CN105462862B

CN105462862B - 一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法

Info

Publication number: CN105462862B
Application number: CN201610053615.XA
Authority: CN
Inventors: 何国庆; 孙冰沁; 秦可欣; 陈浩
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: CN105462862A

Abstract

本发明公开了一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法，该方法包括将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养后，再接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵完成后，获得灵芝菌丝体；所述发酵培养基中以可溶性淀粉为碳源、以鱼蛋白胨为氮源，并在发酵培养基中添加油酸；所述可溶性淀粉的重量百分数为3～6％，鱼蛋白胨的重量百分数为0.5～1.5％，所述油酸的体积百分数为3～5％。本发明采用可溶性淀粉为碳源、鱼蛋白胨为氮源的培养基作为发酵培养基培养灵芝菌体，并在发酵过程中添加适量油酸，可大幅度提高灵芝菌丝中灵芝三萜的产量。

Description

一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)俗称灵芝草，是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属。作为一种传统的中药，己有几千年的应用历史。时至今天，灵芝仍然是一类很受欢迎的药品，被用于肝病、肾炎、高血脂、关节炎、神经衰弱、失眠、支气管炎、哮喘、胃溃疡、动脉硬化、癌症等。近二十年来国内外大量的研究结果证明了灵芝具有广泛的药理作用，如免疫调节，抗肿瘤，抗HIV病毒，抗心肌缺血，抗放射和抗化疗，抗缺氧和抗衰老作用，保肝作用等，并且对心脑血管疾病具有较高的药理活性，且毒性极低，这与中医药学以及现代医学对灵芝的疗效和毒副作用的认识是一致的。因而灵芝无论作为中药还是保健食品，都受到人们的极大欢迎。

灵芝含有多种活性成分，如多糖、三菇类化合物、核苷、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽、多种酶类等。灵芝传统的获取方法是通过野外采集或人工栽培，以子实体或孢子入药，但灵芝子实体生长周期长，工作强度大。相比之下，液体发酵具有发酵时间短、占地少、易于操作、所耗木材少等优点，更有利于菌丝的工业化生产。灵芝三萜是灵芝主要的生物活性成分之一，可以通过调整发酵培养基及培养条件从而使三萜产量达到最高。

与灵芝子实体和孢子粉相比，灵芝菌丝中所含的活性物质活性更高，并且液体发酵具有发酵时间短、所耗木材少等优点，更有利于菌丝的工业化生产。灵芝三萜是作为灵芝主要的生物活性成分，如何通过调整发酵培养基及培养条件使三萜产量达到最高，一直以来都是灵芝液体发酵的主要研究方向。而如何利用成本低廉、来源广泛的培养基质获得高含量三萜的灵芝菌丝体则是实现其工业化生产的重要前提。

授权公告号为CN101353689B发明专利文献公开了一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法，该方法使用灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌种，菌株保藏号为CCGMC 5.616，并通过如下步骤进行：

1)将灵芝菌种接种含有碳源、氮源、矿物元素成分的培养基，在温度为26～30℃、转速为130～180r/min条件下回转式深层发酵1～5天；培养基组成是以玉米粉、葡萄糖为碳源，以蛋白胨、豆饼粉为氮源，以KH₂PO₄和MgSO₄为矿物元素；培养基中玉米粉含量为5～10g/L、葡萄糖含量为25～40g/L；培养基中蛋白胨含量为3～5g/L、豆饼粉含量为2～4g/L；培养基中KH₂PO₄含量为1.5g/L、MgSO₄含量为0.75g/L；2)补加棕榈酸1.5-3.0g/L后，在温度为25～30℃、转速为100～180r/min条件下回转式深层发酵3～6天结束；3)从发酵液中提取灵芝三萜。

