CN104017852A - 一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法 - Google Patents
一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，包括：(1)取斜面菌丝体灵芝菌株，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后培养7-14天，得到种子培养液；(2)将培养好的种子培养液，按照5％-15％的接种量接入发酵培养基中，接种后培养3-10天，在发酵培养过程中添加1vol％-5vol％的油酸，最终获得灵芝菌丝体，进而提取菌丝体中的灵芝三萜。本发明工艺简单、有效，在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物产量的目的，缩短了发酵周期，提高了生产效率，且对其它的真菌菌丝体发酵过程优化具有一定的指导和启迪意义。
Description
技术领域
本发明属于灵芝三萜发酵领域，特别涉及一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲、多孔菌科、灵芝菌属真菌，是我国最著名的高等药用真菌。灵芝的关键药效成分是灵芝多糖和灵芝三萜。其中灵芝三萜具有消炎止痛、镇静、解毒、保肝、抗艾滋病病毒、抗肿瘤、保肝作用，抑制组胺释放、血管紧张素转化酶等功能，是灵芝发挥药效的重要物质基础。
现阶段，灵芝菌体及其关键药效成分的产量成为阻碍灵芝产品应用的瓶颈。由于液体深层发酵技术生产灵芝具有生产周期短等特点，目前已成为获取灵芝及其活性物质的最有效方法。近年来，灵芝的液体发酵技术取得了很大进展，但如何进一步提高灵芝菌丝体或关键药效成分的产量以降低生产成本、提高经济效益，己成为加快灵芝产品产业化进程函待解决的问题。
目前研究表明，茉莉酸甲酯、苯巴比妥、阿司匹林、铜离子和钙离子都能够诱导灵芝三萜合成。这些工作为研究灵芝三萜生物合成的调控机制提供了很好的材料和表型。但是灵芝三萜发酵产品作为食品和药品，必须考虑其发酵的安全性和经济性。茉莉酸甲酯本身价格昂贵，苯巴比妥是一种普遍性中枢神经抑制药，阿司匹林是一种解热镇痛药，铜离子是一种重金属。
在灵芝三萜发酵实际生产中，需要一种具有食品安全级别的，价格低廉的诱导物，而油酸作为一种单不饱和脂肪酸，存在于动植物体内，具有食用安全性并且价格较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，该方法工艺简单、有效，可应用于灵芝三萜的工业化生产中，在工业化生产中具有应用价值，且对其它的真菌菌丝体发酵过程优化具有一定的指导和启迪意义。
本发明的一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，包括：
(1)取在斜面培养基中活化后的斜面菌丝体灵芝菌株，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于20-30℃、50-200r/min下培养7-14天，得到种子培养液；
(2)将培养好的种子培养液，按照5％-15％的接种量接入发酵培养基中，接种后于20-30℃、50-200r/min下培养3-10天，在发酵培养过程中添加1vol％-5vol％(相对于培养基)的油酸，最终获得灵芝菌丝体，进而提取菌丝体中的灵芝三萜。
所述步骤(1)中的斜面培养基为：39g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L去离子水中灭菌后即得。
所述步骤(1)中的灵芝菌株为沪农灵芝1号Ganoderma lucidum，已在[上海农业学报2013年第29卷第5期67-69]公开。
所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：豆饼粉20g/L，无水葡萄糖25g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，自然pH。
所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：豆饼粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸镁2.25g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH。
所述步骤(2)中发酵培养第0天(第0天指接种时同时加入油酸)、第1天、第2天或第3天添加油酸。在种子培养基中加入油酸，一方面提高细胞膜的通透性，另一方面提高供体能量，增加系统整体的供氧能力。
有益效果
(1)本发明通过在培养基中加入合适的油酸，在没有添加其它物质，没有额外能源消耗的条件下，大幅提高了培养基中的溶解氧浓度和细胞膜的通透性，并且不会影响菌种的生产能力，改变了细胞与环境进行物质交换的过程，从而促进灵芝菌丝体的发酵；
(2)本发明工艺简单、有效，可应用于灵芝三萜的工业化生产中，在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物产量的目的，缩短了发酵周期，提高了生产效率，且对其它的真菌菌丝体发酵过程优化具有一定的指导和启迪意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面菌丝体沪农灵芝1号菌株，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(豆饼粉20g/L，无水葡萄糖25g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养14天；
(2)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(豆饼粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸镁2.25g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下培养10天获得灵芝三萜。
步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第0天添加油酸的方法；油酸的添加浓度为3vol％。
测定灵芝三萜含量：将干燥的灵芝菌丝体研磨成粉末后，1g菌丝体加入50mL95％的乙醇中浸提14小时后过滤，上清液即为待测样品溶液。加待测样品溶液0.1mL于试管中(设三个重复)，再加5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.5mL，充分混匀后，在60℃水浴中保温20min，取出后立即冷却至室温，然后再加入冰醋酸5mL摇匀后在550nm处测定样品的吸光度，样品的三萜含量根据标准曲线上计算可得。采用该方法测得灵芝三萜的含量为5.27mg/100mg，与对照(不添加油酸)的1.50mg/100mg相比，提高了2.51倍。
实施例2
(1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面菌丝体沪农灵芝1号菌株，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(豆饼粉20g/L，无水葡萄糖25g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养14天；
(2)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(豆饼粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸镁2.25g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下培养10天获得灵芝三萜。
步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第1天添加油酸的方法；油酸的添加浓度为3vol％。
测定灵芝三萜含量：测定方法同实施例1。采用该方法测得灵芝三萜的含量为3.63mg/100mg，与对照(不添加油酸)的1.50mg/100mg相比，提高了1.42倍。
实施例3
(1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面菌丝体沪农灵芝1号菌株，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(豆饼粉20g/L，无水葡萄糖25g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养14天；
(2)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(豆饼粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸镁2.25g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下培养10天获得灵芝三萜。
步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第2天添加油酸的方法；油酸的添加浓度为3vol％。
测定灵芝三萜含量：测定方法同实施例1。采用该方法测得灵芝三萜的含量为1.53mg/100mg，与对照(不添加油酸)的1.50mg/100mg相比，提高了0.02倍。
Claims (6)
1.一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，包括：
(1)取在斜面培养基中活化后的斜面菌丝体灵芝菌株，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于20-30℃、50-200r/min下培养7-14天，得到种子培养液；
(2)将培养好的种子培养液，按照5％-15％的接种量接入发酵培养基中，接种后于20-30℃、50-200r/min下培养3-10天，在发酵培养过程中添加1vol％-5vol％的油酸，最终获得灵芝菌丝体，进而提取菌丝体中的灵芝三萜。
2.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的斜面培养基为：39g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L去离子水中灭菌后即得。
3.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的灵芝菌株为沪农灵芝1号Ganoderma lucidum。
4.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：豆饼粉20g/L，无水葡萄糖25g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，自然pH。
5.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：豆饼粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸镁2.25g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH。
6.根据权利要求1所述的一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵培养第0天、第1天、第2天或第3天添加油酸。
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