CN105506049A - 一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：扩大培养阶段，按照质量比例0.01-5％向培养液中添加木材降解物，培养时间1-6天。本发明提供的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，在灵芝菌丝体液体发酵时添加微晶纤维素来诱导灵芝产生更多的胞内灵芝三萜。所使用的诱导剂微晶纤维素安全并且价格低廉，可显著提高胞内灵芝三萜的含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法。
背景技术
灵芝(Ganodermalucidum)是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属大型药用真菌，在我国已有数千年的应用历史。现代科学已经证实灵芝的化学成分有多糖类、三萜类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃类、氨基酸类等，其中最重要的药用成分是灵芝三萜类，具有抗肿瘤、保肝、调节免疫力、降血糖等作用。提高灵芝三萜含量对于灵芝的广泛应用具有重要作用。
目前研究表明，茉莉酸甲酯、乙酸、苯巴比妥、咪康唑、阿司匹林、铜离子、锰离子等能够诱导灵芝三萜合成。这些工作为研究灵芝三萜生物合成的调控机制提供了很好的材料和表型。但是考虑到灵芝作为一种药食同源类中药，如果想要促进其在医学界广泛使用的话，必须考虑到发酵的安全性和经济性。茉莉酸甲酯作为一种植物激素，因存在健康安全隐患而尚未被实际应用；苯巴比妥和咪康唑是中枢神经抑制药，阿司匹林是一种解热镇痛药，这些药物可能的残留而对健康人产生不良影响；铜离子和锰离子是重金属，可能引起人体中毒。因此，有必要开发效果更加理想的发酵方法和条件，提高灵芝在菌丝体阶段三萜类化合物含量。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其目的在于通过天然的木材降解物诱导灵芝菌丝体合成灵芝三萜，从而提高其产量，由此解决现有技术提高灵芝三萜含量可能存在不良残留物的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
扩大培养阶段，按照质量比例0.01-5％向培养液中添加木材降解物，培养时间1-6天。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述木材降解物，含有微晶纤维素，其含量占培养液的0.01％至5％。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述木材降解物，含有D-半乳糖，其含量占培养液的0.25％至1％。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述扩大培养阶段为灵芝液体菌种培养开始24至72小时后。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述灵芝液体菌种培养所用的培养基包括：葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，磷酸二氢钾0.883克/升，七水合硫酸镁0.5克/升，维生素B10.05克/升。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述灵芝液体菌种培养接种量5％-10％，培养条件：转速120-150r/min摇瓶培养。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述灵芝液体菌种培养接种用种子液按照如下方法获取：
一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120-150r/min，培养5天获得一级种子液；
二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120-150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L，pH为5.5；所述灵芝发酵培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L，pH为5.5。。
优选地，所述提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其所述灵芝种子按照如下方法获得：
将灵芝菌种用PDA液体培养基，在温度28-30℃且转速120-150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子，所述PDA液体培养基每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明的目的是提供一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，在灵芝菌丝体液体发酵时添加微晶纤维素来诱导灵芝产生更多的胞内灵芝三萜。所使用的诱导剂微晶纤维素安全并且价格低廉，可显著提高胞内灵芝三萜的含量。
附图说明
图1是本发明实施例1的测定结果；
图2是本发明实施例2的测定结果；
图3是本发明实施例3的测定结果；
图4是本发明实施例4的测定结果；
图5是本发明实施例5的测定结果；
图6是本发明实施例6的测定结果；
图7是本发明实施例7的测定结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120-150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120-150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120-150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％-10％，在温度28-30℃，转速120-150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养0至120小时后，按照质量比例0.01-5％向培养液中添加木材降解物，培养1-6天。
所述木材降解物，含有以下成分中至少一种：
微晶纤维素，其含量占培养液的0.5％至3.5％；D-半乳糖，其含量占培养液的0.25％至1％；D-鼠李糖，0.01％-1％。
优选地，按照质量比例2％向培养液中添加乳化剂，如2wt％的吐温-20，可有效提高最终灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量。
以下为实施例：
本发明实施例采用的灵芝菌种，来源于国家普通微生物菌种保藏中心，菌种保藏号CGMCC5.0026。
实施例1
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养0、24、72、120小时后，按照质量比例1.5％向培养液中添加微晶纤维素，培养168、144、96、48h。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表1和图1。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表1。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体包内灵芝三萜含量最高可提高为85.96％。
表1
实施例2
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养72小时后，按照质量比例0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％向培养液中添加微晶纤维素，培养4天。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表2及图2。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表2。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体包内灵芝三萜含量最高可提高为120.7％。
表2
实施例3
