекалий перед проведением процедуры криоконсервации)
Предложенный пример доказывает, что предлагаемый способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте в жидком азоте в сосуде Дьюара на -196°С и в низкотемпературном морозильнике на -70°C с использованием составной среды для заморозки, способа заморозки и разморозки, способствуют сохранению титра микроорганизмов, так как при использовании предложенного способа микроорганизмы имеют возможность восстановить свою жизнеспособность после замораживания, в том числе из-за постепенной разморозки.
Предлагаемый способ позволяет сохранять жизнеспособность
бактерий разных таксономических групп в фекалиях человека или бактериальных культур, выделенных из фекальной микробиоты, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур, что дает возможность не только сохранить микробиоценоз в фекалиях при заморозке, но и позволит сохранить и сократить расходы на ведение рабочих коллекций микроорганизмов в микробиологических лабораториях.
Claims (5)
1. Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выделенных из фекальной микробиоты, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах, заключающийся в том, что фекальная микробиота или бактериальные культуры, выделенные из фекальной микробиоты, помещают в стерильные условия и отбирают 0,1 г фекалий человека или бактериальные культуры, смытые ватным тампоном со всей поверхности питательной среды, в криопробирки, рассчитанные на 2 мл, смешивают в соотношении 1:2 с криозащитной средой, состоящей из дистиллированной воды 500 мл, бактериологического сухого Европейского агара 2 г, NaCl 2,5 г, дрожжевого экстракта 1 г, L-цистеина 0,2 мг, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, декстрозы 5 г с добавлением 10% глицерина, перемешивают на вортексе в течение 2-5 мин до получения однородной массы, затем криопробирки завинчивают крышкой и помещают в соответствующее хранилище, где первоначально подвергают заморозке, а затем оставляют для хранения при низких температурах до тех пор, пока не потребуется использовать материал, при этом оттаивание криопробирок с бактериальными культурами и фекалиями производят непосредственно перед проведением исследований, для чего требуемые для исследования образцы вынимают из низкотемпературного хранилища, размораживают в течение 45 с на прогретой заранее до температуры +37°С водяной бане, затем образцы вынимают из водяной бани и оставляют при комнатной температуре до полного оттаивания.
2. Способ по п. 1, в котором для создания стерильных условий используют ламинарный бокс.
3. Способ по п. 1, в котором для создания стерильных условий используют анаэробный бокс.
4. Способ по п. 1, в котором в качестве хранилища для заморозки и хранения используют морозильную камеру с температурой от -70 до -80°С.
5. Способ по п. 1, в котором в качестве хранилища для заморозки и хранения используют сосуд Дьюара с температурой -196°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019142673A RU2737321C1 (ru) | 2019-12-20 | 2019-12-20 | Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019142673A RU2737321C1 (ru) | 2019-12-20 | 2019-12-20 | Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2737321C1 true RU2737321C1 (ru) | 2020-11-27 |
Family
ID=73543600
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019142673A RU2737321C1 (ru) | 2019-12-20 | 2019-12-20 | Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2737321C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114982717A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-09-02 | 辽宁中医药大学 | 粪菌移植法建立2型糖尿病阴虚证和/或2型糖尿病非阴虚证动物模型建立、评价及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2123044C1 (ru) * | 1998-03-02 | 1998-12-10 | Открытое акционерное общество "Русский йогурт" | Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных. |
RU2427624C1 (ru) * | 2010-05-24 | 2011-08-27 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) | Способ замораживания молочно-кислых бактерий |
RU2661117C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-07-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов |
-
2019
- 2019-12-20 RU RU2019142673A patent/RU2737321C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2123044C1 (ru) * | 1998-03-02 | 1998-12-10 | Открытое акционерное общество "Русский йогурт" | Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных. |
RU2427624C1 (ru) * | 2010-05-24 | 2011-08-27 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) | Способ замораживания молочно-кислых бактерий |
RU2661117C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-07-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ПОХИЛЕНКО В.Д. и др. "Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития." // Известия высших учебных заведений. Медицинские науки, 2009, N 4(12), с.99-121. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114982717A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-09-02 | 辽宁中医药大学 | 粪菌移植法建立2型糖尿病阴虚证和/或2型糖尿病非阴虚证动物模型建立、评价及应用 |
CN114982717B (zh) * | 2022-06-09 | 2023-07-21 | 辽宁中医药大学 | 粪菌移植法建立2型糖尿病阴虚证和/或2型糖尿病非阴虚证动物模型建立、评价及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zayed et al. | Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage | |
Bellali et al. | A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying | |
Day | Cryopreservation of microalgae and cyanobacteria | |
Mahony et al. | Stable L-forms of Clostridium perfringens and their growth on glass surfaces | |
Lu et al. | Optimization of a cryoprotective medium to increase the viability of freeze-dried Streptococcus thermophilus by response surface methodology | |
Wang et al. | Optimal combination of multiple cryoprotectants and freezing-thawing conditions for high lactobacilli survival rate during freezing and frozen storage | |
US6610531B1 (en) | Viable dried bacteria produced by drying in the presence of trehalose and divalent cation | |
CN104762209B (zh) | 明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法 | |
RU2737321C1 (ru) | Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки | |
CA3061695C (en) | Methods and compositions for storing bacteria | |
Winters et al. | A simple effective method for bacterial culture storage: a brief technical report | |
CN109182129B (zh) | 一种细菌保护剂及其应用 | |
CN111286469B (zh) | 一种副干酪乳杆菌冻干菌粉的制备方法 | |
Qu et al. | Protective effect of crop by-products on Lactobacillus gasseri H87 during freeze-drying and storage | |
RU2661117C1 (ru) | Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов | |
Adams | The preservation of inocula | |
Tršić-Milanović et al. | The influence of a cryoprotective medium containing glycerol on the lyophilization of lactic acid bacteria | |
RU2123044C1 (ru) | Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных. | |
Kharchenko et al. | Development of lyophilization procedure ensuring survival of bifidobacteria and preservation of their probiotic potential upon long-term storage | |
Boianovskyi et al. | Effectiveness of nutrient media for the recovery of lyophilisates of fastidious microorganisms: evidence from Streptococcus spp. | |
RU2726299C1 (ru) | Защитная среда для криохранения для анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте | |
Liu et al. | Methods in biosynthesis and characterization of the antifreeze protein (AFP) for potential blood cryopreservation | |
Tan et al. | Effect of disaccharide-polyol systems on the thermal stability of freeze-dried Mycobacterium bovis | |
US20030044965A1 (en) | Long term preservation and storage of viable dried bacteria | |
Sadat Naghavi et al. | A comparison between different methods for the preservation of lactic acid bacteria for usage as a starter culture |