CN101407768B - 一株酿酒酵母突变菌株及其在发酵生产谷胱甘肽中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种新的可高产谷胱甘肽的酿酒酵母突变菌株，其分类命名为Saccharomyces cerevisiae Y518，以及该菌株所产的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因与谷胱甘肽合成酶基因、利用该菌株制备谷胱甘肽的应用。本发明包含了NTG连续诱导酿酒酵母出发菌株，经四次NTG诱变处理后，得到突变株酿酒酵母Y518。Saccharomyces cerevisiae Y518菌株产生的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶与谷胱甘肽合成酶发生了点突变，Saccharomyces cerevisiae Y518与原始菌株相比，有较强的耐酸性和pH耐受性，该突变株具有良好的稳定性，谷胱甘肽的产量显著提高。利用Saccharomyces cerevisiae Y518制备谷胱甘肽具有操作简单、稳定、重复性好，产量高等特点，实现了谷胱甘肽稳定、价廉，有利于规模化生产。

Description

一株酿酒酵母突变菌株及其在发酵生产谷胱甘肽中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酿酒酵母的突变菌株Saccharomycescerevisiae Y518，该突变菌株同时产γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，且两种酶的基因均发生了点突变，本发明还涉及利用突变菌株Saccharomyces cerevisiae Y518在发酵生产谷胱甘肽中的应用。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性三肽化合物，是一种天然的抗氧化剂。GSH首先于1888年被分离得到，并且于1921年被正式命名。GSH广泛存在于动物、植物和微生物等生物体内。目前已经有许多文献(Tateishi N.，1974.J.B.75：93～103；Issels R.，1988.Biochem Pharmacol.37：881～888；Meister.A.，1983.Ann.Rev.Biochem.52：711～760.)报道了GSH在动物细胞内的代谢和生理功能，以及其高产方法。在实际生产应用上，谷胱甘肽已经成功应用用于肝脏保护剂、毒素清除剂和眼药水生产中，它也将是功能性健康食品中的一个有前途的成分。

自20世纪六十年代起，采用生物法进行GSH的合成就日益引起广泛的关注。生物法合成GSH主要有两种途径：酶转化法和发酵法。其中发酵法又以采用廉价的糖类为原料，利用微生物体内物质的代谢途径来生产GSH的方法备受青睐。一般情况下，微生物细胞中GSH的含量不高(仅为干重的0.5％～1.0％)，过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境(Penninckx.M.J.2002.FEMS Yeast Research，2：295～305)。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量，而胞内GSH含量的提高通常是由菌种选育来实现的，现有技术主要公开了两种方法：一是采用常规诱变育种选育高产菌株(Ikeno Y..1977.JP52087296；Kono G..1977.JP52125687；詹谷宇等，1990.药学学报，25：494～499.)；二是利用遗传工程技术构建具有GSH合成酶活性的基因工程菌(ohtake Y..1988，Agric Biol Chem，52：2753～2762；Christine L.H..1989.EP300168；李华钟等.微生物学报，2001，41(1)：16～24.)。通过现有技术的育种方法已经获得了部分高产GSH的新突变株，而这些育种方法仍将成为菌种选育的重要策略。

由发酵法合成GSH的微生物中，利用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae发酵生产GSH，具有工艺简单，环境友好等特点，是GSH生产菌种中的热点研究菌种。由于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae产生的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶是合成GSH的关键协同酶，因此寻求高稳定性及高活性的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶突变菌并研究酶系基因序列特征，在提高菌种的GSH产量上具有重要意义。

现有技术中的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株普遍存在的问题是，其一，对酸耐受性较差，又因在发酵生产过程中GSH产生造成发酵液体系pH值降低，使菌株生长较差，生物量的积累量有限，从而使得微生物的发酵能力大大降低；其二，杂菌污染是酵母质量不稳定的重要原因之一，表现为酵母细胞数少，出芽率低，使培养液的pH妨碍了酵母生长。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一株高产谷胱甘肽酿酒酵母突变菌株，通过对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae出发菌株的诱变及选育，可得到GSH发酵产量高，突变后稳定性好，对发酵体系酸性耐受性强的新菌株，因此可通过该菌株发酵，高产谷胱甘肽。

