CN103060210B - 多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用，首先，采用低能离子N+为诱变源，对HansenulapolymorphaDL-1进行诱变处理，获得了一株GSH高产菌株（DL-18），37℃，180r/min，摇瓶发酵42h，终产物中DCW为7.04g/L及GSH总量为420.46mg/L，分别比原始菌株提高1.73及1.94倍。传代培养检测DL-18的遗传稳定性，培养八代，GSH含量变化不显著，说明该菌株遗传稳定性高。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种低能离子诱变多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用。
背景技术
谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一种广泛存在于生物体内的活性三肽，含有γ-谷氨酰基和巯基，可参与多种生物学反应，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境具有重要作用。由于GSH具有解毒，抗氧化和防衰老等重要生理功能，在临床，医药，食品加工以及化妆品等领域具有广阔的应用前景。
多年来，国外对GSH的生物合成研究较多，并将基因工程菌株应用于GSH的生产，目前其GSH的产量基本垄断中国市场。与国外相比，国内对GSH生物合成研究甚少、起步也较晚，并且用于生产GSH菌种的发酵水平低，生产设备及产品的后续提取工艺落后，产品收率低，这是目前高效发酵生产GSH的主要瓶颈之一，也是影响企业经济效益的最根本因素。为解决上述问题，首先迫切需要选育出发酵生产GSH水平高的突变菌株
目前，发酵GSH所用菌种最为常见的是酵母菌，其中酿酒酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属和裂殖酵母属胞内谷胱甘肽含量较高。多形汉逊酵母（H.polymorphaDL-1）是一种耐热酵母，最高生长温度达49℃，其具有如下优点如生长、分裂速度较快，生存力强，易于高密度发酵培养，能在廉价的合成或半合成培养基上高密度生长。这不仅可以缩短发酵时间，降低对发酵设备的制冷要求，而且可以减少大规模培养时污染的风险。但野生型多形汉逊酵母细胞中GSH的含量并不高。
20世纪90年代，低能离子注入技术逐渐应用于工业微生物选育，与常规诱变育种方法如紫外线、X射线、γ射线以及亚硝基胍等方法相比，低能离子注入技术表现出对靶物质损伤小，技术操作简单，突变频率高，突变谱广等优点。目前，利用离子注入进行微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用，并取得了显著的经济效益和社会效益。同时，以微生物为实验对象进一步对离子注入的诱变机理进行研究，不仅可以指导微生物菌种改良，也可以深入地解析注入离子与生物体的作用机制，为离子注入的广泛应用提供理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母突变菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的应用，该突变菌株具有耐高温、生存能力强，易培养等优点，是一种GSH高产菌株。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种多形汉逊酵母突变菌株，该菌株的命名为HansenulapolymorphaDL-18，所述菌株保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6642。
所述突变菌株的诱变方法为低能离子辐照方法。
所述低能离子辐照的出发菌株为多形汉逊酵母ATCC No.26012。
所述低能离子辐照采用低能N+作为诱变源，最佳注入剂量为1.5×1016~2.5×1016ions/cm2，最佳注入能量为15~25KeV。
所述突变菌株的抗性筛选培养基为添加Zn2+的YPD培养基，Zn2+的添加浓度为800~1500mg/L。
上述多形汉逊酵母突变菌株在谷胱甘肽生物合成中的应用。
所述生物合成为发酵培养，发酵培养过程中首先于40～49℃培养10～16h，然后将培养温度降低为30～40℃继续培养36～40h。
本发明诱变GSH高产菌株的方法，主要依据低能离子注入诱导受体细胞突变原理，对H.polymorphaDL-1进行诱变。首先，将保存的菌株在37℃活化8-10h后，经种子培养，取一定量处于对数生长期的种子，通过血球计数板计数确定稀释倍数，使菌体浓度为1.0×107CFU/ml。其次，制作菌膜，无菌风吹干后用离子束生物工程改性设备进行离子注入，接着在恒温培养箱中37℃温浴两小时后，接种于YPD培养基，37℃培养72h。通过实验设计确定最佳的离子注入剂量及能量。最后，通过Zn2+抗性筛选GSH高产菌株，并进行传代培养检测其遗传稳定性，收获细胞后测定胞内、发酵液中GSH含量及发酵液中残留糖量。
