CN111139187A - 一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111139187A
CN111139187A CN201911390939.2A CN201911390939A CN111139187A CN 111139187 A CN111139187 A CN 111139187A CN 201911390939 A CN201911390939 A CN 201911390939A CN 111139187 A CN111139187 A CN 111139187A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
flammulina velutipes
antifreeze
needle mushroom
mass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911390939.2A
Other languages
English (en)
Inventor
贾彩凤
袁志怡
董建华
秦璐婕
潘建泽
李超文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Yinong Biotechnology Co Ltd
East China Normal University
Original Assignee
Shanghai Yinong Biotechnology Co Ltd
East China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Yinong Biotechnology Co Ltd, East China Normal University filed Critical Shanghai Yinong Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911390939.2A priority Critical patent/CN111139187A/zh
Publication of CN111139187A publication Critical patent/CN111139187A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/06—Freezing; Subsequent thawing; Cooling
    • A23B4/08—Freezing; Subsequent thawing; Cooling with addition of chemicals or treatment with chemicals before or during cooling, e.g. in the form of an ice coating or frozen block
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
    • A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
    • A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3562—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/36—Freezing; Subsequent thawing; Cooling
    • A23L3/37—Freezing; Subsequent thawing; Cooling with addition of or treatment with chemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/90—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in food processing or handling, e.g. food conservation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种金针菇抗冻多糖及其制备方法，所述制备方法为：通过液体发酵得到金针菇菌丝体，后将菌丝体进行低温冷诱导，干燥后得到金针菇菌丝体粉末。菌丝体干粉按一定料液比在沸水浴中提取，重复多次。离心得到的沉淀用一定料液比的2％氢氧化钠沸水浴提取，重复多次。离心得到的沉淀用一定料液比的25％氢氧化钠沸水浴提取2h，重复多次。离心后的上清用盐酸中和，透析过夜得到所述金针菇抗冻多糖。该抗冻多糖的结构分析结果表明：其主要由木糖和甘露糖组成，还含有葡萄糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖等。将抗冻多糖应用于鸡肉制品的冷冻保存，能够明显降低冻藏期间肉制品的出液量，有效解决肉制品在冻融过程中品质下降的问题。

