CN102533561B - 一种食用菌菌种冷冻保藏用保护剂及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种食用菌菌种冷冻保藏用保护剂的配方及其使用方法，冷冻前保护剂配方：蔗糖溶液、甘油水溶液、谷氨酸钠、脱脂乳；冷冻后的复水保护剂配方：葡萄糖、蛋白胨、维生素B1。将冷冻前保护剂与食用菌菌种混合，经低温冷冻保藏后的菌体细胞用复水保护剂进行复水。本发明的食用菌菌种冷冻保护剂及其在食用菌菌种冷冻过程中的使用后，菌株存活率高达100％。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种食用菌菌种冷冻保藏用保护剂的配方及其使用方法。在菌种冷冻之前加入该保护剂，之后再进行冷冻低温保藏，当复水时用复水保护剂进行复水。通过该保护剂可有效防止低温冻结对食用菌菌种细胞造成的伤害，明显提高菌种的存活率。
背景技术
近年来，食用菌菌种保藏方法发展迅速。已由传统的继代培养发展到基质保藏、冷冻干燥保藏、液氮超低温保藏等新方法。新方法除了具有其各自优点外，也存在一些问题。例如，液氮超低温保藏法是目前食用菌菌种保藏时间最长，效果最好的方法，但该法对设备要求高，目前国内仅有几家菌种保藏机构采用该方法。又如真空冷冻干燥保藏法，该方法仅适用于保藏食用菌孢子，不适于保藏菌丝体，通常不用于食用菌菌种的保藏。而基质保藏法虽简便易行，但保藏时间相对较短，基质易发生腐败污染等问题，限制了其推广应用。因此找到一种简便易行、保藏效果好、时间长且适用于食用菌菌种的方法，成为食用菌菌种保藏工作的重点。
低温冷冻保藏法是指将食用菌菌丝体添加保护剂后，冷冻在-15～-40℃的冰箱中。该法可用于食用菌菌种的长期保藏，简便易行，采用家用冰箱冷冻室即可完成，适合小型食用菌生产厂和普通菇农户的使用，适用范围广泛。采用该法值得关注的是，由于食用菌菌丝体细胞在低温冻结过程中会受到外界恶劣环境的影响，使得菌种存活率会受影响。目前的现有研究表明，一些种类的食用菌菌丝体在添加适当保护剂的前提下，进行冷冻保藏其存活率在40％左右，有一些食用菌如平菇、香菇，其存活率能达90％，而像网脉木耳、茶树菇、灵芝菌丝生长环境要求高的食用菌，其成活率则在70％左右。
发明内容
为了解决低温冷冻保藏法在保藏食用菌菌种方面存在的不足，本发明提出了一种食用菌菌丝体低温冷冻保藏用保护剂的配方及其使用方法。
本发明采用的技术方案是：
低温冷冻前保护剂的配制：
按照下列的组分和浓度配制，浓度为8％的蔗糖溶液、1％(体积比)的甘油水溶液、0.03％的谷氨酸钠溶液、10％的脱脂乳。将配制好的溶剂115℃灭菌20分钟后备用。
冷冻后复水保护剂溶液配制：
按下面的配方：葡萄糖1％、蛋白胨0.2％、维生素B10.01％，115℃灭菌20分钟后备用。
以上试剂均以蒸馏水为溶剂。
保护剂在冷冻过程中的使用方法
(1)菌种的前处理：
试管斜面菌种，用接种刀无菌条件下将斜面菌种切成黄豆粒大小的菌块，用接种环挑取2～3块(除去培养基)，置于装有冷冻前保护剂的安瓿瓶中，保护剂的添加量以刚好淹没菌种块为宜。液体菌种，在无菌条件下离心或过滤收集菌丝球，将菌丝球用无菌水冲洗1-4次，冲洗后再离心或过滤收集菌丝球，将菌丝球置于装有冷冻前保护剂的安瓿瓶中，保护剂的添加量以刚好淹没菌丝球为宜。
(2)菌种的冷冻处理：
将装有冷冻前保护剂的食用菌菌种在4℃冰箱中预冷15分钟左右，再放置到-15～-20℃的低温中进行冷冻保藏。
(3)菌种的复水处理；
复水时，将安瓿瓶取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，融化的菌丝加入复水保护剂，25℃培养24小时后，再转接到培养基上培养。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
实施例：
菌种：平菇菌种(南抗5号)，由天津市林业果树研究所提供。
平菇菌种存活率的测定方法：
平菇菌种存活率＝冷冻后的菌株成活个数/冷冻前菌株的个数。
冷冻前保护剂的配制
按照下列组分和浓度配制，浓度为8％的蔗糖溶液、1％(体积比)的甘油水溶液、0.03％的谷氨酸钠溶液、10％的脱脂乳。
冷冻后复水保护剂的配制
按下面的配方：葡萄糖1％、蛋白胨0.2％、维生素B10.01％。
以上试剂均以蒸馏水为溶剂。
平菇菌种冷冻保护剂及其在冷冻过程中的使用方法
(1)平菇菌种的前处理：
将平菇试管母种，用接种刀无菌条件下将切成黄豆粒大小的菌块，用接种环挑取2～3块(除去培养基)，置于装有冷冻前保护剂的安瓿瓶中，保护剂的添加量以刚好淹没菌种块为宜。平菇液体菌种，在无菌条件下离心或过滤收集菌丝球，将菌丝球用无菌水冲洗1-4次，冲洗后再离心或过滤收集菌丝球，将菌丝球置于装有冷冻前保护剂的安瓿瓶中，保护剂的添加量以刚好淹没菌丝球为宜。
(2)平菇菌种的冷冻处理：
将装有冷冻前保护剂的平菇菌种在4℃冰箱中预冷15分钟左右，再放置到-15～-20℃的低温中进行冷冻保藏。
(3)平菇菌种的复水处理
复水时，将安瓿瓶取出后立即置于37℃水浴中，快速解冻，融化的菌丝加入冷冻后复水保护剂，25℃培养24小时后，再转接到培养基上培养即可。
通过培养基培养观察，平菇菌种的存活率为100％。
Claims (1)
1.一种食用菌菌种冷冻保藏用保护剂，包括冷冻前保护剂及冷冻后的复水保护剂，其特征在于：
冷冻前保护剂由下列组分配制而成：
蔗糖8％，甘油1％(体积比)，谷氨酸钠0.03％，脱脂乳10％；
冷冻后的复水保护剂由下列组分配制而成：
葡萄糖1％、蛋白胨0.2％、维生素B10.01％；
以上试剂均以蒸馏水为溶剂。
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