申请公布号为CN104017852A的发明专利申请文献公开了一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，该方法包括：取在斜面培养基中活化后的斜面菌丝体灵芝菌株，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于20～30℃、50～200r/min下培养7～14天，得到种子培养液；将培养好的种子培养液，按照5～15％的接种量接入发酵培养基中，接种后于20～30℃、50～200r/min下培养3～10天，在发酵培养过程中添加体积百分数为1％～5％的油酸，最终获得灵芝菌丝体，进而提取菌丝体中的灵芝三萜。

发明内容

本发明提供了一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法，该方法可大幅度提高灵芝菌丝体中灵芝三萜的产量。

一种高产三萜的灵芝菌丝体的培养方法，包括：将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养后，再接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵完成后，获得高产三萜的灵芝菌丝体；所述发酵培养基中以可溶性淀粉为碳源、以鱼蛋白胨为氮源，并在发酵培养基中添加油酸；所述可溶性淀粉的重量百分数为3～6％，鱼蛋白胨的重量百分数为0.5～1.5％，所述油酸的体积百分数为3～5％。

实验发现，以可溶性淀粉为碳源、以鱼蛋白胨为氮源能够提高灵芝菌丝体中灵芝三萜的产量；并且，向发酵培养基中添加油酸，可与可溶性淀粉产生协同作用，能够进一步促进灵芝三萜的产量。

作为优选，所述发酵培养基的pH值为4.5～6.5％。更优选，所述pH值为5.5。

进一步地，所述可溶性淀粉的重量百分数为3.4％，鱼蛋白胨的重量百分数为0.72％，所述油酸的体积百分数为4.38％。采用上述用量比例进行发酵培养，胞内灵芝三萜的产量可达到223.73±2.17mg/100mL。

以重量百分比计，所述发酵培养基为：可溶性淀粉3.4％，鱼蛋白胨0.72％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5。

作为优选，以体积百分数计，所述种子液的接种量为10～15％。

具体地，以重量百分比计，所述种子培养基为：PDB 3.5％，蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.3％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5。

作为优选，所述发酵培养的条件为：28℃下培养9天。种子培养的条件为：28℃下培养8天。

作为优选，所述发酵培养基在发酵起始时的装载量为75～100mL/250mL。

作为优选，所述油酸的添加时间为种子液接种时。在培养基中加入合适的油酸，在没有添加其它物质，没有额外能源消耗的条件下，可大幅度提高培养基中的溶解氧浓度和细胞膜的通透性，并且不会影响菌种的生产能力，改变了细胞与环境进行物质交换的过程，从而促进灵芝菌丝体的合成灵芝三萜。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用可溶性淀粉为碳源、鱼蛋白胨为氮源的培养基作为发酵培养基培养灵芝菌体，并在发酵过程中添加适量油酸，可大幅度提高灵芝菌丝体中灵芝三萜的产量。

(2)本发明简单有效，易于操作，可提高生产效率，有利于高产三萜灵芝菌丝的工业化生产。

附图说明

图1为不同种类碳源对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图2为可溶性淀粉浓度对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图3为不同种类氮源对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图4为鱼蛋白胨浓度对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图5为不同培养基pH对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图6为不同油酸添加量与添加时间对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图7为可溶性淀粉与油酸添加量交互作用对灵芝液体发酵胞内三萜产量影响的等高线图。

图8为可溶性淀粉与油酸添加量交互作用对灵芝液体发酵胞内三萜产量影响的曲面图。

图9为装液量(通气量)对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图10为接种量对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

图11为发酵天数对灵芝液体发酵胞内三萜产量与菌丝生物量的影响。

具体实施方式

实施例1

1、培养基的配制

斜面培养基：PDA 4.5％，琼脂1.7％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％。

种子培养基：PDB 3.5％，蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.3％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5。

发酵培养基：可溶性淀粉3.4％，鱼蛋白胨0.72％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁0.005％，pH 5.5。