Description

一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗冻多糖相关技术领域，具体涉及一种经冷诱导产生的金针菇抗冻多糖及其制备和应用。
背景技术
冷冻是一种常见的保藏方法，冷冻保藏可以使产品的大部分水分被冻结，酶活性和微生物生长几乎完全受到抑制，从而达到长期保藏的效果。然而在冷冻过程中，由于温度的波动，使得产品内出现重结晶现象，即小冰晶不断生长变大，形成的大冰晶严重破坏细胞和组织结构，导致产品品质下降。
抗冻多糖，是一类附着在冰晶体表面而抑制冰晶的生长和重结晶的多糖，具有减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质地和品质的特点，因此成为研究的热点主题。与常用的抗冻保护剂海藻糖相比，抗冻多糖的抗冻活性明显高于海藻糖。但有关耐低温真菌金针菇抗冻多糖的研究报道较少，未见国内对抗冻多糖的报道，有广阔的研发和市场前景。
海藻糖为目前常用的糖类抗冻保护剂，但其在食品中的添加量高达10％，不仅增加成本，而且会改变产品的营养结构。因此，寻找、制备高抗冻活性的抗冻产品，降低其在产品中的添加量，是本发明所要解决和克服的问题。
发明内容
本发明提供一种金针菇抗冻多糖及其制备方法，该金针菇抗冻多糖是由金针菇菌丝体经发酵并冷诱导产生的。本发明制备得到的具有高抗冻活性的金针菇抗冻多糖，可用来解决冻融过程中，由于重结晶现象而导致的细胞受损造成的营养物质流失，以及蛋白变性、淀粉老化等问题，从而提升冻存过程中的产品品质。
本发明提出的一种金针菇抗冻多糖的制备方法，将冷诱导处理后的金针菇菌丝体，经冷冻干燥，研磨成粉末，然后在沸水浴中提取；离心去除上清液后，所得沉淀溶于0.5％～5％氢氧化钠中提取；离心去除上清液后，所得沉淀溶于10％～30％氢氧化钠中提取；将离心后获得的上清液用盐酸中和，透析过夜，得到所述金针菇抗冻多糖。
本发明中，通过对液体发酵法制备的金针菇菌丝体进行冷诱导(低温诱导)，以使菌丝体中产生抗冻多糖，通过碱提法进一步得到高抗冻活性的多糖。
通过本发明制备得到的产物，即金针菇抗冻多糖，为碱提法得到的多糖，主要的单糖组分为木糖和甘露糖，还含有葡萄糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖；该多糖具有耐高温的特性，在冰晶的生成过程中具有高的修饰冰晶生长的重结晶抑制活性。
本发明提出的一种金针菇抗冻多糖的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)对金针菇菌丝体进行冷诱导；
(2)将步骤(1)冷诱导处理后的金针菇菌丝体过滤，水洗，后冷冻干燥；
(3)将步骤(2)冷冻干燥后的金针菇菌丝体研磨成粉末，然后在100℃沸水浴中提取，离心去除上清液后，得到沉淀；
其中，所述粉末与沸水的质量/体积比为1：(20～40)(W/V)；
(4)将步骤(3)得到的沉淀溶于质量百分比0.5％～5％强碱性溶液进行提取，离心去除上清液后，得到沉淀；其中，所述步骤(3)得到的沉淀与氢氧化钠的质量/体积比为1：(20～40)(W/V)；其中，所述强碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或几种；优选为氢氧化钠溶液。
(5)然后步骤(4)得到的沉淀溶于质量百分比10％～-30％强碱性溶液进行提取，离心后，得到上清液；其中，所述强碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或几种；优选为氢氧化钠溶液。
其中，所述步骤(4)得到的沉淀与氢氧化钠的质量/体积比为1：(20～40)(W/V)；
(6)将步骤(5)所得上清液用盐酸或冰醋酸进行中和，并透析过夜，得到所述金针菇抗冻多糖。
本发明步骤(1)之前还可以包括金针菇菌丝体的培养步骤，所述培养的方法具体为：将金针菇菌接入种子培养基中，进行种子培养5～6天，然后以体积百分比10％～15％的接种量(优选为10％)接入发酵培养基中，发酵培养5～8天。
其中，所述种子培养的温度为20～25℃，培养时间为3～7天，种子培养的转速为150～200rpm；优选地，种子培养的温度为20℃，培养时间为5天，种子培养的转速为180rpm。