为解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案实现：

一、本发明通过对出发菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的诱变及选育，得到一株酿酒酵母突变菌株，分类命名为Saccharomyces cerevisiae Y518，其保藏登记号为CCTCC NO：M208137。

(一)菌株的来源及诱变方法、形态特征：

通过亚硝基胍(NTG)对出发酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae(购自湖北安琪酵母股份有限公司)进行诱变处理，通过反复四次的诱变、初筛和复筛操作，得到一株高产GSH且传代稳定的突变株，将其命名为Saccharomyces cerevisiae Y518。

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518的形态特征为：化能异养；嗜温；趋酸；兼性厌氧。该突变菌株30℃培养3天，菌落乳白色，光滑，圆形，全缘，粘稠，2.4～3.7imm。细胞圆形，单个，(2-3.6)×(4-12)μm。无性繁殖方式为芽殖。

(二)本发明根据GeneBank中检索到的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因序列设计引物，克隆到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因。

本发明分离克隆到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该序列可用于构建γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因工程菌，也可用于相关底物的转化及该酶分子结构改造等研究。通过PCR法分离克隆了这一γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，DNA全序列分析结果表明，此序列为一个2037bp开放读码框，编码产生678个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。本γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶与原始菌株和数据库公布的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(SGD No.YGL 101C)相比基因序列存在六个碱基的差异，其特征在于核苷酸序列即¹⁸⁵A变为¹⁸⁵T、²⁸²C变为²⁸²T、¹¹²⁵C变为¹¹²⁵T、¹²⁶⁶C变为¹²⁶⁶T、¹⁷²²G变为¹⁷²²T、¹⁹⁴⁴A变为¹⁹⁴⁴G；其特征还在于所编码的氨基酸序列与数据库公布的氨基酸序列存在一个氨基酸的差异，即Glu 62变为Val 62。

本发明分离克隆到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518的谷胱甘肽合成酶的编码基因，它具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，该序列可用于构建谷胱甘肽合成酶的基因工程菌，也可用于相关底物的转化及该酶分子结构改造等研究。通过PCR法分离克隆了谷胱甘肽合成酶的基因，DNA全序列分析结果表明，此序列为一个1476bp的开放读码框，编码产生491个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。本谷胱甘肽合成酶与原始菌株和数据库公布的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(SGD No.YOL049W)相比，其特征在于核苷酸序列存在三个碱基的差异，即¹³⁵A变为¹³⁵G、¹⁶¹C变为¹⁶¹T、³⁰⁶A变为³⁰⁶C；其特征还在于所编码的氨基酸序列与原始菌株存在一个氨基酸的差异，即Pro54变为Leu54。

二、本发明所述的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518在制备谷胱甘肽中的应用。

利用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518菌株发酵生产谷胱甘肽时，可采用现有技术的所有利用酿酒酵母S.cerevisiae的发酵谷胱甘肽的方法，一般不必对特别限定。如发酵的碳源可选用糖类如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖；氮源可选用有机氮源或无机氮源，如有机氮源麦芽汁、酵母膏、蛋白胨，其中以麦芽汁效果最佳，如无机氮源可用硫酸铵、硝酸铵、氯化铵；作为前体物质氨基酸，可用L-半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸，以L-半胱氨酸效果更佳；发酵液pH可选自然pH，一般可为2～8，可为酸性2～5；菌种接种一般为5～20％，更好为10～15％；在150～300rpm转速搅动下，保持温度在20～40℃，发酵至谷胱甘肽有大量积累，发酵时间一般为18～72h，优选24～60h。

