CN116286545B - 一种类球红细菌诱变菌株hcyj-01及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种类球红细菌诱变菌株HCYJ‑01及应用。该菌株以保藏编号CICC10287的类球红细菌为出发菌株，经60Co‑γ射线联合亚硝基胍诱变获得。其分类学命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，保藏编号：CGMCC NO.26642，保藏日期：2023年02月21日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株传代稳定性良好，辅酶Q10产量、产率可达出发菌株类球红细菌CICC10287的9.4倍，优化条件下辅酶Q10的产量可达3601mg/L,适于辅酶Q10工业生产。

Description

一种类球红细菌诱变菌株HCYJ-01及应用
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种类球红细菌诱变菌株HCYJ-01及应用。
背景技术
辅酶Q10具有抗氧化、保护心肌等作用，即属于保健食品也属于药物，也可作为化妆品用于抗衰老等。目前市场上辅酶Q10药物存在口服和注射两种制剂类型。其口服制剂用于心血管疾病、肝炎、癌症的综合治疗等的辅助治疗；注射剂用于充血性心力衰竭、继发性醛固酮增多症等的治疗。辅酶Q10可采用天然提取、化学合成和生物合成三种方法制备，其中生物合成即发酵法是工业生产的主流生产工艺。
关于烟曲霉、穿膜红细菌、根癌农杆菌、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)等发酵制备辅酶Q10的发酵工艺已有较多的研究报道。其中类球红细菌的辅酶Q10产量较高，因此也较为常用，是目前辅酶Q10发酵生产用的主要菌株。近年来，为进一步提高辅酶Q10发酵产量、产率，提高菌株生产性能等，学术界及工业企业对类球红细菌进行了广泛的研究，包括菌株诱变、基因改造等。由于辅酶Q10生物合成途径涉及的相关基因和酶较为复杂，基因改造对辅酶Q10的产量提高效果尚不理想，且普遍受到质粒不稳定的影响，需要特殊的固化技术。例如申请号CN201210201141.0的中国专利公布的工程菌株发酵产量仅为出发菌株(也称为亲本菌株或原始菌株)的1.14倍。 太空诱变、辐照等物理诱变、化学诱变等多种诱变技术也被用于类球红细菌的筛选，但大多产量为mg级，产率也较低且所得菌株难适应低氧培养条件，例如，申请号CN202210359522.5的中国专利文献及研究论文(任鹏. 类球红细菌产辅酶Q (10)的菌种选育及发酵条件优化[D]. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010.)报道的菌株。
原则上，商业化可用的发酵生产用菌株，辅酶Q10产量应达到500mg/L以上(王娅.辅酶Q (10)高产菌株理性选育与发酵优化. 福建师范大学, 2010.)。当进一步考虑菌株发酵的产率、动力耗电成本等更多因素时，对菌株的要求则更高。但目前辅酶Q10产量达到500mg/L以上的菌株较少。因此，辅酶Q10发酵生产用菌株仍有待进一步改进，以提高工业生产的效率和满足市场需求。
发明内容
针对上述技术问题和需求，本发明的目的之一是提供一种类球红细菌诱变菌株，该菌株的辅酶Q10发酵产量和产率较高，可满足工业生产需求。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种类球红细菌诱变菌株HCYJ-01，该菌株保藏编号为：CGMCC NO.26642；保藏日期为2023年02月21日；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述类球红细菌诱变菌株HCYJ-01的分类学命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