其中，所述发酵培养的温度为16～20℃，发酵培养的转速为150～200rpm，发酵培养的时间为5～8天；优选地，发酵培养的温度为18℃，发酵培养的转速为200rpm，发酵培养的时间为5天。
其中，每升种子培养基包括：葡萄糖10～30g、马铃薯150～300g、酵母粉2-4g、磷酸二氢钾0.5-1.5g、七水硫酸镁0.5-1.0g、维生素B10.01～0.05g、消泡剂0.01～0.05g，pH5.7-6.5；优选地，每升种子培养基包括：葡萄糖20g、马铃薯200g、酵母粉4g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B10.05g、消泡剂0.033g，pH 6.0。
其中，每升发酵培养基包括：可溶性淀粉20～60g、酵母粉2～10g、磷酸二氢钾0.5～1.5g、维生素B10.01～0.05g、消泡剂0.01～0.05g，pH 6.0-6.5；优选地，每升发酵培养基包括：可溶性淀粉50g、酵母粉8g、磷酸二氢钾1.5g、维生素B10.05g、消泡剂0.033g，pH 6.5。
在一具体实施方式中，所述金针菇种子及发酵培养如下：
金针菇种子的培养，种子接入发酵培养中，进行发酵培养，培养结束后菌丝体进行冷诱导，冷诱导结束后进行抗冻多糖的提取。
其中，所述种子培养基的组成为每升种子培养基包括：葡萄糖20g、马铃薯200g、酵母粉4g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B10.05g、泡敌0.033g。pH调节至6.0。
其中，所述发酵培养基的组成为：每升发酵培养基包括：可溶性淀粉50g、酵母粉8g、磷酸二氢钾1.5g、维生素B10.05g、消泡剂0.033g。pH调节至6.5。
其中，种子培养条件为：20℃，180rpm振荡培养5～6天。具体操作步骤包括：从金针菇平板上接取3块4mm×4mm大小的菌丝块，接入装液量50mL容量为250mL的挡板锥形瓶的种子液中，于20℃、180r/min振荡培养5～6天，得到活化的金针菇种子液。
其中，种子培养较好的指标表现为菌丝球个数在350个/mL左右，培养基呈现粘稠小米粥状，生物量在10g/L以上。
其中，发酵条件为：培养温度18℃，发酵转速200rpm，振荡培养5天。
其中，发酵接种量为：种子液占发酵培养基的体积百分比10％～15％；优选地，为10％。
步骤(1)中，所述“冷诱导”是指将金针菇菌丝体放入低于10℃的温度下进行冷诱导。对菌株进行冷诱导的目的是菌丝体在低温环境下出现特殊的自我保护机制，产生代谢产物，本发明通过对金针菇进行冷诱导，让金针菇处于低温胁迫以诱导产生抗冻多糖。
本发明首次创新提出，先将金针菇菌丝体经“冷诱导”处理，再依次进行“沸水提取”、“氢氧化钠提取”等步骤，以获得金针菇抗冻多糖。
步骤(1)中，所述冷诱导的条件为：温度为2～10℃，冷诱导的时间为5～10天；优选地，为4℃下冷诱导7天。
步骤(2)中，所述水可以是蒸馏水等。
步骤(2)中，所述水洗的次数为2～4次；优选地，为3次。步骤(2)中进行水洗的目的为将金针菇表面的培养基及胞外多糖洗去。
步骤(2)中，所述过滤可采用纱网、纱布、硅藻土等进行。
步骤(2)中，所述冷冻干燥的条件为冷肼温度为-40℃以下，真空为1Pa，冷冻干燥时间为13小时以上，以使菌丝体完全干燥。
步骤(3)中，所述粉末与沸水的质量/体积比优选为1：20(W/V)。
步骤(3)中，所述粉末在沸水中提取的时间为1～3h；优选地，为2h。
步骤(3)中，所述粉末在沸水中提取的次数为1～5次；优选地，为3次。
步骤(4)中，所述强碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或几种；优选为氢氧化钠溶液。
步骤(4)中，所述强碱性溶液的质量百分比优选为2％。
步骤(4)中，所述沉淀与强碱性溶液的质量/体积比1：(10～30)(W/V)；优选为1：20(W/V)。
步骤(4)中，所述提取的时间为1～3h；优选地，为2h。
步骤(4)中，所述提取的次数为1～5次；优选地，为3次。
步骤(5)中，所述强碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或几种；优选为氢氧化钠溶液。
步骤(5)中，所述强碱性溶液的质量百分比优选为25％。
步骤(5)中，所述沉淀与强碱性溶液的质量/体积比优选为1：20(W/V)。
步骤(5)中，所述提取的时间为1～3h；优选地，为2h。
步骤(5)中，所述提取的次数为1～5次；优选地，为3次。
在一具体实施方式中，从菌丝体中提取抗冻多糖的步骤为：将冷处理后的金针菇菌丝体用纱网过滤，蒸馏水清洗后，冷冻干燥；