2、菌株培养方法

取经试管斜面培养的菌株，挑取4-5块1cm²菌丝块接种到种子培养液中(250mL三角瓶，装液量100mL)，放置28℃摇床中，摇床转速180r/min，培养7天，供实验作种子用。然后按10％(v/v)接种量将种子液接种到发酵培养基，发酵培养基装在容量为250mL的锥形瓶中，每瓶内装100mL，并在发酵初期添加一定浓度的油酸，于28℃，180rpm培养9d。

3、菌丝生物量(Mycelia Biomass)的测定

将菌株按照上述培养方法进行发酵培养，发酵9天后，取适量菌丝加水混匀后进行抽滤，分离菌丝体和发酵液，再讲获得的菌丝体于60℃干燥至恒重，计算各菌株的生物量(以菌丝体干重g/100mL发酵液计)。

4、灵芝菌株液体发酵过程中胞内三萜产量的测定

采用超声波提取方法：将灵芝菌丝用95％(v/v)乙醇清洗，去除上面附着的油酸，离心，收集菌丝，再取适量菌丝按1g/50mL加入95％(v/v)乙醇并用细胞破碎仪破碎(1min×4)，于60℃，400W下提取1h，并重复一次，合并上清液，定容后待测。其三萜含量采用香草醛-高氯酸方法测定。

三萜产量(mg/100mL)＝每克菌丝胞内三萜含量(mg/g)×菌丝生物量(g/100mL)

香草醛-高氯酸测定方法：取待测样品溶液或样品稀释液0.1mL于试管中，70℃加热挥干溶剂，再加入5％(m/v)香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.5mL，混匀后于60℃水浴中保温20min，取出后置于冷水中10min，最后加入冰醋酸5mL，于550nm下测定吸光值。

5、灵芝液体发酵培养基的优化

(1)碳源筛选以及碳源浓度的影响

选取7种不同的碳源(葡萄糖，蔗糖，麦芽汁，玉米粉，乳糖，可溶性淀粉，土豆)以2％的浓度加入到液体发酵培养基中，且另取一组不加碳源作为对照。将灵芝发酵种子液按10％的接种量接种到发酵培养基中，并在接种当时(即发酵第0天)添加3％的油酸，于28℃，180rpm发酵6d，以胞内三萜产量、菌丝生物量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的碳源(图1)。

由图1可知，当碳源为可溶性淀粉时，灵芝液体发酵所得胞内三萜产量最高，可达到141.45±3.02mg/100mL，其生物量为2.773±0.12g/100mL；而当麦芽汁作为碳源时，灵芝发酵所得生物量最高，可达到2.796±0.09g/100mL，胞内三萜产量为124.38±4.45mg/100mL。由于胞内三萜产量为所需要的主要活性物质，其产量的高低直接影响灵芝菌丝的质量，因此，选取可溶性淀粉为灵芝液体发酵的碳源。

为了确定灵芝液体发酵适宜的可溶性淀粉浓度，选取7种不同浓度(以重量百分数计，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％)，以胞内三萜产量、菌丝生物量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的可溶性淀粉浓度(图2)。由图2可得，随着可溶性淀粉浓度的增加，胞内三萜产量有所提高，当可溶性淀粉浓度为4％时，胞内三萜产量达到最高，可达173.16±3.92mg/100mL，但当可溶性淀粉浓度为5％时，胞内三萜产量降至165.52±3.87mg/100mL。因所需的主要活性物质为胞内三萜，且菌丝生物量的变化无明显规律，所以根据胞内三萜产量变化，选取4％可溶性淀粉作为碳源浓度。

(2)氮源筛选以及氮源浓度的影响

选取7种不同的氮源(豆粕汁，牛肉膏，酵母粉，麸皮汁，鱼蛋白胨，牛骨蛋白胨，硫酸铵)以0.5％的浓度加入到液体发酵培养基中，液体培养基的碳源浓度为上一部分筛选后的浓度。将灵芝发酵种子液按10％的接种量接种到发酵培养基中，并在接种当时(即发酵第0天)添加3％的油酸，于28℃，180rpm发酵6d，以胞内三萜产量、菌丝生物量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的氮源(图3)。