所述类球红细菌诱变菌株HCYJ-01是以类球红细菌(保藏编号CICC10287)为出发菌株，经60Co-γ射线、亚硝基胍交替诱变而得。分别在0.5L摇瓶培养和5L发酵罐流加补料培养条件下考察辅酶Q10的产量，类球红细菌诱变菌株HCYJ-01的辅酶Q10产量可达出发菌株类球红细菌CICC10287辅酶Q10产量的9.4倍。
因此，本发明的第二方面提供了所述类球红细菌诱变菌株HCYJ-01在发酵制备辅酶Q10中的应用。
本发明的有益效果：本发明的类球红细菌诱变菌株HCYJ-01辅酶Q10产量、产率可达出发菌株类球红细菌CICC10287的9.4倍，优化培养条件后，辅酶Q10的产量可达3601mg/L，产率可达37.5 mg/L/h，且传代稳定性良好无需基因工程菌所需的固化技术处理，适于辅酶Q10工业生产。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。实施例中辅酶Q10的产量(mg/L，即发酵结束时发酵液中辅酶Q10的浓度)采用高效液相色谱法测定。详细方法及操作步骤可参见论文《诱变选育高产辅酶 Q10 的类球红细菌》(柯崇榕, 陈鲁芳, 钟璐芳,等. 药物生物技术, 2015, 22(6):502-504.)。
实施例1 类球红细菌诱变方法及筛选实验
1.出发菌株
类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，保藏编号CICC10287)，在R2A培养基上呈现红色。
2.诱变方法
2.160Co-γ射线诱变
(1)拿菌种甘油管一支，接种到种子摇瓶中，32℃、200转/min，振荡培养23h。
(2)把培养好的种子液稀释至10-6梯度，吸取10ml到灭过菌的试管中，进行60Co-γ射线照射，照射剂量为0Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy。
(3)把未照射的菌液和60Co-γ射线照射后的菌液，分别取0.1ml涂布平板，32℃避光培养5d。
(4)从致死率为90%左右的平板上挑选形态颜色较佳的单菌落，接种到种子摇瓶中，培养23h，培养好后一部分做成甘油管，一部分接发酵摇瓶，发酵摇瓶培养48h后，测发酵单位，选1株辅酶Q10含量最高的菌株。
2.2亚硝基胍诱变
(1)拿60Co-γ射线诱变的菌种甘油管一支，接种到种子摇瓶中，32℃、200转/min，振荡培养23h。
(2)把培养好的种子液稀释至10-6梯度，吸取1ml到灭过菌的1.5ml离心管中。
(3)加入0.5ml亚硝基胍溶液，使终浓度为0.2mg/ml，32℃水浴处理，分别处理0min、10min、20min、30min、40min、50min。反应完后，离心用生理盐水重悬菌体，重复3次，终止反应。
(4)把未诱变的菌液和亚硝基胍诱变后的菌液，分别取0.1ml涂布平板，32℃避光培养5d。
(5)从致死率为90%左右的平板上挑选颜色不同的单菌落，接种到种子摇瓶中，培养23h左右，培养好后一部分做成甘油管，一部分接发酵摇瓶，发酵摇瓶培养48h后，测发酵单位，选1株辅酶Q10含量最高的菌株。
2.3联合诱变
根据本实施例“2.160Co-γ射线诱变”、“ 2.2亚硝基胍诱变”的方法进行辐照和化学诱变筛选。每次诱变筛选出的辅酶Q10含量最高的菌株作为下一次诱变的出发菌株。诱变依次采用60Co-γ射线、亚硝基胍进行交替诱变，共进行5次60Co-γ射线诱变、5次亚硝基胍诱变。
依次将各次诱变所得辅酶Q10含量最高的菌株编码为NT-03、NC-05、NCN-03、NC2-02、NC2N-07、NC3-11、NC3N-04、NC4-10、NC4N-05、NC5-01，保藏编号CICC10287的类球红细菌出发菌株编码为YS-00。
其中使用的培养基如下：
(1)平板及斜面培养基(g/L)：酵母粉15，NaCl 2.0，葡萄糖2.0，KH2PO41.0，MgSO4 0.5，FeSO4·7H2O 0.1，MnSO40.09，CoCl20.003，氯化胆碱 0.012，琼脂粉 18.0，pH 7.0～7.2。115℃灭菌20 min。