冷冻干燥后的金针菇菌丝体研磨成粉末后，以1：20(W/V)的料液比在100℃沸水中提取2h，离心得到沉淀，该操作重复3次；
上述得到的沉淀以1：20(W/V)的料液比在质量百分比2％氢氧化钠中提取2h，离心得到沉淀，该操作重复3次；
上述得到的沉淀以1：20(W/V)的料液比在质量百分比25％氢氧化钠中提取2h，离心得到上清，该操作重复3次，合并上清液；
将上述上清液用盐酸进行中和并透析过夜，得到所述金针菇抗冻多糖。
进一步地，可以采用苯酚硫酸法测定所述金针菇抗冻多糖的浓度。
本发明中，金针菇抗冻多糖的抗冻活性采用测定重结晶抑制活性的方法，用质量百分比23％的蔗糖溶液作为对照，将多糖溶液溶于终浓度为质量百分比23％的蔗糖溶液中，设定程序并观察记录冰晶形态。
其中，抗冻活性测定的程序设定为：以80℃/min的速率迅速从室温降温至-40℃，以80℃/min的速率迅速升温至-5℃，以5℃/min的速率升温，直至出现单个冰晶，然后以0.1℃/min的速率降温，使冰晶缓慢生长，观察并记录冰晶的形态。
其中，重结晶抑制活性的定量：单位浓度的多糖溶液(1mg/mL)，经过不同的稀释倍数后，在上述冰晶形成过程中，能出现六边形冰晶的该溶液的最小稀释倍数+1，即为该多糖溶液的重结晶抑制活性的数值，即RI值。如果该多糖溶液没有稀释就有抗冻活性的定义为1，没有抗冻活性定义为0。如果多糖溶液稀释9倍后出现六边形冰晶形态，而稀释10倍后出现圆盘状冰晶，则此抗冻活性RI为9+1＝10。
本发明还提出了一种采用上述制备方法得到的金针菇抗冻多糖。该金针菇抗冻多糖为碱提多糖，主要单糖组成为木糖和甘露糖，还含有少量的葡萄糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖等，这与现有的通过提取金针菇菌丝体细胞壁获得的多糖的主要单糖成分有所不同，由于本发明中提取多糖所用的是强碱溶液，使提取得到的多糖液中含有更多的木糖成分。所述金针菇抗冻多糖经过GPC检测分子量为42.6KDa。
本发明还提出所述金针菇抗冻多糖在作为冷冻用添加剂中的应用。所述冷冻用添加剂包括肉制品添加剂、面制品添加剂、菌种保藏添加剂、化妆品冷藏添加剂、组织器官保藏运输、金属表面除霜剂等，保护冷冻过程产品免遭破坏。
本发明应用中，所述金针菇抗冻多糖可以显著有效地降低包括鸡肉、鱼肉、虾肉等的肉制品的出液量，或提高菌种细胞存活率，或提高冷冻过程中面制品品质。
本发明应用中，所述金针菇抗冻多糖的添加量为：每克产品(包括肉制品、面制品、菌种)加入0.01～0.1mg金针菇抗冻多糖。优选地，所述金针菇抗冻多糖的添加量为：每克产品(包括肉制品、面制品、菌种)加入0.1mg金针菇抗冻多糖。
优选地，当在鸡肉中添加入0.1mg/mL金针菇抗冻多糖时，该鸡肉的出液量明显低于对照组。
进一步地，将添加了所述金针菇抗冻多糖的产品放置于-20℃～-40℃进行冻存；优选地，为-20℃或-40℃。
本发明中，所述金针菇抗冻多糖可以吸附到液体的冰核表面，抑制冰核生长，控制发生冰冻的组织中的冰晶大小和形状，进而来减缓或者抑制组织冰晶的重结晶过程。加入本发明所述金针菇抗冻多糖后生成的冰晶更小以及呈现六角双锥形，避免冰晶对细胞组织的伤害，故加入抗冻多糖的产品(如鸡肉)在冷冻过程中冰晶对细胞的破坏程度更低，细胞的出液量也就越低。
抗冻多糖的抗冻保护效果，是由于金针菇菌丝体在低温冷诱导的过程中产生的，通过碱提法得到抗冻多糖，这是本发明的创新之一。该抗冻多糖是一种易溶于强碱溶液，具有抗冻保护的作用，能够与冰晶结合，抑制冰晶重结晶过程的特点，改善冻融过程中肉制品、面制品等产品品质的效果。从金针菇菌丝体中制备抗冻多糖是本发明独特具有的，区别于现有的技术。
本发明有益效果在于，本发明制备得到的金针菇抗冻多糖在冻藏期间能够对肉制品的出液量有明显降低，改善肉的品质；在菌种冻存过程中可以提高细胞的存活率；提高冷冻过程中面制品品质，提高冷藏过程中，化妆品材料的品质。有效解决了肉制品在冻融过程中导致的肉类品质下降、菌种在低温保藏期间细胞存活率低等问题。
附图说明
图1为本发明实施例1不同发酵时间对金针菇抗冻多糖含量的影响。
图2为本发明实施例2不同冷处理时间对金针菇多糖含量的影响。
图3为本发明实施例2不同冷处理时间出现明显六边形形态冰晶的最低多糖浓度的冰晶形态图。
图4为本发明实施例2不同冷处理时间对金针菇多糖抗冻活性的影响。
图5为本发明实施例3不同抗冻多糖浓度对鸡肉冻融后出液量的影响。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：不同发酵时间对金针菇产抗冻多糖含量的影响
