CN112322504B - 一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法 - Google Patents

一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵罐发酵和提取步骤，所述发酵步骤采用的发酵培养基为：黄豆饼粉20g‑25g/L，葡萄糖10g‑15g/L，蔗糖10g‑15g/L，磷酸二氢钾0.3‑0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g‑0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，肌苷酸0.02‑0.1g/L，余量为水。本发明在发酵培养基中添加肌苷酸，不仅可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷含量，还能提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。

Description

一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法
技术领域
本发明属于食品保健品微生物技术领域，涉及一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法。
背景技术
冬虫夏草是多种寄生真菌生长在虫体之上的复合体；在我国主要分布在西藏地区，此外在云南、四川、甘肃、新疆也有分布；是一种珍贵的食药用真菌。其体内不仅含有丰富的营养物质，还含有能够对人体多种疾病有预防和治疗功效的功能性成分；比如核苷类、甾醇类、虫草素类等。但由于生长条件等影响，冬虫夏草产量极低，在市场上供不应求。
腺苷是冬虫夏草中主要的功能性成分，它做为一种内源性核苷广泛分布在人体之中，对人体的许多系统和组织都具有重要的生理学功能。腺苷可通过核苷类物质的代谢途径参与到人体的免疫和代谢系统之中，对心血管疾病、慢性支气管炎、肝硬化、高血脂等疾病有显著的预防和治疗功效，同时腺苷也是虫草类产品质量评价的一项重要指标。
蝙蝠蛾拟青霉(虫草)是一株从冬虫夏草中分离出来的寄生真菌，利用蝙蝠蛾拟青霉菌株通过深层液态发酵法产生的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中含有与冬虫夏草一致的功能性成分，其优势在于能够人工控制产生大量的菌丝体，同时菌丝体做为蝙蝠蛾拟青霉的初始形态，其多种功能性成分的含量高于子实体。此外，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的腺苷含量也是考察蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉质量水平主要指标之一(中国药典规定腺苷含量≥0.2％为合格虫草菌粉)。
肌苷酸(IMP)又名次黄嘌呤核苷酸，是在RNA中发现的一种核苷酸，目前许多研究表明其具有风味特性。在细菌核苷类物质代谢中，肌苷酸被发现是腺苷重要的前体物质，其对于腺苷的代谢可能具有一定的影响作用；在真菌的腺苷代谢过程中，肌苷酸是否也是前体物质，能否对腺苷的提升产生一定的影响还没有相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提升现有产品的质量水平，提供一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法。本发明在发酵培养基中添加腺苷代谢途径中可能的前体物食品级肌苷酸(IMP)，不仅可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷含量，还能提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵罐发酵和提取步骤，所述发酵步骤采用的发酵培养基为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g-0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，肌苷酸0.02-0.07g/L，余量为水。在发酵培养基中添加肌苷酸0.02-0.1g/L，优选添加肌苷酸0.02-0.07g/L。在发酵培养基中添加一定量的肌苷酸不仅可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷含量，还能提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。此外，肌苷酸的量加入过少不能对腺苷积累产生积极影响，加入肌苷酸的量过多会发生反馈抑制，明显降低蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷含量。
优选所述的菌种活化是将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子。
优选所述斜面培养基组成为:麸皮50g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO41g/L,硫酸镁0.3g/L，琼脂粉15g/L。
优选所述的种子液的制备为将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液。
优选所述的种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，黄豆饼粉20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，豆油2g/L，pH自然，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的种子培养基。
优选所述的发酵罐发酵为：以发酵培养基体积计，将种子液按照10％接种量接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；优选的，所述发酵培养基的pH是使用1～4mol/L磷酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。
优选所述的提取步骤为：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
上述干燥指的是依次采用螺带干燥、热风真空烘干和沸腾干燥完成。
优选蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉制粒是利用40-80目不锈钢筛网。
上述增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，具体可以包括以下步骤：
(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；
所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g-0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明在发酵培养基中添加了肌苷酸，借鉴原核细菌的代谢途径，验证真菌是否具有与细菌相似的代谢途径(可以利用肌苷酸作为前体物质代谢产生腺苷)；同时设置了肌苷酸的添加浓度，能够全面了解肌苷酸的不同浓度是否对腺苷含量提高具有无影响、促进、反馈抑制等一种或几种作用；排除实施例偶然性，获得准确的实施结果。不仅可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷含量，还能提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；
所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)菌株，该菌株已于2020年10月在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20758；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；
所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g-0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，肌苷酸0.03g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎,利用40-80目不锈钢筛网制粒,并利用沸腾干燥彻底烘干,制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
实施例2
一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；
所述蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)菌株，该菌株已于2020年10月在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20758；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；
所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g-0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，肌苷酸0.07g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎,利用40-80目不锈钢筛网制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
实施例3
一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；
所述蝙蝠蛾拟青霉菌株，该菌株已于2020年10月在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20758；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；
所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g-0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，肌苷酸0.1g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎,利用40-80目不锈钢筛网制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
对比例1
一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；
所述蝙蝠蛾拟青霉菌株，该菌株已于2020年10月在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20758；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；
所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g-0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎,利用40-80目不锈钢筛网制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
实施例1，实施例2，实施例3与对比例1的实施结果如下表所示：
Figure BDA0002807856210000081
通过上表三组实施例和一组对比例可以看出，在发酵培养基中添加肌苷酸，其添加浓度与蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量成正比关系；三组实施例的腺苷含量都明显高于对比例，在实施例2中腺苷含量最高，说明实施例2的肌苷酸添加浓度最适合腺苷的提升；而三组实施例和一组对比例中的甘露醇含量无明显差异，说明添加肌苷酸对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中甘露醇无影响。综合上述结论可以得出在发酵培养基中添加肌苷酸不但可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷含量，还可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。
(1)腺苷的测量方法执行《NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法》。
(2)甘露醇测定按以下方法进行：精密量取腺苷含量测定项下的供试品溶液10ml，置碘瓶中，精密加入高碘酸钠(钾)溶液50ml，置水浴上加热15分钟，放冷，加碘化钾试液10ml，密塞放置5分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于0.3643mg的C6H14O6。
结果计算
Figure BDA0002807856210000091
式中：V空：空白消耗硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)的体积(ml)；
V样：供试品消耗硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)的体积(ml)；
C：硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)浓度(mol/L)；
W：供试品的称样量(g)。
(3)试剂配制
1.硫酸溶液：取适量水加入1ml硫酸并稀释定容至20ml，即得。
2.高碘酸钠(钾)溶液：取高碘酸钠(钾)2.3g溶解定容至1000mL即得。
3.碘化钾试液：取碘化钾16.5g，加水使溶解成100ml，即得。本液应临用新制。
4.硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)：按中国药典2015年版四部通则8006“滴定液”配制并标定。

