CN104762209B - 明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法，所述明亮发光杆菌冻干粉，包括如下重量百分比的组分：脱脂乳25～35％，海藻糖20～24％，精氨酸0.7～1.0％，氯化钠1～1.5％，菌体余量。本发明采用复合冷冻保护剂，试验证明，其抗冻能力大大提高，具有比单一的保护剂更强的保护性能，且具有很好的稳定性。本发明获得的明亮发光杆菌冻干粉，其发光度平均值为1843mv左右，接近模型预期值1820mv。并用制备的冻干粉对ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇和C₆H₅OH的毒性进行检测，发现不同批次间的冻干粉测得的EC₅₀值变异系数均小于6％。

Description

明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及明亮发光杆菌制剂及其制备方法。

背景技术

基于现阶段我国环境污染状况，发光菌毒性检测法是高效便捷的测定污染物生物毒性的有效手段。发光菌毒性检测法的最大优势是它可以现场检测，方法快速、准确，操作简便。发光细菌的相对发光度和水体综合毒性呈显著负相关，利用光电检测技术将对环境敏感的发光细菌用于水体毒性的检测具有简单、快速的优点。在现场进行毒性检测，要求操作快速、简单，而新鲜菌液不方便携带，在户外也不易保存。因而更多的是使用冻干粉，只需5分钟的快速复苏后即可使用，活性与灵敏度与新鲜菌液接近。然而，市场上销售的冻干粉价格贵，而且难以保证每批活性在同一水平。因此，许多科研机构开始自主研制冻干粉，既能保证菌的稳定活性也能降低经费。而制备冻干粉的关键在于冻干前的菌悬液制备，其中保护剂成分及配比影响最显著。本研究拟通过优化后的菌液制备冻干粉，克服传统检测方法范围小、结果不稳定等缺点，使得发光菌生物毒性检测范围更广、结果重复性和准确性更高，为进一步拓宽发光菌在线监测的实际应用打下基础。

发光杆菌属菌体多呈杆形，革兰氏阴性菌，无孢子和荚膜，有鞭毛。最适生长温度一般为15-26℃，最适pH范围一般为6.5～7.5，超过25℃生长_.将受到抑制，其_.生长_.基质里需要一定的NaCl，起到维持渗透压的作用。

目前，所述明亮发光杆菌是采用如下的方法保存的：

取一支发光细菌冻干粉，用砂轮将安瓿瓶切开一个小口，在超净工作台内，缓慢加入1ml冷藏过的3％NaCl，轻微震荡，复苏10min后，用接种环接种至固体培养基中，20℃下生长20～24小时，直置黑暗处可见蓝绿色光。用接种环挑取一个较亮的单菌落，置于50ml的液体培养基中，20℃振荡培养18～20小时。

菌种保存：将菌液离心，除去上清液，重新悬浮于含有3％NaCl的灭菌甘油里(20％甘油)，分装置EP管中，于-70℃保存。此保存方法保存时间较短，仅用于保存菌种，无法直接进行毒性测试。

微生物在进行冻干是一种较好的方法，一般需要有冷冻保护介质(例如简单的10％脱脂乳或是较复杂的动物血清)帮助菌体在低温下存活。优质的冷冻保护剂至少具备两种功能：当细胞里的水分逐渐流失时，保护剂可以稳定细胞形态；维持干燥前后的样品形状。

目前，常用的冻干保护剂有二糖，如海藻糖、BSA血清，脱脂乳，甘露醇等，但是，单一的保护剂，难以获得较好的效果，需要进行改进。

保护剂的主要作用是在冷冻过程中，消除细胞内部冻结水之间的冰晶机械作用，因为机械作用会破会细胞内部的化学键、细胞质膜。但由于各个保护剂的浓度、细胞渗透的能力等等不尽相同，因而所起的冷冻保护作用会有差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种明亮发光杆菌冻干粉及其制备方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明所述的明亮发光杆菌冻干粉，包括如下重量百分比的组分：

优选的：包括如下重量百分比的组分：

脱脂乳 29～31％

海藻糖 21～23％

精氨酸 0.8～0.9％

氯化钠 1.1～1.4％

菌体 余量

最优选的：包括如下重量百分比的组分：

脱脂乳 30.0％

海藻糖 22.1％

精氨酸 0.9％

氯化钠 1.3％

菌体 余量

1、糖类中，双糖冷冻保护剂效果最为显著，而其中，海藻糖则是双糖中冷冻保护效果最为突出的糖类。

与其它糖类相比，海藻糖的抗冷冻脱水能力更强。与蔗糖、果糖等双糖相比，海藻糖的水化体积通常要大二至三倍，在大分子溶液中排阻作用比一般的糖强，海藻糖的水溶液可以将生物分子包封在一个外形更加坚固的结构中。