由图3可知，当氮源为鱼蛋白胨时，灵芝液体发酵所得胞内三萜产量最高，可达到126.92±2.42mg/100mL，其生物量为2.629±0.03g/100mL；而当麸皮汁作为氮源时，灵芝发酵所得生物量最高，可达到2.931±0.07g/100mL，胞内三萜产量为87.84±1.60mg/100mL。由于胞内三萜产量为所需要的主要活性物质，其产量的高低直接影响灵芝菌丝的质量，因此，选取鱼蛋白胨为灵芝液体发酵的氮源。

为了确定灵芝液体发酵适宜的鱼蛋白胨浓度，选取7种不同浓度(以重量百分数计，0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％)，以胞内三萜产量、菌丝生物量作为检测指标，筛选适宜灵芝液体发酵的可溶性淀粉浓度(图4)。由图4可得，随着鱼蛋白胨浓度的增加，胞内三萜产量有所提高，当鱼蛋白胨浓度为1％时，胞内三萜产量达到最高，可达195.88±2.17mg/100mL，但当鱼蛋白胨浓度为1.5％时，胞内三萜产量降至161.85±1.57mg/100mL。当鱼蛋白胨浓度为1.5％时，菌丝生物量达到最高，可达3.447±0.05g/100mL，但当鱼蛋白胨浓度为2％时，菌丝生物量降至3.268±0.04g/100mL。因所需的主要活性物质为胞内三萜，所以选取1％鱼蛋白胨作为氮源浓度。

(3)pH对灵芝液体发酵的影响

将液体发酵培养基的pH调至4.5-7.5，于28℃，180rpm发酵6d，以胞内三萜产量、菌丝生物量作为检测指标，筛选灵芝液体发酵适宜的pH值(图5)。由图5可知，当发酵培养基的pH为5.5时，胞内三萜产量达到最高，可达206.35±2.85mg/100mL，而当pH增大或是减小时，胞内三萜产量降低。当pH为5时，菌丝生物量达到最高，可达3.312±0.04g/100mL。因所需的主要活性物质为胞内三萜，所以选取5.5为灵芝液体发酵培养基的pH。

(4)油酸添加量与添加时间的影响

在培养基中加入合适的油酸，可大幅提高培养基中的溶解氧浓度和细胞膜的通透性，并且不会影响菌种的生产能力，改变了细胞与环境进行物质交换的过程，从而促进灵芝菌丝体的发酵。为了确定灵芝液体发酵过程中油酸最佳的添加时间与添加量，选取3个不同的添加时间：接种当时(即发酵第0天)，发酵第1天，发酵第2天，选取5种不同浓度(以体积百分数计，1％，2％，3％，4％，5％)，以胞内三萜产量、菌丝生物量作为检测指标，筛选油酸最佳的添加时间与添加量(图6)。

由图6可得，发酵培养第0天添加油酸最具优势，胞内三萜产量与菌丝生物量均高于第1、2天，因此，选取发酵培养第0天为油酸添加时间。而随着油酸添加量的增加，胞内三萜产量有所提高，当第0天油酸添加量为4％时，胞内三萜产量达到最高，可达198.61±2.62mg/100mL，但当油酸添加量继续增加时，胞内三萜产量下降。菌丝生物量随油酸添加量的增加而增加。选取4％作为油酸添加量。

(5)响应面法优化灵芝液体发酵培养基

采用central composite design(CCD)优化灵芝液体发酵培养基，各变量的最低、最高水平分别为：可溶性淀粉，3％、5％；鱼蛋白胨，0.5％、1.5％；油酸添加量，3％、5％(表1)，CCD实验设计及结果见表2。