(1)金针菇种子的培养：从金针菇平板上接取3块4mm×4mm的菌丝块接入种子培养基中。培养温度为20℃，培养转速为180rpm。培养时间为5天。
(2)金针菇发酵培养：将种子液接入发酵培养基，接种量为10％，培养温度为18℃，培养时间为7天，不同培养时间取样，对菌丝体进行低温诱导处理。
(3)金针菇菌丝体冷处理：将发酵得到的金针菇菌丝体，放入4℃冰箱进行冷处理，冷处理时间为7天。
(4)金针菇抗冻多糖的提取：冷处理后的金针菇菌丝体用纱网过滤，蒸馏水清洗后冷冻干燥。冷冻干燥后的金针菇菌丝体研磨成粉末后，以1：20的料液比在100℃沸水浴中提取2h，离心弃上清，重复3次；得到的沉淀用2％氢氧化钠提取2h，离心弃上清，重复3次；得到的沉淀用25％氢氧化钠提取2h，离心得到上清，重复3次，合并上清。所得上清液用盐酸进行中和并透析过夜，得到金针菇抗冻多糖。用苯酚硫酸法测定多糖的浓度。
实验结果如附图1所示：随着发酵时间的延长，金针菇菌丝体中抗冻多糖含量不断增加，发酵5天的抗冻多糖含量达到最大。发酵超过5天后多糖含量开始降低，表明最佳发酵时间为5天。
实施例2：不同冷处理时间对金针菇抗冻多糖抗冻活性的影响
(1)金针菇种子的培养：从金针菇平板上接取3块4mm×4mm的菌丝块接入种子培养基中。培养温度为20℃，培养转速为180rpm。培养时间为5天。
(2)金针菇发酵培养：将种子接入发酵培养基，接种量为10％，培养温度为18℃，培养时间为5天。
(3)金针菇菌丝体冷处理：将发酵得到的金针菇菌丝体，放入4℃冰箱中，冷处理8天，不同冷处理时间分别取样。
(4)金针菇多糖的提取：冷处理后的金针菇菌丝体用纱网过滤，蒸馏水清洗后冷冻干燥。冷冻干燥后的金针菇菌丝体研磨成粉末后，以1：20的料液比在100℃沸水浴中提取2h，离心弃上清，重复3次；得到的沉淀用2％氢氧化钠提取2h，离心弃上清，重复3次；得到的沉淀用25％氢氧化钠提取2h，离心得到上清，重复3次，合并上清。所得上清液用盐酸进行中和并透析过夜，得到金针菇抗冻多糖。用苯酚硫酸法测定多糖的浓度，并检测不同冷处理时间金针菇多糖的抗冻活性。
(5)抗冻活性的测定：通过安装有冷热台(THMS600，linkham公司)的显微镜观察降温过程中冰晶的形态，来检测抗冻多糖的抗冻活性。
程序如下：取luL含有抗冻多糖和质量百分比23％蔗糖的样品到热台的圆形玻片上，热台的温控程序如下：从室温以80℃/min速度冷却至-40℃，并保持0分钟。以80℃/min的速度迅速升温至-5℃，后以5℃/min的速度升温，直至出现单个冰晶，后以0.1℃/min的速度降温，使冰晶缓慢生长，观察并记录冰晶形态(物镜10X)，以23％蔗糖溶液为对照。以单位多糖溶液(1mg/mL)出现六边形冰晶的最大稀释度进行抗冻活性的计算。
多糖含量测定实验结果如图2所示：随着冷处理时间的延长，抗冻多糖的含量逐渐增加。冷处理7天，多糖含量达到最大，是冷处理前多糖含量的3倍左右。
抗冻活性实验结果如图3：随着冷处理时间的延长，在冰晶生长过程中，出现六边形冰晶需要的多糖浓度越低；冷处理前，多糖浓度为0.2mg/mL才出现六边形冰晶，冷处理7天时，多糖浓度为0.05mg/mL即开始出现六边形冰晶。随着冷处理时间的延长，出现六边形冰晶的最低多糖浓度越低，说明经过冷处理后，更低的多糖浓度可以起到修饰冰晶的作用，即冷处理后抗冻活性增强。当水溶液在冰点以下的降温过程中，会形成冰晶，抗冻多糖和冰晶的相互作用，改变了冰晶圆盘状的生长模式，冰晶的形态被修饰六边形，从而抑制冰晶的重结晶过程，减少大冰晶的生成，从而降低了细胞组织的损伤，提高了机体的抗冻活性。
抗冻活性定量化后，如图4所示，随着冷处理时间的延长，金针菇抗冻多糖的抗冻活性逐渐提高，冷处理7天的多糖的抗冻性达到最高值，故本发明中，最佳冷处理时间为7天。
实施例3：抗冻多糖的应用实验
(1)50g鸡肉，切成大小为5cm×5cm鸡块，加入浓度分别为2.2μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的多糖溶液20mL,3℃作用24h，后放入-80℃迅速冷冻2h，分别放入聚乙烯袋中，密封，并在-20℃冷冻，冷冻7天。4℃解冻后，4000rpm/min离心10min，称鸡肉的重量。
(2)鸡肉的出液量％＝(初始鸡肉的重量-离心后鸡肉的重量)/初始鸡肉的重量
实验结果如图5所示，加入金针菇多糖的鸡肉与对照组相比，鸡肉的出液量都有一定程度的降低，加入100μg/mL的金针菇多糖的鸡肉的出液量与对照组相比有显著性差异。故添加金针菇抗冻多糖能够显著降低鸡肉在冻融后的出液量。
实施例4：抗冻多糖单糖组成成分分析