与海藻糖相比，蔗糖更实惠，但是其冷冻保护能力远不及海藻糖。因此在冷冻干燥过程中一般优先考虑海藻糖作为保护剂。

2、氨基酸是一种常见的作用类似于蛋白质类的冷冻保护剂。其中L-精氨酸是氨基酸中常用的冻干保护剂之一。有文献报道，血小板在冷存时，加入L-精氨酸可起到很好的抗冻保护作用；培养基里添加一定量的精氨酸，对具有发光能力的生物的荧光素酶的合成有着重要作用。

3、脱脂奶粉是一种天然的复合型冷冻保护剂，属于非渗透型保护剂不能进入细胞内部，在低温下，脱脂牛奶可以使细胞周围的溶液呈过冷状态，减缓了溶液冷冻速率。脱脂牛奶的保护作用类似于牛血清蛋白(BSA)等聚合物质，脱脂牛奶的乳清蛋白可以在菌体外形成蛋白质膜，在冻干过程中保护菌体的细胞质膜和蛋白质功能的完整性；维持细胞结构不被破坏，可以起到赋形剂的作用。由于蛋白的Tg相对更高，因此在冻干过程中的稳定性更好，在菌种冻存时的作用优于普通糖类。

NaCl本身不具备抗冻的作用，由于实验所用的发光细菌是海洋性细菌，添加NaCl用于维持细胞环境一定的渗透压。

申请人发现，各个组分的含量，对于保持菌体的活性是十分关键的，其中：

脱脂乳的含量的增加，发光度明显增加，但乳粉浓度高于40％时，发光度则逐渐减小。

随着海藻糖浓度的增加，发光度明显提高，但海藻糖浓度高于20％，发光度增加幅度变小；

精氨酸含量大于2％(w/w)时会对冻干粉活性产生抑制作用，

NaCl浓度为1％时，发光度最高。NaCl浓度为0.5％时，冻干粉活性较低，仅有582±56.3mv。NaCl浓度高于1％时，浓度越高冻干粉活性越低。

各个保护剂成分的浓度过高或过低，对冻干粉的活性均有影响。浓度过高，渗透压过高，不利于冻干粉的复苏；而浓度过低，在冷冻和干燥过程中达不到很好的保护作用，同样对冻干粉的活性有抑制作用。

所述的脱脂乳为一种市售普通乳粉，生产厂家为伊利高钙脱脂乳粉。

所述的菌体来自于摇瓶培养的明亮发光杆菌，即菌液离心去上清后剩下的菌体，制备方法如下：

取一支明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)EP管，将菌液接种到装有50ml培养基的250ml锥形瓶中，根据前期优化的培养条件，接种量为2％，200r/min，pH 7.0，18℃振荡培养16-20h。

所述明亮发光杆菌(Photobacterium Phosphoreum)，为一种公知的菌种，明亮发光杆菌毒性试验在生活饮用水水质监测中的应用中，已经有详细的报道，购买自中科院南京土壤研究所微生物研究室；

术语“一支”指的是：一支明亮发光杆菌EP管即是1个1.5mlEP离心管内的保存的菌种；

术语“接种量为2％”指的是接种1ml保存菌种于50ml培养基中，1/50＝2％；

所述培养基的配方：

将培养好的菌液置于离心管中，7000～9000r/min下，优选8000r/min下，离心20-30min，去除上清液，用质量浓度为3～10％的NaCl溶液洗涤、离心，去除上清液，收集沉淀物，即为所述的菌体；

本发明的制备方法，包括如下步骤：

(1)所述的菌体加入脱脂乳、海藻糖、精氨酸和氯化钠的混合物中，分散，然后置于安瓿瓶中，-30～-20℃预冷1-2小时，再在-65～-75℃预冻8-12小时；

(2)将预冻后的安瓿瓶，放入真空冷冻干燥仪内，冷冻干燥至含水重量为3％以下，即可获得所述的明亮发光杆菌冻干粉。

本发明的有益效果是：

本发明采用复合冷冻保护剂，试验证明，其抗冻能力大大提高，具有比单一的保护剂更强的保护性能，且具有很好的稳定性。本发明获得的明亮发光杆菌冻干粉，其发光度平均值为1843mv左右，接近模型预期值1820mv。并用制备的冻干粉对ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇和C₆H₅OH的毒性进行检测，发现不同批次间的冻干粉测得的EC₅₀值变异系数均小于6％。