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养72小时后，按照质量比例0.5％、1.5％、2.5％向培养液中添加微晶纤维素，培养4天。
按照质量比例2％向培养液中添加2wt％浓度的吐温-20。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表3及图3。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表3。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体胞内灵芝三萜含量最高可提高为147.72％。
表3
实施例4
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养0、24、72、120小时后，按照质量比例0.5％向培养液中D-半乳糖，培养168、144、96、48天。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表4及图4。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表4。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体胞内灵芝三萜含量最高可提高为79.30％。
表4
实施例5
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养72小时后，按照质量比例0.25％、0.5％、1.0％向培养液中添加D-半乳糖，培养4天。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表5及图5。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表5。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体胞内灵芝三萜含量最高可提高为59％。
表5
实施例6
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养72小时后，按照质量比例1.5％+0.25％、0.75％+0.5％、1.5％+0.5％向培养液中添加微晶纤维素和D-半乳糖，培养4天。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表6及图6。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表6。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体胞内灵芝三萜含量最高可提高为78.96％。
表6
实施例7
一种提高灵芝菌丝体液体发酵的包内灵芝三萜含量的方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将灵芝菌种用PDA液体培养基在温度28-30℃且转速120至150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子。所述PDA液体培养基，每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
(2)一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养5天获得一级种子液。所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(3)二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120至150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。所述灵芝中期培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L。
(4)灵芝液体发酵培养：向CYM培养基中接种灵芝液体菌种(3)，接种量5％至10％，在温度28-30℃，转速120至150r/min，进行灵芝液体发酵培养发酵，使灵芝菌丝体迅速生长繁殖。所述CYM培养基的配方为：葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克，用蒸馏水定容至1升，115℃灭菌25-40分钟。
(5)扩大培养阶段：在灵芝液体菌种培养72小时后，按照质量比例1.5％+0.25％、0.75％+0.5％、1.5％+0.5％向培养液中添加微晶纤维素和D-半乳糖，培养4天。
按照质量比例2％向培养液中添加2wt％浓度的吐温-20。
经国家药典对灵芝三萜测定方法测试：扩大培养阶段发酵结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表7及图7。与比较例相比含量增加明显，灵芝三萜含量增加百分比见表7。按照上述方法培养的提高灵芝菌丝体胞内灵芝三萜含量最高可提高为97.60％。
表7
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
扩大培养阶段，按照质量比例0.01-5％向培养液中添加木材降解物，培养时间1-6天。
2.如权利要求1所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述木材降解物，含有微晶纤维素，其含量占培养液的0.01％至5％。
3.如权利要求1所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述木材降解物，含有D-半乳糖，其含量占培养液的0.25％至1％。
4.如权利要求1所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述扩大培养阶段为灵芝液体菌种培养开始24至72小时后。
5.如权利要求4所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述灵芝液体菌种培养所用的培养基包括：葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，磷酸二氢钾0.883克/升，七水合硫酸镁0.5克/升，维生素B10.05克/升。
6.如权利要求4所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述灵芝液体菌种培养接种量5％-10％，培养条件：转速120-150r/min摇瓶培养。
7.如权利要求4所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述灵芝液体菌种培养接种用种子液按照如下方法获取：
一级种子培养：按照体积比1:5向灵芝种子培养基中接种灵芝菌丝体，在温度28-30℃，转速120-150r/min，培养5天获得一级种子液；
二级种子培养，按照体积比1:10向灵芝中期培养基中接种一级种子液在温度28-30℃，转速120-150r/min，培养2天获得所述灵芝液体菌种培养接种用种子液。
8.如权利要求7所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述灵芝种子培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L，pH为5.5；所述灵芝发酵培养基含有：葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氢钾0.883g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、以及维生素B10.05g/L，pH为5.5。。
9.如权利要求7所述的提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法，其特征在于，所述灵芝种子按照如下方法获得：
将灵芝菌种用PDA液体培养基，在温度28-30℃且转速120-150r/min下，活化7天，获得所述灵芝种子，所述PDA液体培养基每升含有：马铃薯浸提液1L、葡萄糖20g、以及琼脂15g。
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