将实施例1中发酵5天的金针菇发酵液按实施例1中(4)金针菇抗冻多糖的提取方法，得到抗冻多糖样品，精确称取15mg所述金针菇抗冻多糖，记录称取质量，加入具塞试管中。再按1mg：1.5mL的比例加入2mol/L的三氟乙酸(TFA)，塞好塞子之后放入烘箱中于110℃下水解3小时，水解之后转入楔形瓶中，用纯水冲洗3次也转入楔形瓶中，于旋转蒸发仪上(40℃)减压蒸干，之后再加入甲醇3mL，继续蒸干，重复4～5次，除去残留的TFA。
使用戴安Dionex ICS2500系统，CarboPac PA20阴离子交换分析柱(150mm×3mmi.d.)，检测标准品为：岩藻糖(Fucose)，鼠李糖(Rhamnose)，阿拉伯糖(Arabinose)，半乳糖(Galactose)，葡萄糖(Glucose)，木糖(Xylose)，甘露糖(Mannose)，果糖(Fructose)，核糖(Rib)，半乳糖酸(GalA)，GluA(葡萄糖醛酸)。
实验结果如表1所示，本发明所提取的抗冻多糖主要由木糖和甘露糖组成，还含有葡萄糖以及少量的阿拉伯糖和半乳糖等。
表1抗冻多糖单糖组成成分分析
Figure BDA0002344907300000081
Figure BDA0002344907300000091
对比例：抗冻多糖与海藻糖抗冻活性的比较
海藻糖是食品中常用的抗冻保护剂，因此，本实施例比较了海藻糖、以上实施例2中冷诱导7天金针菇菌丝体制备的抗冻多糖的抗冻效果。抗冻活性的测定方法参照实施例2。
实验结果表明：250mg/mL的海藻糖才开始有六边形的冰晶出现，而本发明实施例2制备的金针菇抗冻多糖在0.06mg/mL时即出现明显的六边形冰晶。因此在修饰冰晶形状方面，其抗冻活性为海藻糖的4166倍。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (14)

1.一种金针菇抗冻多糖的制备方法，其特征在于，将冷诱导处理后的金针菇菌丝体，经冷冻干燥，研磨成粉末，然后在沸水浴中提取；离心去除上清液后，所得沉淀溶于质量百分比0.5％～5％氢氧化钠中提取；离心去除上清液后，所得沉淀溶于质量百分比10％～30％氢氧化钠中提取；将离心后获得的上清液用盐酸中和，透析过夜，得到所述金针菇抗冻多糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)对金针菇菌丝体进行冷诱导；
(2)将步骤(1)冷诱导处理后的金针菇菌丝体过滤，水洗，后冷冻干燥；
(3)将步骤(2)冷冻干燥后的金针菇菌丝体研磨成粉末，然后在100℃沸水浴中提取，离心去除上清液后，得到沉淀；
其中，所述粉末与沸水的质量/体积比为1：(20～40)(W/V)；
(4)将步骤(3)得到的沉淀溶于质量百分比0.5％～5％强碱性溶液中进行提取，离心去除上清液后，得到沉淀；
其中，所述步骤(3)得到的沉淀与强碱性溶液的质量/体积比为1：(20～40)(W/V)；
(5)然后步骤(4)得到的沉淀溶于质量百分比10％～-30％强碱性溶液中进行提取，离心后，得到上清液；
其中，所述步骤(4)得到的沉淀与氢氧化钠的质量/体积比为1：(20～40)(W/V)；
(6)将步骤(5)所得上清液用盐酸或冰醋酸进行中和，并透析过夜，得到所述金针菇抗冻多糖。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，步骤(1)中，所述冷诱导的温度为2～10℃，冷诱导的时间为5～10天。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，步骤(2)中，所述水可以是蒸馏水；所述水洗的次数为2～4次；和/或，所述过滤可采用纱网、纱布、硅藻土进行；和/或，所述冷冻干燥的条件为冷肼温度为-40℃以下，真空为1Pa，冷冻干燥时间为13小时以上，以使菌丝体完全干燥。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，步骤(3)中，所述粉末与沸水的质量/体积比为1：20(W/V)；和/或，所述粉末在沸水中提取的时间为1～3h；和/或，所述粉末在沸水中提取的次数为1～5次。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，步骤(4)中，所述强碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或几种；和/或，所述强碱性溶液的质量百分比为2％；和/或，所述沉淀与强碱性溶液的质量/体积比1：(10～30)(W/V)；和/或，所述提取的时间为1～3h；和/或，所述提取的次数为1～5次。