本发明筛选获得了一种高产GSH菌株，命名为HansenulapolymorphaDL-18，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所），保藏日期为2012年9月29日；保藏编号为CGMCC No.6642；分类命名为Hansenulapolymorpha。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明获得的多形汉逊酵母突变菌株为GSH高产菌株，命名为HansenulapolymorphaDL-18，GSH生产能力比出发菌株提高1.56倍，37℃、180r/min摇瓶发酵42h，GSH总量达337.16mg/L；并且该突变菌株耐高温、分裂速度较快，生存力强，易于高密度发酵，可大幅降低GSH的生产成本，缩短发酵周期，具有明显的经济效益，为完善GSH的研究提供试验和理论依据，为大规模生产GSH提供了遗传稳定的工程菌，降低GSH的生产成本、缩短发酵时间，为解决GSH供应不足等问题提供新思路。
进一步，本发明提供了一种新的GSH高产菌株诱变方法，以H.polymorphaDL-1为材料进一步对离子注入技术的诱变机理进行研究；该技术操作简便，突变频率高，突变谱广以及污染小，且具有一定的重复性和方向性，突变株的生理损伤小、遗传稳定性高等优点。
进一步，本发明针对目前多数以酿酒酵母及假丝酵母为出发菌株的现状，利用低能离子注入技术对H.polymorphaDL-1进行诱变，筛选GSH高产菌株，弥补酿酒酵母及假丝酵母生产GSH过程不足，避免发酵过程中中间产物—乙醇的生成，简化生产工艺。
附图说明
图1为N+辐照H.polymorphaDL-1的存活曲线；
图2为N+辐照H.polymorphaDL-1的正突变率曲线；
图3为GSH产量（GSH yield）与细胞干重（DCW）随培养时间变化曲线，图3中(×)为DL-18的DCW，(▲)为DL-18的GSH总含量；(●)为H.polymorphaDL-1的DCW，(◇)为H.polymorphaDL-1的GSH总含量；
图4为传代培养突变菌株DL-18GSH产量（GSH yield）随传代次数变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
采用H.polymorphaDL-1为出发菌株（来源为ATCC No.26012），利用低能离子辐照注入技术对其进行诱变，通过选择性培养基筛选GSH高产突变菌株，并进行遗传稳定性试验。
（一）培养基及培养条件
YPD液体培养基的组成为：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，pH为6.5；
YPD斜面培养基的组成为：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂20g/L，pH为6.5；
ZnCl2抗性筛选培养基的组成为：YPD斜面培养基加ZnCl2，ZnCl2最适浓度为800～1500mg/L；
发酵培养基组成为：葡萄糖15.0g/L，硫酸铵5.0g/L，酵母膏2.0g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.25g/L，pH为6.5；
种子培养：从YPD斜面培养基中取一环酵母菌接种于30mLYPD液体培养基中进行培养得种子培养液，培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，培养时间为10~16h；
摇瓶发酵培养：将种子培养液按照10%(v/v)的接种量接种至装有30～50ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养，发酵培养过程中首先于40～49℃培养10～16h，然后将培养温度降低为30～40℃继续培养36～40h，发酵培养过程中摇床转速为110r/min。
（二）诱变以及筛选
（1）首先，将保存的菌株多形汉逊酵母（HpolymorphaDL-1，来源于ATCC No.26012）在37℃活化8-10h，活化后进行种子培养，然后取处于对数生长期的种子用保护液（葡萄糖0.5%+蔗糖0.5%）进行稀释得菌液，采用血球计数板计数法确定稀释倍数，
计算正确的稀释倍数使菌体浓度为1.0×107CFU/ml；
（2）菌膜制备：将0.1mL稀释后的菌液均匀涂布于直径为90mm的无菌平皿中央，然后用无菌风吹干使无菌平皿上形成菌膜；
（3）离子注入：将无菌平皿置于离子注入机真空靶室的无菌靶台上，将能量为15~25KeV、剂量为15.0~25.0×1015ions/cm2的N+在10-3Pa真空状态下以脉冲5s间隔10s方式注入菌膜，以真空条件下未注入N+的菌膜为对照；
关于致死率的确定
依据本发明所述方法，对H.polymorphaDL-1进行诱变处理，计算致死率。在制备注入平皿的同时，同样方法制备对照皿。两者同时进行吹干，同时放人靶室抽真空。放置时，将两皿叠加，注入皿在上，这样注入皿接受离子注入而对照皿不接受注入。注入结束后，用2mL无菌水将附于平皿上的菌体洗下，适当稀释后涂平皿。37℃培养72h后计数并计算出致死率。注入条件设计：注入能量20KeV；注入剂量1.10×1016,1.62×1016,2.13×1016,2.61×1016、3.10×1016ions/cm2。