(2)种子摇瓶培养基(g/L)：(NH4)2SO4 2.5，酵母粉 1.0，谷氨酸钠 0.5，玉米浆干粉 0.5，葡萄糖 4.0，KH2PO4 0.5，K2HPO40.5，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 0.1， MgSO4·7H2O2.0，MnSO40.03，CoCl20.001，CaCO38.0，氯化胆碱 0.004，pH 6.8～7.0。115℃ 灭菌20 min。
(3)发酵摇瓶培养基(g/L)：(NH4)2SO42.5，谷氨酸钠 2.5，玉米浆干粉 3.5，葡萄糖60(115℃灭菌20 min)、KH2PO40.45，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 1.2，MgSO4·7H2O 11.0，MnSO40.05，CaCl20.07，CaCO38.0，氯化胆碱0.0028。121℃灭菌20min。
发酵培养基辅料(g/L)：维生素B1 0.605，维生素B2 0.0605，维生素B6 0.1113，烟酸 0.6875，烟酰胺0.6875，叶酸 0.033，泛酸钙 0.011，生物素 0.0217， 0.22μm水系膜过滤。
(4)发酵罐培养基(g/L)：(NH4)2SO42.5，谷氨酸钠 2.5，玉米浆干粉 3.5，KH2PO40.45，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 1.2，MgSO4·7H2O 11.0，MnSO40.05，CaCl20.07，CaCO38.0，氯化胆碱0.0028。121℃灭菌20 min。
发酵培养基辅料(g/L)：维生素B1 0.605，维生素B2 0.0605，维生素B6 0.1113，烟酸 0.6875，烟酰胺 0.6875，叶酸 0.033，泛酸钙 0.011，生物素 0.0217，0.22μm水系膜过滤。
发酵培养条件如下：
(1)摇瓶培养：接种量2%，32℃，200转/min，培养48h。发酵结束测定辅酶Q10产量。
(2)发酵罐培养：初始装液量2.0L，接种量2%，32℃，初始转速200转/min，初始通气量2.0L/min，溶氧10%~30%，pH7.0，控制葡萄糖浓度在5g/L(每6h测定1次，浓度波动范围±0.8g/L)，发酵96h测定辅酶Q10产量。
3.实验结果
3.1诱变致死率比较
不同60Co-γ射线照射剂量下类球红细菌的致死率结果见表1。
表1 不同60Co-γ射线照射剂量下类球红细菌的致死率
不同亚硝基胍处理时间下类球红细菌的致死率结果见表2。
表2 不同亚硝基胍处理时间下类球红细菌的致死率
3.2类球红细菌诱变菌株摇瓶培养及发酵罐培养的辅酶Q10产量比较
0.5L摇瓶和5L发酵罐分别考察了YS-00、NT-03、NC-05、NCN-03、NC2-02、NC2N-07、NC3-11、NC3N-04、NC4-10、NC4N-05、NC5-01的辅酶Q10产量，结果见表3。
表3 诱变菌株摇瓶培养及发酵罐培养的辅酶Q10产量比较
由表3可见，本实验条件下，发酵罐流加补料培养辅酶Q10产量高于摇瓶培养。其中摇瓶培养培养及发酵罐培养条件下，辅酶Q10产量最高的菌株分别为NC5-01和NC4N-05，但NC5-01和NC4N-05的辅酶Q10产量差异较小。本实验条件下，二者辅酶Q10产量分别为原始菌株YS-00辅酶Q10产量(mg/L)及产率(mg/L/h)的8.71～9.43倍、8.92～9.40倍。综合摇瓶培养及发酵罐培养的辅酶Q10产量，选择NC5-01作为优选菌株，赋予代号为类球红细菌诱变菌株HCYJ-01进行后续实验。
实施例2 类球红细菌诱变菌株HCYJ-01的生理生化特性鉴定
将菌株在固体培养基平板上划线（实施例1的“平板及斜面培养基”），32℃培养5d，观察单菌落的形态特征以及在显微镜下进行革兰氏染色观察。得到该菌株的主要形态及生理生化特性如下：