7.如权利要求1或2所述的制备方法，步骤(5)中，所述强碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等中的一种或几种；和/或，所述强碱性溶液的质量百分比优选为25％；和/或，所述沉淀与强碱性溶液的质量/体积比为1：20(W/V)；和/或，所述提取的时间为1～3h；和/或，所述提取的次数为1～5次。
8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述金针菇菌丝体的培养方法为：将金针菇菌种接入种子培养基中，进行种子培养5～6天；然后以体积比10％～15％的接种量接入发酵培养基中，发酵培养5～8天。
9.如权利要求1或2所述的制备方法，每升所述种子培养基包括：葡萄糖10～30g、马铃薯150～300g、酵母粉2～4g、磷酸二氢钾0.5～1.5g、七水硫酸镁0.5-1.0g、维生素B10.01～0.05g、消泡剂0.01～0.05g，pH 5.7-6.5；和/或，
每升所述发酵培养基包括：可溶性淀粉20～60g、酵母粉2～10g、磷酸二氢钾0.5～1.5g、维生素B10.01～0.05g、消泡剂0.01～0.05g，pH 6.0-6.5；
所述种子培养温度为20～25℃，种子培养转速为150～200rpm；和/或，发酵培养温度为16～20℃，发酵转速为150～200rpm。
10.一种如权利要求1～9之任一项所述方法制备得到的金针菇抗冻多糖。
11.如权利要求10所述的金针菇抗冻多糖作为冷冻用添加剂中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述冷冻用添加剂包括冷冻肉制品添加剂、冷冻面制品添加剂、菌种冷冻保藏添加剂、化妆品冷藏添加剂、组织器官保藏运输、金属表面除霜剂，保护冷冻过程产品免遭破坏。
13.如权利要求11或12所述的应用，其特征在于，所述金针菇抗冻多糖降低冻融过程中肉制品出液量，或提高冷冻保藏菌种细胞的存活率，或提高冷冻过程中面制品品质。
14.如权利要求11或12所述的应用，其特征在于，所述金针菇抗冻多糖添加量为：每克产品中加入0.01～0.1mg金针菇抗冻多糖；和/或，所述冷冻是指在-20℃～-40℃温度条件下的冻存。
CN201911390939.2A 2019-12-30 2019-12-30 一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用 Pending CN111139187A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911390939.2A CN111139187A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911390939.2A CN111139187A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111139187A true CN111139187A (zh) 2020-05-12

Family

ID=70521637

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911390939.2A Pending CN111139187A (zh) 2019-12-30 2019-12-30 一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111139187A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111704677A (zh) * 2020-06-18 2020-09-25 南京农业大学 一种利用冰壳法分离麦麸抗冻多糖的生产技术
CN117756953A (zh) * 2022-08-12 2024-03-26 南京农业大学 一种小麦麸皮抗冻阿拉伯木聚糖制备方法、结构鉴定与应用
CN117756953B (zh) * 2022-08-12 2024-05-31 南京农业大学 一种小麦麸皮抗冻阿拉伯木聚糖制备方法、结构鉴定与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109929072A (zh) * 2019-03-22 2019-06-25 华东师范大学 一种抗冻多糖复合淀粉水凝胶及制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109929072A (zh) * 2019-03-22 2019-06-25 华东师范大学 一种抗冻多糖复合淀粉水凝胶及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAMATE-CHO等: "Antifreeze Activity of Xylomannan from the Mycelium and Fruit Body of Flammulina velutipes", 《BIOCONTROL SCIENCE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111704677A (zh) * 2020-06-18 2020-09-25 南京农业大学 一种利用冰壳法分离麦麸抗冻多糖的生产技术