Claims (9)

1.一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵罐发酵和提取步骤，其特征是：所述发酵步骤采用的发酵培养基为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g-0.4g/L，无水氯化钙 0.25g/L，豆油0.4g/L，肌苷酸0.02-0.1g/L，余量为水；所述蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali）菌株已于2020年10月在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20758。
2.根据权利要求1所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于所述的菌种活化是将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子。
3.根据权利要求2所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于，所述斜面培养基组成为:麸皮50g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO41g/L,硫酸镁0.3g/L，琼脂粉15g/L。
4.根据权利要求1所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于，所述的种子液的制备为将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液。
5. 根据权利要求4所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于，所述的种子培养基组成为：葡萄糖20 g/L，黄豆饼粉20g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾 1g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，豆油2g/L，pH自然，余量为水；在温度121℃下灭菌30-40min，得到所述的种子培养基。
6.根据权利要求1所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于，所述的发酵罐发酵为：以发酵培养基体积计，将种子液按照10％接种量接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时。
7.根据权利要求1所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于所述的提取步骤为：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干,制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。
8.根据权利要求7所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于，所述干燥指的是依次利用螺带干燥、热风真空烘干、沸腾干燥完成。
9.根据权利要求7所述的增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法，其特征在于，所述的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉其最终制粒是利用40-80目不锈钢筛网。
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