具体实施方式

实施例1

配方：

脱脂乳 30.0％

海藻糖 22.1％

精氨酸 0.9％

氯化钠 1.3％

菌体 余量

菌体为培养后收集的物质，即菌液离心去上清后的菌体，制备方法如下：

取一支明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)EP管，将菌液接种到装有50ml培养基的250ml锥形瓶中，根据前期优化的培养条件，接种量为2％，200r/min，pH 7.0，18℃振荡培养16-20h。

所述培养基的配方：

将培养好的菌液置于离心管中，7000r/min下，离心30min，去除上清液，用1ml浓度为3％的NaCl溶液洗涤、离心，去除上清液，收集沉淀物，即为所述的菌体；

明亮发光杆菌冻干粉制备方法如下：

(1)所述的菌体加入脱脂乳、海藻糖、精氨酸和氯化钠的混合物中，分散，然后置于安瓿瓶中，-20℃预冷2小时，再在-80℃预冻12小时；

(2)将预冻后的安瓿瓶，在-50℃，冷冻干燥至含水量为3％，即可获得所述的明亮发光杆菌冻干粉。

检测步骤：

①将室温控制在20-25℃。

②开启毒性测试仪，调零，预热15min。

③取出三支三个批次制作的冻干粉，加氯化钠溶液复苏五分钟，震荡混匀，作为工作液。

移取10μl工作菌液置于加有2ml3％NaCl的5ml测试管中，轻摇混匀后置于毒性检测仪上检测发光度。若发光度在600mv-1900mv，则达到测量标准。若低于600mv，可将倍率调至“×2”档；高于1900mv，可将倍率调至“×0.5”。若仍然不能达到要求，则更换冻干粉。其发光度平均值为1843mv；

毒性试验结果如下：

按空白、样品、样品、样品，空白、样品、样品、样品的顺序摆放好各个测试管。按顺序依次加入待测样品液和工作菌液，静置15min后，置于毒性测试仪上测量发光度。

按上述同样方法，从三个批次制作的冻干粉里抽取三支，测试三种溶液的毒性大小。

若是配置的K₂Cr₂O₇浓度较大，颜色会对测试有影响。颜色的干扰校正，参考国家水质急性毒性测量标准。

我国于1995年颁布GB/T 15441-1995中华人民共和国家标准—水质急性毒性明亮发光杆菌检测法，将明亮发光杆菌冻干粉复苏后直接检测，检测对象适用于工业废水、实验室条件下的水溶性化学物等。样品与发光菌反应时间为15min(从加菌液起开始计时)。ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇、C₆H₄OCl₂(二氯苯酚)是国际标准ISO 11348中所用的参考毒性物质。为了验证所制备的冻干粉活性和稳定性，判断它是否可用实际物质的毒性检测，配制冻干保护剂，制作三批冻干粉，并对常用的标准毒物：ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇和苯酚进行毒性测量，最后对结果进行分析，观察差异性大小。

用制备的冻干粉对ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇和C₆H₅OH的毒性进行检测，发现不同批次间的冻干粉测得的EC₅₀值变异系数均小于6％；

稳定性试验：

将冻干粉存放于-80℃冰箱，每隔一段时间抽取样品检测活性，结果见下表1。

由表可知，经实验室自制的冻干粉保存于低温下，活性可至少维持半年。

将制备好的冻干粉，分别放置于35℃下保存，分别于3、6、9、12、15天检查35℃保存温度下冻干粉发光度的稳定性。

由下表可知，在35℃下冻干粉发光度可以保持15天内都满足检测要求，即常温下可以保存两周，这为现场原位毒性检测提供了可能性。

自制冻干粉复苏后，将复苏液于4℃下保存7天，观察冻干粉复苏液的稳定性。

由下表可知，冻干粉复苏液可以于4℃下保存7天之久，意味着一支自制冻干粉可以在7天之内对毒性进行连续检测，为工程应用提供了可能性。相较而言，市售冻干粉复苏后保存时间较短，一般需要当天用完。

实施例2

配方：

脱脂乳 29％

海藻糖 23％

精氨酸 0.8％

氯化钠 1.1％

菌体 余量

菌体为培养后收集的物质，即菌液离心去上清后的菌体，制备方法同实施例1.