表1 CCD实验因素水平表

表2 CCD实验设计及结果

由表2可知，对于胞内三萜产量，模型项Prob＞F值为0.0004≤0.01，显著，lack offit值为0.4676≥0.05，不显著；均表明回归方程关系显著，且方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，实验设计能够很好的反映实验优化。胞内三萜产量(Y)的多项式回归方程如下：

Y＝211.30-11.60A-15.67B+6.82C+3.73AB-19.18AC-3.45BC-17.39A²-17.00B²-26.95C²

固定其中一个变量，研究其他2个变量的交互作用对各响应值的影响。可溶性淀粉与鱼蛋白胨、鱼蛋白胨与油酸添加量的交互作用对胞内三萜的产量影响并不显著。可溶性淀粉与油酸添加量的交互作用影响较为显著，其对胞内三萜产量影响的等高线图和曲面图分别如图7、8所示。由图7、8可知，随着可溶性淀粉浓度和油酸添加量的增加，胞内三萜产量会先随之增加，再随之降低。

实验模型预测：当以重量百分数计，可溶性淀粉浓度为3.40％，鱼蛋白胨浓度为0.72％，油酸添加量为4.38％时，胞内三萜产量可达到220.502mg/100mL。将预测结果进行验证实验(3次重复)，所得胞内三萜产量为223.73±2.17mg/100mL，与预测值接近，表明该模型对于优化灵芝发酵培养基具有可行性。因此，将可溶性淀粉3.4％，鱼蛋白胨0.72％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5，并在发酵培养第0天添加4.38％的油酸作为灵芝液体发酵培养基的条件。

6、灵芝液体发酵条件的优化

将灵芝菌株于经过响应面优化得到的培养基(可溶性淀粉3.4％，鱼蛋白胨0.72％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5)中进行发酵，并在发酵培养第0天添加4.38％的油酸，以胞内三萜产量、菌丝生物量为检测指标，筛选合适的发酵条件，图9、10、11分别表示装液量(通气量)、接种量、发酵天数对灵芝液体发酵的影响。

由图9可得，随着装液量的增加，胞内三萜产量随之增加，当装液量为100mL/250mL时，胞内三萜产量达到最高，可达217.68±2.23mg/100mL，但当装液量继续增加时，胞内三萜产量下降。菌丝生物量随装液量的增加而降低。因所需的主要活性物质为胞内三萜，综合考虑，选取装液量为100mL/250mL。

由图10可知，当接种量从5％(v/v)增加到10％(v/v)时，胞内三萜产量随接种的增加而增加，而当接种量从10％(v/v)增加到15％(v/v)时，胞内三萜产量趋于平稳并略有下降。菌丝生物量在接种量为7.5％(v/v)时达到最大。因所需的主要活性物质为胞内三萜，以及成本问题，选取得接种量为10％(v/v)，胞内三萜产量可达241.01±2.42mg/100mL。

由图11可知，随着发酵天数的增加，各指标均随之增加。胞内三萜产量在发酵9d时达到最高，可达287.67±3.77mg/100mL，此时菌丝生物量达到4.755±0.041g/100mL；而菌丝生物量在发酵10d时达到最大，为4.93±0.043g/100mL，其胞内三萜产量达到282.75±3.76mg/100mL。综合考虑，选择发酵时间为9d。

Claims

1.一种生产三萜的灵芝菌丝体的培养方法，其特征在于，将灵芝菌丝接种到种子培养基中培养，获得种子液；将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，发酵完成后，获得灵芝菌丝体；种子液接种时往发酵培养基中添加体积百分数为4.38％的油酸；

所述发酵培养基为：可溶性淀粉3.4％，鱼蛋白胨0.72％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5；所述种子培养基为：PDB 3.5％，蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.3％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.5；所述发酵培养基在发酵起始时的装载量为100mL/250mL。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：28℃下培养9天。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，种子培养的条件为：28℃下培养8天。