本发明的有益技术效果在于，通过诱变育种得到的新菌株酿酒酵母Saccharomycescerevisiae Y518的胞内GSH含量比出发菌株提高了576.92％，谷胱甘肽产量可达到311mg/L，进一步证实是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518中产生的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的核苷酸序列产生了定点正相突变，使得突变株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518不仅具有较好的pH耐受性，而且GSH产量也很高。本发明的又一效果在于Saccharomyces cerevisiae Y518的pH耐酸性增强，导致杂菌污染减少，提高了酵母的质量稳定性，表现为酵母细胞数多，出芽率高，使培养液的pH不妨碍酵母生长，进一步可提高GSH的产量。另外，利用本发明提供的高产酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518在谷胱甘肽制备中的应用，采用了廉价的麦芽汁作为基础培养基，大大的降低了生产成本，无需特殊的发酵方法，操作简单、稳定、重复性好，实现了谷胱甘肽稳定、价廉地生产，并且有利于规模化生产。

附图说明

图1测定GSH标准曲线

图2NTG浓度对突变率的影响

图3发酵液不同pH对GSH产量和细胞干重的影响

图4自动生物发酵罐分批培养过程中GSH形成曲线

本发明的微生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518的保藏日期为2008年9月25日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCCNO：M208137。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明对酿酒酵母S.cerevisiae发酵产物谷胱甘肽(GSH)的测定方法，并利用此方法作为筛选高产酿酒酵母突变株的评价基础。

GSH在试验条件下与四氧嘧啶作用的生成物在305nm有最高吸收峰，因此本法也称四氧嘧啶305法。半胱氨酸的巯基也能与四氧嘧啶发生反应，但其吸收峰在275nm，不会干扰GSH的测定。

绘制标准曲线：

(1)精确称取0.006g的GSH标准品，用40％乙醇溶解，定容至100mL，得到浓度为200umol/L的GSH标准液；

(2)分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL上述GSH标准液于试管中，补加去离子水至1.0mL，配制成浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、140、160、180μmol/L的GSH溶液。然后依次加入0.24mol/L、pH7.6的磷酸缓冲液3.5mL，0.1mol/L的甘氨酸溶液0.5mL，以及ALLOXAN试剂1.0mL，反应20min，注意反应时间需严格控制。

(3)以空白管校正零点，于305nm处测定吸光度值A，以浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制出的标准曲线，如附图1所示。

检测菌种时，将斜面菌体接入装有50mL基础培养基的500mL三角瓶中，30℃、180rpm培养24h。取10mL发酵液，6000rpm离心15min，水洗两次后得菌体，先用40％乙醇溶液于室温抽提菌体2h，离心，对应标准曲线测定产物含量即可。

实施例2

本实施例说明酿酒酵母S.cerevisiae Y518的诱变筛选方法。

1、菌体细胞悬液的制备

将购自湖北安琪酵母股份有限公司的活性干酿酒酵母接种活化，从活化后的斜面上挑取一环菌体接种到20mL基础培养基中，30℃，180rpm振荡培养18h后，将其全部接入装有200mL基础培养基的500mL三角瓶中30℃下，180rpm振荡培养，取出10mL培养液，6000rpm离心15min并用生理盐水洗涤两次后，加入0.1mol/L pH6.0的磷酸缓冲液，血球计数板调整细胞浓度为106cfu/mL。

2、亚硝基胍(NTG)诱变及最佳诱变剂浓度的确定

将菌悬液与10mg/mL NTG按照一定的比例混合，使NTG的终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，30℃下处理30min，加入2％Na₂S₂O₃0.5mL终止反应后，然后用已灭菌的0.1mol/L PH6.0的磷酸缓冲液进行逐级稀释，采用涂布分离法将菌液涂布到YEPD琼脂平皿上，30℃恒温培养48h。待平皿长出菌落后，进行菌落记数以未经过NTG处理的菌悬液制成的平皿为对照，并根据结果计算NTG诱变各浓度致死率。