将培养好的菌液置于离心管中，9000r/min下，离心20min，去除上清液，用1ml浓度为3％的NaCl溶液洗涤、离心，去除上清液，收集沉淀物，即为所述的菌体；

明亮发光杆菌冻干粉制备方法如下：

(1)所述的菌体加入脱脂乳、海藻糖、精氨酸和氯化钠的混合物中，分散，然后置于安瓿瓶中，-20℃预冷1小时，再在-70℃预冻3小时；

(2)将预冻后的安瓿瓶，放入真空冷冻干燥仪内，冷冻干燥至含水重量为2.5％，即可获得所述的明亮发光杆菌冻干粉。

检测步骤：

①将室温控制在20-25℃。

②开启毒性测试仪，调零，预热15min。

③取出三支三个批次制作的冻干粉，加氯化钠溶液复苏五分钟，震荡混匀，作为工作液。

移取10μl工作菌液置于加有2ml3％NaCl的5ml测试管中，轻摇混匀后置于毒性检测仪上检测发光度。若发光度在600mv-1900mv，则达到测量标准。若低于600mv，可将倍率调至“×2”档；高于1900mv，可将倍率调至“×0.5”。若仍然不能达到要求，则更换冻干粉。其发光度平均值为1680mv；

毒性试验：

按空白、样品、样品、样品，空白、样品、样品、样品的顺序摆放好各个测试管。按顺序依次加入待测样品液和工作菌液，静置15min后，置于毒性测试仪上测量发光度。

按上述同样方法，从三个批次制作的冻干粉里抽取三支，测试三种溶液的毒性大小。

若是配置的K₂Cr₂O₇浓度较大，颜色会对测试有影响。颜色的干扰校正，参考国家水质急性毒性测量标准。

我国于1995年颁布GB/T 15441-1995中华人民共和国家标准—水质急性毒性明亮发光杆菌检测法，将明亮发光杆菌冻干粉复苏后直接检测，检测对象适用于工业废水、实验室条件下的水溶性化学物等。样品与发光菌反应时间为15min(从加菌液起开始计时)。ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇、C₆H₄OCl₂(二氯苯酚)是国际标准ISO11348中所用的参考毒性物质。为了验证所制备的冻干粉活性和稳定性，判断它是否可用实际物质的毒性检测，配制冻干保护剂，制作三批冻干粉，并对常用的标准毒物：ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇和苯酚进行毒性测量，最后对结果进行分析，观察差异性大小。

用制备的冻干粉对ZnSO₄·7H₂O、K₂Cr₂O₇和C₆H₅OH的毒性进行检测，发现不同批次间的冻干粉测得的EC₅₀值变异系数均小于6.8％；

稳定性试验：

将冻干粉存放于-80℃冰箱，每隔一段时间抽取样品检测活性，结果见下表1。

由下表可知，经实验室自制的冻干粉保存于低温下，活性可至少维持半年。

Claims (5)

1.明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

所述的菌体来自于培养的明亮发光杆菌的菌液离心去上清后剩下的菌体。

2.根据权利要求1所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

3.根据权利要求1所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

4.根据权利要求1所述的明亮发光杆菌冻干粉，其特征在于，菌体的制备方法如下：取一支明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)EP管，将菌液接种到装有50ml培养基的250ml锥形瓶中，接种量为2％，200r/min，pH 7.0，18℃振荡培养16-20h；

所述培养基的配方：

酵母粉5.0g，胰蛋白胨5.0g，Na₂HPO₄5.0g，KH₂PO₄1.0g，NaCl 30.0g，甘油3.0g，去离子水1000ml；

将培养好的菌液置于离心管中，7000～9000r/min，离心20-30min，去除上清液，用重量浓度为3～10％的NaCl溶液洗涤、离心，去除上清液，收集沉淀物，即为所述的菌体。

5.根据权利要求1～4任一项所述的明亮发光杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)所述的菌体加入脱脂乳、海藻糖、精氨酸和氯化钠的混合物中，分散，然后置于安瓿瓶中，-30～-20℃预冷1-2小时，再在-65～-75℃预冻8-12小时；

(2)将预冻后的安瓿瓶，放入真空冷冻干燥仪内，冷冻干燥至含水重量为3％以下，即可获得所述的明亮发光杆菌冻干粉。