革兰氏阴性菌，染色后镜检为红色、菌体呈短杆状，无芽孢、单个或成对排列。菌落为圆形，呈绿色，表面湿润、不透明、边缘整齐。
此菌株最适生长温度为28℃～32℃，最适生长pH为 6.5～7.5；在摇床转速为180r/min～200r/min，培养23h菌体细胞量最高。
生化实验表明：此菌株为兼性厌氧菌，接触酶阳性，氧化酶阳性，磷酸酶阳性，乙醇脱氢酶阳性，β-半乳糖苷酶阳性，脲酶阴性，不能还原硝酸盐，不产H2S。
菌株可以利用蔗糖、葡萄糖、乳糖、D-半乳糖、D-麦芽糖、阿拉伯糖为碳源；无法利用L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、D-海藻糖、柠檬酸、赖氨酸、鸟氨酸及精氨酸等碳源。
实施例3 类球红细菌诱变菌株HCYJ-01的连续传代试验
将筛选出的高产辅酶Q10的类球红细菌诱变菌株HCYJ-01接种至准备好的种子摇瓶中，32℃，200rpm培养23h，培养结束后，一部分种子液按2%的接种量接种至新鲜种子摇瓶继续培养，剩余种子液按2%的接种量接种至5L发酵罐进行发酵培养。重复操作5次，测定5次发酵罐发酵的辅酶Q10产量。摇瓶培养及发酵罐培养条件同实施例1。
连续传代试验结果：
5个发酵罐实验中，检测出连续传代后的辅酶Q10产量分别为1233mg/L、1254mg/L、1207mg/L、1284mg/L和1239mg/L，表明类球红细菌HCYJ-01传代稳定性良好。
实施例4 类球红细菌诱变菌株HCYJ-01发酵生产辅酶Q10的工艺优化
类球红细菌诱变菌株HCYJ-01发酵生产辅酶Q10采用连续流加发酵工艺进行生产，以5L发酵罐进行实验。
发酵罐培养基(g/L)：(NH4)2SO42.5，谷氨酸钠 2.5，玉米浆干粉 3.5，KH2PO40.45，NaCl 2.0，FeSO4·7H2O 1.2，MgSO4·7H2O 11.0，MnSO40.05，CaCl20.07，CaCO38.0，氯化胆碱0.0028。121℃灭菌20 min。
发酵培养基辅料(g/L)：维生素B1 0.605，维生素B2 0.0605，维生素B6 0.1113，烟酸 0.6875，烟酰胺0.6875，叶酸0.033，泛酸钙0.011，生物素0.0217，0.22μm水系膜过滤。
发酵罐初始装液量2.0L，发酵温度32℃，初始转速200转/min，初始通气量2.0L/min，溶氧10%~30%，pH7.0，流加补料控制葡萄糖浓度，发酵结束时测定辅酶Q10产量(mg/L)。
选择接种量(2%、5%、10%)、发酵时间(72h、96h、120h)、控制葡萄糖浓度(5g/L、7.5g/L、10g/L；每6h测定1次，浓度波动范围±0.8g/L)三个因素。SPSS17.0软件中选择“数据-正交设计-生成”功能，输入因素和水平生成9卡正交实验表(表4)。
表4 9卡正交实验表及产量
按照9卡正交实验表，对不同因素水平组合下类球红细菌诱变菌株HCYJ-01发酵生产辅酶Q10的产量进行考察。利用SPSS17.0软件中“方差分析-一般线性分析-单变量”功能选择优化的发酵条件。由表4、表5可见，三个因素的主次关系是：接种量>发酵时间>控制葡萄糖浓度。其中接种量10%、发酵时间96h、控制葡萄糖浓度7.5g/L时类球红细菌HCYJ-01发酵生产辅酶Q10的产量达3601mg/L，产率可达37.5mg/L/h。
表5主体间效应检验结果

Claims (2)

1.一种类球红细菌诱变菌株HCYJ-01，其特征在于，所述类球红细菌诱变菌株HCYJ-01的保藏编号为：CGMCC NO.26642；保藏日期为2023年02月21日；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述类球红细菌诱变菌株HCYJ-01的分类学命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
2.权利要求1所述类球红细菌诱变菌株HCYJ-01在发酵制备辅酶Q10中的应用。
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