CN110195083B - 一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法 - Google Patents

一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明针对桦褐孔菌醇这一具有抗癌活性的物质进行液态发酵的培养基和培养条件的优化。以此为基础，再添加外源因子作为提升桦褐孔菌醇产量的调控手段。本实验室经过对外源因子的筛选，最终选定香叶醇作为最佳外源因子。香叶醇属于比较便宜的常见工业原料且香叶醇的添加浓度很低。最终得到桦褐孔菌醇的最高单位产量为9.39mg/g，最高产量为42.02mg/L。本发明设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低，资源利用率高，能明显提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇的产量。

Description

一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
桦褐孔菌，又名白桦茸(Inonotus obliqus(Fr.)Pilat)，是一种珍贵的药食两用真菌，寄主在白桦树。在俄罗斯民间作为抗癌药材使用。桦褐孔菌中含有三萜、多糖、多酚等多种具有药理活性的化学成分，具有抗癌、抗氧化、降血糖、免疫调节等功能。桦褐孔菌醇是桦褐孔菌特有的一种羊毛甾烷型三萜化合物，具有抗血癌、人肺腺癌和子宫颈癌等抗癌活性。因此，以桦褐孔菌醇作为原料开发新药将显示出巨大的发展潜力和经济效益。
由于野生桦褐孔菌的资源比较稀少，宿主的特异性及生长缓慢等特点，且随着保健食品、药用饮料等多种绿色健康食品的开发，野生桦褐孔菌资源已经远远不能满足人类的需求。到目前为止，野生真菌虽然具有很强的药理活性，但其人工繁殖和驯化栽培技术还未成熟。虽有报道显示能成功进行人工栽培获得桦褐孔菌子实体，但其得到的产量很低，生产周期长且重现度差，因此不能进行大规模生产。液态发酵技术是一种很有前景的用于获取更多有用次级代谢物产量的可靠途径。相比传统的固体发酵方法，液态发酵技术具有生产周期短，产率高、生产过程容易控制、产量高以及易于提取分离等优点，在食用菌生产中具有广阔的应用前景。
由于桦褐孔菌三萜类化合物提取率较低、产量较低和纯度不高等因素影响，导致桦褐孔菌三萜药用价值开发利用严重不足，尤其是作为桦褐孔菌特有的，抗癌活性高的天然活性物质桦褐孔菌醇。产量低成为了桦褐孔菌醇研究与实际应用的限制性因素。目前，针对桦褐孔菌醇产量的研究并不多。
在Xiangquan Xu等人已发表的SCI论文《Stimulated production oftriterpenoids of Inonotus obliquus using methyl jasmonate and fatty acids》中，以桦褐孔菌发酵总三萜产量为指标优化发酵培养基和发酵条件，分别加入外源因子茉莉酸甲酯和脂肪酸，利用桦褐孔菌(CBS314.39)发酵生产桦褐孔菌醇的最高单位产量仅为2.5mg/g，最高产量仅为23.26mg/L，且添加的茉莉酸甲酯和脂肪酸的成本较高，无法满足工业上生产的需求。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明针对桦褐孔菌醇这一具有抗癌活性的物质进行液态发酵的培养基和培养条件的优化。以此为基础，再添加外源因子作为提升桦褐孔菌醇产量的调控手段。本实验室经过对外源因子的筛选，最终选定香叶醇作为最佳外源因子。香叶醇属于比较便宜的常见工业原料且香叶醇的添加浓度很低。最终使桦褐孔菌醇的产量达到42.02mg/L。
本发明的第一个目的是提供一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法，将桦褐孔菌接种至发酵培养基中进行发酵，并在发酵过程中添加外源因子；所述外源因子为香叶醇、角鲨烯或柠檬烯。
在一种实施方式中，所述香叶醇的添加浓度为0.005-0.05％(v/v)。
在一种实施方式中，所述香叶醇的添加浓度优选为0.02％(v/v)。
在一种实施方式中，添加香叶醇的时间为发酵第4-8天。
在一种实施方式中，所述桦褐孔菌是桦褐孔菌(CFCC 83414)。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中的氮源为复合氮源；所述复合氮源中玉米浆粉和硝酸钠的质量比为1：1。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖20-70g/L，玉米浆粉1.5-5g/L，硝酸钠1.5-5g/L，磷酸氢二钾0.5-2g/L，硫酸镁0.2-1.5g/L，氯化钙0.05-0.4g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的配方优选为：葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钙0.1g/L。
在一种实施方式中，所述接种是接种桦褐孔菌种子液；所述种子液是以单菌落接种至种子培养基，24-32℃，130-200rpm，培养3-7天。
在一种实施方式中，所述种子培养基为：葡萄糖20-60g/L，大豆蛋白胨1-6g/L，酵母浸粉1-6g/L，七水硫酸镁0.3-2g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，氯化钙0.01-0.4g/L，pH自然。
在一种实施方式中，所述接种的接种量为5-25％，装液量为50-250mL，初始pH为5-9，种龄为3-7天。
本发明还提供所述方法及其制备得到的桦褐孔菌醇在药物制备和食品领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明针对桦褐孔菌醇这一具有抗癌活性的物质进行液态发酵的培养基和培养条件的优化。以此为基础，再添加外源因子作为提升桦褐孔菌醇产量的调控手段。经过对外源因子的筛选，最终选定香叶醇作为最佳外源因子。香叶醇属于比较便宜的常见工业原料且香叶醇的添加浓度很低。最终使桦褐孔菌醇的单位产量达到42.02mg/L。本发明设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低，资源利用率高，能明显提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇的产量。