CN111704677B (zh) * 2020-06-18 2021-09-24 南京农业大学 一种利用冰壳法分离麦麸抗冻多糖的方法
CN117756953A (zh) * 2022-08-12 2024-03-26 南京农业大学 一种小麦麸皮抗冻阿拉伯木聚糖制备方法、结构鉴定与应用
CN117756953B (zh) * 2022-08-12 2024-05-31 南京农业大学 一种小麦麸皮抗冻阿拉伯木聚糖制备方法、结构鉴定与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rodríguez et al. Agar from Gracilaria gracilis (Gracilariales, Rhodophyta) of the Patagonic coast of Argentina–Content, structure and physical properties
CN106755188B (zh) 一种褐藻寡糖单体的制备方法及褐藻寡糖
CN1806682A (zh) 一种生产风干牛肉的方法
CN102206689B (zh) 一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法
CN101033455A (zh) 一种低酸发酵加工用植物乳杆菌专用菌株及其发酵剂的制备方法
EP2609811A1 (en) Ice crystallization inhibitor derived from basidiomycetes
CN111972212B (zh) 一种人工栽培桑黄的栽培料及其制备方法
CN111534439B (zh) 一种草酸青霉菌sdf-25菌株及其应用
CN112322504B (zh) 一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法
CN110819566B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN111139187A (zh) 一种金针菇菌抗冻多糖及其制备方法和应用
CN112358988A (zh) 植物乳杆菌菌株ldvs008及其应用
CN114085875B (zh) 一种胞外多糖、制备方法及其应用
CN111938074A (zh) 一种大米的加工方法
CN112280718B (zh) 植物乳杆菌菌株ldvs012及其应用
Nguyen et al. Effect of ethanol stress on fermentation performance of Saccharomyces cerevisiae cells immobilized on Nypa fruticans leaf sheath pieces
CN105341674B (zh) 一种降低大米中重金属镉含量的发酵方法
CN111704677A (zh) 一种利用冰壳法分离麦麸抗冻多糖的生产技术
CN102533561B (zh) 一种食用菌菌种冷冻保藏用保护剂及使用方法
CN111154666B (zh) 一株具有淀粉凝集活性的柠檬明串珠菌
CN113999325B (zh) 一种米糠发酵多糖，制备及应用
CN109295127B (zh) 一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用
Chirapart et al. Physical and chemical properties of agar from a new member of Gracilaria, G. lemaneiformis (Gracilariales, Rhodophyta) in Japan
CN110656140A (zh) 一种碱冻融体系预处理几丁质提高几丁质降解率的方法
CN115595286B (zh) 一种植物乳杆菌菌剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200512