致死率(％)＝(A-B)/A×100％

其中，A＝对照平皿上的单菌落数；

B＝NTG诱变各浓度平皿上的单菌落数。

同时吸取5mL稀释液接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃，180rpm振荡培养2h，进行中间培养，以消除表型延迟现象。然后把表型稳定的突变细胞培养液进行稀释，分离到平皿上，于30℃培养箱中培养48h，挑选菌落进行筛选。根据结果计算NTG诱变各浓度突变率，选取最高突变率所对应的亚硝基胍浓度为最佳诱变剂浓度。

正突变率(％)＝A/C×100％

负突变率(％)＝B/C×100％

其中，A＝平皿上菌株GSH含量高于原始菌株的个数；

      B＝平皿上菌株GSH含量低于原始菌株的个数；

      C＝NTG诱变各浓度平皿上单菌落数。

如附图2所示，确定最佳诱变剂亚硝基胍浓度为0.6mg/mL。

3、NTG的连续诱变及高产GSH突变菌株筛选

其中：

斜面培养基(YEPD)：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。(葡萄糖溶液采用单独高压灭菌后在加入到其它各种成分中)；

基础培养基：5°Be′的麦芽汁培养基，115℃灭菌20min。取一定量麦芽粉，加入4倍于麦芽粉重量的水，在60～65℃水浴锅中保温糖化，并用搅拌器不断搅拌，糖化4个小时后，取出用纱布过滤，除去残渣，每500g麦芽粉的麦芽汁加入一个鸡蛋的蛋清，煮沸半个小时，过滤，就可得清澈透明的麦芽汁。然后加水稀释成5°Be′的麦芽汁。

发酵培养基：即上述基础培养基。

初筛方法：

从平板挑取单菌落至斜面培养基，30℃培养2至3天后将菌株接入基础培养基，培养24h后测各菌株的GSH含量，选取GSH含量提高20％的高产菌株进行复筛。

复筛方法：将菌株从斜面接入基础培养基，30℃培养20h后，以10％接种量重新接入发酵培养基，每株3瓶，培养24h后测各菌株的干细胞内的GSH含量确定高产菌株。GSH产量可达311mg/L。

本发明采用在最佳诱变剂浓度下诱变处理出发菌株的方法，出发菌株经一次初筛和复筛后，即可获得高产菌株，然后以同样的方法诱变处理高产菌株，经初筛和复筛得到二次诱变后的高产菌株，如此诱变四次后筛选得到GSH含量最高的突变株并以该菌株作为发酵试验用菌株。

4、突变株稳定性考察

其中，生物量的测定方法为(以细胞干重计)：取20mL发酵液，6000rpm离心15min，水洗两次，弃上清。于105℃烘箱中烘干至恒重，总重与离心管重之差为菌体干重。

将诱变四次后筛选得到的GSH含量最高的突变株斜面连续传10代，谷胱甘肽产量仅下降了0.4％，生物量下降了1.3％，同时将该菌种低温保藏于4℃冰箱中，每月传一代，共传4代，谷胱甘肽产量仅下降0.3％，说明该突变株具有良好的稳定性。

该突变株经摇瓶发酵后其胞内GSH含量比出发菌株提高了576.92％，是一株性状稳定可深入开发研究的优良菌株，因此将其命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeY518。

5、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518的形态特征

该突变菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518的形态特征为：化能异养；嗜温；趋酸；兼性厌氧。该突变菌株30℃培养3天，菌落乳白色，光滑，圆形，全缘，粘稠，2.4～3.7mm。细胞圆形，单个，(2-3.6)×(4-12)μm。无性繁殖方式为芽殖。

实施例3

本实施例说明酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因和谷胱甘肽合成酶基因的分离克隆程序。

其中，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518菌株的基因组DNA的提取采用酚-氯仿抽提法。