生物材料
本发明采用的桦褐孔菌菌株(Inonotus obliquus)购买于中国林业微生物保藏管理中心(菌种编号CFCC 83414)。
附图说明
图1：桦褐孔菌醇液相标准曲线。
图2：桦褐孔菌醇标准品和样品的保留时间。
图3：桦褐孔菌液态发酵产桦褐孔菌醇的生长曲线。
具体实施方式
桦褐孔菌醇的检测方法：
(1)液态发酵样品的预处理
将发酵结束的菌丝体于45℃烘干至恒重，磨成粉末，取研磨成粉状的样品1g至25ml具塞试管中，加入10ml异丙醇，水浴超声5min，间歇4s后，在50℃水浴锅中萃取2h。之后离心分离，收集上层清液，之后样品经过0.22um微孔膜过滤。
(2)液相色谱检测(HPLC检测)
仪器：HPLC Waters 1525；
色谱柱型号：Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×150μm 5μm；
流动相：0.1％甲酸水：纯乙腈＝20：80(v/v)；
流速：等度洗脱，1.0mL·min-1；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
检测器：紫外检测器Waters 2487；
检测波长：210nm；
保留时间：20min左右。
(3)桦褐孔菌醇含量的计算：c(mg/L)＝(出峰面积+88716.4)/9409.2
桦褐孔菌醇含量(mg/L)＝c(mg/L)*20/1000(稀释倍数L/g)*菌体干重(g/L)
式中c：萃取液中桦褐孔菌醇浓度(mg/L)；
20/1000(稀释倍数)：料液比(1g样品：20/1000L萃取液)
实施例1：不同氮源发酵生产桦褐孔菌醇
种子液培养基：葡萄糖30g/L，大豆蛋白胨2g/L，酵母浸粉2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.1g/L，pH自然。
发酵培养基：氮源(酵母浸粉、大豆蛋白胨、玉米浆粉、柠檬酸铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、硝酸钠中的一种)6g/L，葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
(1)种子液的制备
将桦褐孔菌(CFCC 83414)活化后接种到种子液培养基，在转速为160r/min，温度27℃条件下，摇瓶发酵培养5d。
(2)发酵培养
将处于对数生长期的桦褐孔菌液体种子液以体积比15％的接种量接入含有6g/L不同的氮源种类的发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。氮源种类分别为酵母浸粉、大豆蛋白胨、玉米浆粉、柠檬酸铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、硝酸钠。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优有机氮源为玉米浆粉，桦褐孔菌醇的产量为7.43mg/L，最优无机氮源为硝酸钠，桦褐孔菌醇的产量为7.51mg/L。
表1不同氮源发酵的结果
Figure BDA0002130041910000041
实施例2：不同复合氮源添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：复合氮源(玉米浆粉和硝酸钠的质量比为1：1)(分别为3、6、9、12、15g/L)，葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入含有不同添加量的复合氮源(玉米浆粉：硝酸钠＝1：1)发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。氮源添加量分别为3、6、9、12、15g/L。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优复合氮源的添加量为3g/L，桦褐孔菌醇的产量为14.53mg/L。
表2不同氮源添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000042
实施例3：不同碳源发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：碳源(葡萄糖、米粉、麦芽糖、玉米粉、马铃薯淀粉、蔗糖、糊精中的一种)30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入30g/L不同的碳源种类发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。碳源种类分别为葡萄糖、米粉、麦芽糖、玉米粉、马铃薯淀粉、蔗糖、糊精。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优碳源的种类为葡萄糖，桦褐孔菌醇的产量为10.98mg/L。
表3不同碳源发酵的结果
Figure BDA0002130041910000051
实施例4：不同碳源添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖(分别为20、30、40、50、60、70g/L)，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入含有不同添加量的葡萄糖碳源发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。碳源(葡萄糖)添加量分别为20、30、40、50、60、70g/L。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优葡萄糖的添加量为30g/L，桦褐孔菌醇的产量为11.16mg/L。
表4不同碳源添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000052