实验结果：如图1所示，当注入剂量小于2.13×1016ions/cm2时致死率增大，同时当注入剂量超过2.13×1016ions/cm2时致死率急显著降低。研究表明致死率呈先增大后降低再增大的“马鞍”型。
（4）酵母菌温浴及洗脱：离子注入结束后，立即用2mLYPD液体培养基浸泡菌膜，37℃温浴2h后用无菌玻璃刮铲反复洗脱无菌平皿上的菌膜2min，获得洗脱液；未注入的对照菌膜也作同样处理；
（5）平板培养基培养：取0.1mL洗脱液均匀涂布于YPD平板培养基，倒置，37℃培养72h；
YPD平板培养基成分为：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母膏，2%琼脂。
（6）突变酵母菌的筛选：在无菌环境下，将经过YPD平板培养基培养后的酵母菌转接入ZnCl2抗性筛选培养基中于37℃培养72h得突变酵母菌；通过菌落计数确定最小ZnCl2浓度；
关于GSH高产菌株的筛选
宋道军等的研究表明存活率为20~30%时，可获得较多的阳性突变体。根据本发明所述方法对H.polymorphaDL-1进行诱变处理，诱变能量为20KeV，诱变剂量2.13×1016ions/cm2，在含1500mg/L ZnCl2抗性平板上进行GSH高产菌株筛选。结果如图2所示，从100株原始突变体中筛选出一株阳性突变体，命名为HansenulapolymorphaDL-18。
（7）YPD液体培养基传代培养：在无菌环境下，将突变酵母菌斜面分别转接入YPD液体培养基中，然后置于180r/min摇床中于37℃培养72h。
关于遗传稳定性试验
对DL-18进行传代培养，实验结果如图4所示，继代培养8代后GSH产量降低不显著，说明DL-18遗传稳定性高。
（三）GSH的提取：取适量发酵液于3000r/min离心10min后，上清液用于培养基中营养成分的测定，沉淀的新鲜湿酵母用蒸馏水洗涤3次，然后在浓度为40%（v/v）的乙醇水溶液中振荡处理2h使细胞破碎，振荡处理温度为30℃，然后于3000r/min下离心，将上清液稀释后用作GSH的分析检测的样品。
关于发酵
1）恒温发酵
挑选新鲜的DL-18接种于YPD液体培养基中，37℃培养14h后，将培养好的种子培养液按照10%(v/v)的接种量接种至装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养，37℃，180r/min，培养42h收获细胞后测定GSH产量、DCW及残糖量，结果如图3所示。终产物中DCW为6.24g/L，相对于对照提高9.09%，GSH产量为337.16mg/L，比对照提高1.94倍。
2）变温发酵
挑选新鲜的DL-18接种于YPD液体培养基中，37℃培养14h后，将种子培养液按照10%(v/v)的接种量接种至装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中进行发酵培养，发酵培养过程中摇床转速为110r/min，发酵培养过程中首先于45℃培养12h，然后将培养温度降低为37℃继续培养38h，终产物中DCW为7.04g/L，胞内GSH含量和GSH总量分别为59.72mg/g、420.46mg/L，相对于恒温发酵（37℃）分别提高了12.8%、29.4%和45.85%。相比于45℃恒温发酵，DCW、GSH总量和胞内GSH含量分别增提高了51.8%、92.67%和84.73%。结果表明温度可以改变影响菌体代谢，促使菌体大量合成GSH满足自身需求，以应对细胞内部环境的变化，减少细胞损伤；同时，细胞表面的通透性发生改变，致使胞外GSH含量增加。
（四）GSH测定：采用DTNB[5,5'-二硫双-(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法，在2mL体积的石英比色皿中顺序加入100μL6mmol/LDTNB，700μL0.3mmol/LNADPH和200μL稀释至适当浓度的样品，然后在室温下加入100μL5.0U/mL谷胱甘肽还原酶启动反应，测定412nm处反应体系的起始OD值以及1.5min后的OD值，根据OD值的变化速率与GSH浓度的关系计算出样品中GSH的含量。
（五）胞内GSH含量的计算：
（六）细胞干重：取25mL发酵液，经3000r/min下离心后再用蒸馏水洗涤2次，得到的湿酵母细胞在105℃下烘至恒重，然后计算出细胞干重（dry cellweight，DCW）。
（七）培养基残糖量测定:采用3,5-二硝基水杨酸法。
Claims (3)
1.一种多形汉逊酵母突变菌株，其特征在于：该菌株的命名为Hansenulapolymorpha DL-18，所述菌株保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6642。
2.如权利要求1所述多形汉逊酵母突变菌株在谷胱甘肽生物合成中的应用。
3.根据权利要求2所述多形汉逊酵母突变菌株在谷胱甘肽生物合成中的应用，其特征在于：所述生物合成为发酵培养，发酵培养过程中首先于40～49℃培养10～16h，然后将培养温度降低为30～40℃继续培养36～40h。
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