1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的分离克隆：

取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518菌株的基因组DNA为模板，以下列核苷酸序列为引物扩增γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因：

引物1：5’-ATGGGACTCTTAGCTTTGG-3’

引物2：5’-TTAACATTTGCTTTCTATTGAAG-3’

PCR反应条件：95℃5min，一个循环；95℃30s，60℃30s，72℃2min，三十五个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR产物，与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)进行连接反应后得到重组质粒载体pMD18-T-gsh1。将重组质粒转化入感受态细胞DH5α(购自TAKARA公司)中，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12～16h筛选阳性克隆。将阳性克隆送交测序，得到γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因核苷酸序列，即SEQ IDNO：1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、谷胱甘肽合成酶基因的分离克隆：

取酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518菌株的基因组DNA为模板，以下列核苷酸序列为引物扩增谷胱甘肽合成酶基因：

引物1：5’-ATGGCACACTATCCACCTTC-3’

引物2：5’-CTAGTAAAGAATAATACTGTCC-3’

PCR反应条件：95℃5min，一个循环；95℃30s，60℃30s，72℃90s，三十五个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR产物，与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)进行连接反应后得到重组质粒载体pMD18-T-gsh1。将重组质粒转化入感受态细胞DH5α(购自TAKARA公司)中，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12-16h筛选阳性克隆。将阳性克隆送交测序得到谷胱甘肽合成酶基因序列，即SEQ ID NO.3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例4

本发明说明酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518菌株的pH耐受性。

其中，菌体干重的测定方法为：取5mL发酵液，6000rpm离心15min，水洗两次，弃上清，于105℃烘箱中烘干至恒重，总重与离心管重之差为菌体干重。

将发酵培养基pH分别调为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5。接入10％(v/v)的种子液，32℃，180rpm振荡培养24h。测定发酵液中GSH含量及细胞干重，结果见附图3。由附图3可见，当培养基pH值为3.5时，GSH产量和细胞干重都达到最大值，分别为310.37mg/L、17.03g/L。pH的改变使微生物细胞原生质膜的电荷发生改变，往往引起菌体代谢途径的改变，使代谢产物发生变化。在发酵过程中，随着菌体中间代谢的产生及向发酵液中释放，发酵液的pH会逐渐下降，如果pH降的太低，会抑制菌体的生长。适宜的初始pH值有利于酵母菌快速生长繁殖，使得在发酵液对菌体生长产生抑制之前，能获得足够多的生物量。

实施例5

本实施例说明酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y518在发酵制备GSH中的应用方法。

进行7.5升自动生物发酵罐(Bioflo 110发酵罐)分批培养，培养基组成为：葡萄糖38g、(NH₄)₂SO₄6.3g、L-cys·HC11.9g、谷氨酸5g、10°Be′的麦芽汁1000mL。发酵液初始pH值为3.5，温度为30℃，搅拌转速为140rpm，接种10％，培养到56h时，发酵液中GSH产量和细胞干重都达到最大值，如附图4。按上述方法测定发酵液中谷胱甘肽含量和细胞干重分别为310.6mg/L和17.55g/L。

序列表

<110>常熟理工学院

<120>一株酿酒酵母突变菌株及其在发酵生产谷胱甘肽中的应用

<130>cslg0811

<160>4

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>2037

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae Y518 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2034)

<400>1

<210>2

<211>678

<212>PRT

<213>Saccharomyces cerevisiaeY518 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

<400>2

<210>3

<211>1476

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae Y518谷胱甘肽合成酶

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1473)

<400>3

<210>4

<211>491

<212>PRT

<213>Saccharomyces cerevisiae Y518谷胱甘肽合成酶

<400>4

Claims (2)

1.一株酿酒酵母突变菌株，其分类命名为Saccharomyces cerevisiae Y518，其保藏登记号为CCTCC NO：M208137。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母突变菌株Saccharomyces cerevisiae Y518在发酵生产谷胱甘肽中的应用。

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