实施例5：不同硫酸镁添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：硫酸镁(分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g/L)，葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入含有不同添加量的七水硫酸镁发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。硫酸镁添加量分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g/L。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优硫酸镁的添加量为0.3g/L，桦褐孔菌醇的产量为11.92mg/L。
表5不同硫酸镁添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000053
实施例6：不同磷酸二氢钾添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：磷酸二氢钾(分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g/L)，葡萄糖30g/L,玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入含有不同添加量的磷酸二氢钾发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。磷酸二氢钾添加量分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g/L。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优磷酸二氢钾的添加量为1.5g/L，桦褐孔菌醇的产量为12.99mg/L。
表6不同磷酸二氢钾添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000061
实施例7：不同氯化钙添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：氯化钙(分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4g/L)，葡萄糖30g/L,玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以以体积比15％的接种量接入含有不同添加量的氯化钙发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。氯化钙添加量分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4g/L。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优氯化钙的添加量为0.1g/L，桦褐孔菌醇的产量为14.30mg/L。
表7不同氯化钙添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000062
实施例8：不同桦褐孔菌接种量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L,玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以不同的体积比的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。接种量分别为5％、10％、15％、20％、25％。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优接种量为15％，桦褐孔菌醇的产量为9.75mg/L。
表8不同桦褐孔菌接种量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000063
实施例9：不同装液量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L,玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。装液量分别为50mL、100mL、150mL、200mL、250mL。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优装液量为150mL,桦褐孔菌醇的产量为12.09mg/L。
表9不同装液量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000071
实施例10：不同pH发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L,玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。pH分别为5、6、7、8、9。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优pH为7，桦褐孔菌醇的产量为15.19mg/L。
表10不同pH发酵的结果
Figure BDA0002130041910000072
实施例11：不同种龄桦褐孔菌发酵生产桦褐孔菌醇
种子液培养基：葡萄糖30g/L，大豆蛋白胨2g/L，酵母浸粉2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.1g/L，pH自然。
发酵培养基：葡萄糖30g/L,玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
(1)种子液的制备
将桦褐孔菌(CFCC 83414)活化后接种到种子液培养基，在转速为160r/min，温度27℃条件下，摇瓶发酵培养3-7d。
(2)发酵培养
分别将种龄为3、4、5、6、7天的桦褐孔菌(CFCC 83414)液体种子以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，发酵培养10d。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优种龄为4天，桦褐孔菌醇的产量为19.50mg/L。
表11不同种龄桦褐孔菌发酵的结果
Figure BDA0002130041910000081
实施例12：不同外源因子发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中。在温度27℃转速160rpm条件下，在发酵的第4天，添加不同的外源因子(茉莉酸甲酯、香叶醇、角鲨烯、柠檬烯、β-蒎烯、萜品油烯)，添加浓度为筛选过的最适浓度，即茉莉酸甲酯、角鲨烯、柠檬烯、β-蒎烯、萜品油烯的浓度为0.005％(w/v)香叶醇的浓度为0.02％(w/v)，发酵培养10d。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。桦褐孔菌醇的产量为27.89mg/L。
表12不同外源因子发酵生产桦褐孔菌醇
Figure BDA0002130041910000082
实施例13：不同香叶醇添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，在第4天的时候添加不同浓度(v/v)的外源因子香叶醇，香叶醇的添加浓度分别为0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.05％,发酵培养10d。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优香叶醇的浓度为0.02％(v/v)，桦褐孔菌醇的产量为27.89mg/L。
表13不同香叶醇添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000083
实施例14：不同香叶醇添加时间发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，在发酵的不同阶段添加0.02％(v/v)的香叶醇，添加时间分别为第4、5、6、7、8天，发酵培养10d。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优香叶醇的添加时间为第6天，桦褐孔菌醇的产量为42.02mg/L。
表14不同香叶醇添加时间发酵的结果
Figure BDA0002130041910000091
实施例15：不同外源因子角鲨烯添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，在第4天的时候添加不同浓度(v/v)的外源因子角鲨烯，角鲨烯的添加浓度分别为0.001％、0.003％、0.005％、0.01％、0.03％,发酵培养10d。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优角鲨烯的浓度为0.005％(v/v)，桦褐孔菌醇的产量为22.78mg/L。
表15不同角鲨烯添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000092
实施例16：不同柠檬烯添加量发酵生产桦褐孔菌醇
发酵培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆粉1.5g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L。
将实施例1中得到的处于对数生长期的桦褐孔菌(CFCC 83414)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度27℃转速160rpm条件下，在第4天的时候添加不同浓度(v/v)的外源因子柠檬烯，柠檬烯的添加浓度分别为0.001％、0.003％、0.005％、0.01％、0.03％,发酵培养10d。发酵结束后，测桦褐孔菌醇的含量。最优柠檬烯的浓度为0.005％(v/v)，桦褐孔菌醇的产量为18.76mg/L。
表16不同柠檬烯添加量发酵的结果
Figure BDA0002130041910000093
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法，其特征在于，将桦褐孔菌接种至发酵培养基中进行发酵，并在发酵过程中添加外源因子；所述外源因子为香叶醇，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖20-50 g/L，玉米浆粉1.5-3g/L，硝酸钠1.5-3g/L，磷酸氢二钾0.3-1.5 g/L，硫酸镁0.3-1.5 g/L，氯化钙0.05-0.4 g/L，其中，玉米浆粉和硝酸钠的质量比为1：1；所述香叶醇按照体积分数为0.005-0.03%添加。
2.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，添加香叶醇的时间为发酵第4-8天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述桦褐孔菌是桦褐孔菌CFCC 83414。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种是接种桦褐孔菌种子液；所述种子液是以单菌落接种至种子培养基，24-32℃，130-200 rpm，培养3-7天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：葡萄糖20-60 g/L，大豆蛋白胨1-6 g/L，酵母浸粉1-6 g/L，七水硫酸镁0.3-2 g/L，磷酸二氢钾0.5-3 g/L，氯化钙0.01-0.4 g/L，pH自然。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种的接种量为5-25%，装液量为50-250mL，初始pH为5-9，种龄为3-7天。
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