CN104830712A - 一种产高纯度2-酮基-d-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株 - Google Patents
一种产高纯度2-酮基-d-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株，属于微生物领域。产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：10548，其保藏时间为：2015年2月9日。所述菌株能利用葡萄糖和海藻糖作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵不产气体，触酶阳性。该菌株用于2-酮基-D-葡萄糖酸的生产，使用该菌株生产2-酮基-D-葡萄糖酸，葡萄糖转化率高、副产物少，所得2-酮基-D-葡萄糖酸纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株。
背景技术
2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid，2KGA）是葡萄糖酸的一种重要衍生物。2-酮基-D-葡萄糖酸可作为饲料的富钙添加剂、洗涤剂的促净剂、水机增塑剂和摄影显影剂等。同时，2-酮基-D-葡萄糖酸还是合成糠醛、D-阿拉伯糖、D-异抗坏血酸及D-异抗坏血酸钠的前体。其中合成D-异抗坏血酸（钠）是其最主要的用途。
异抗坏血酸为白色至浅黄色结晶或结晶性粉末，无臭，味酸，具有极强的还原性，极易溶于水，广泛应用于食品、医药、纺织、建材、日用化工等行业，其中，最主要用途是应用于食品加工行业。由于目前异抗坏血酸（钠）在天然食品中不存在，市场上的产品均为人工合成产品。目前异抗坏血酸生产主要是利用2-酮基-D-葡萄糖酸经酯化、转化、精制等过程得到成品。
2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有酶法、化学合成法和发酵法等三种：（1）酶法。在在吡喃糖-2-氧化酶(pyranose-2-oxidase)、葡萄糖-2-氧化酶(glucose-2-oxidase)和葡萄糖-1-氧化酶(glucose-1-oxidase)中任何一种酶的催化下，用O2将溶液中的D-葡萄糖氧化为D-葡糖醛酮或D-葡萄糖酸-δ-内酯，然后选择吡喃糖-2-氧化酶和葡萄糖-1-氧化酶的一种酶，催化氧化D-葡糖醛酮或D-葡萄糖酸-δ-内酯为过氧化氢和2-酮基-D-葡萄糖酸；(2)化学合成法。以葡萄糖为起始原料，在Pt/Pb催化剂存在的条件下，用O2将葡萄糖氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸；(3)发酵法。利用细菌直接转化发酵培养基中的葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸（魏转，余泗莲，刘正安，孙文敬，周强，李中兵。2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产研究进展[J].食品科学,2008,29(8):636-639）。
由于生产成本、生产安全性等方面的原因，目前在工业生产中通常采用细菌发酵的方法。目前，国外对于发酵法生产发酵法2-酮基-D-葡萄糖酸的研究菌属主要是食爬虫假单胞菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、葡萄糖酸杆菌、醋酸杆菌，工业生产菌株主要是荧光假单胞菌、粘质沙雷氏菌和鸡血藤欧文氏菌。国内对于发酵法生产发酵法2-酮基-D-葡萄糖酸的研究菌属主要是荧光假单胞菌（余泗莲，汪美生，孙文敬，崔凤杰，魏转，余斌，周强，齐向辉，王亮.荧光假单胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸[J].中国食品添加剂,2012,6:191-197.）、沙雷氏菌、球状节杆菌、恶臭假单胞菌、产酮产碱菌，工业生产菌株主要是荧光假单胞菌和球状节杆菌。生产菌株的转化率一般在90%左右。
虽然发酵法是目前2-酮基-D-葡萄糖酸生产的主要方法，但是由于现用生产菌的原料利用率不高，发酵转化率偏低，产品纯度较低，生产损耗大，且容易被噬菌体污染，因此有必要筛选具有转化率高、产品纯度高、发酵速率快等优良特性的新2-酮基-D-葡萄糖酸生产菌，以取代或部分取代目前的生产菌，从而提高生产效率，降低成产成本。
发明内容
为解决现有技术发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸中由于菌种问题导致转化率低、纯度低、生产损耗大且易被噬菌体污染的问题，本发明提供了一种产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株。
本发明的技术方案为：
产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：10548，其保藏时间为：2015年2月9日。
所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，其获取步骤为：1）由土样中的微生物经培养、筛选获得出发菌株，即，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）S-136；2）将出发菌株接种于种子培养基培养，经诱变、筛选获得耗糖速率稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量及纯度都有提高的突变菌株SD-136；3）将突变菌株SD-136接种于种子培养基培养，经诱变、筛选、复筛，获得遗传性质稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量最高达104.6g/L，转化率高达95.1%的突变菌株SDSPY-136。
进一步的，步骤1）中由土样中的微生物经富集培养、溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培养后，接入发酵培养基，筛选获得产高纯2-酮基-D-葡萄糖酸的出发菌株，命名为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）S-136；步骤2）中，出发菌株对数生长中期的菌体，做成细胞浓度为1×108－109cfu/ml的菌悬液，在紫外灯照射下诱变，间隔挑取不同紫外灯照射时间的样品，进行溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培养后，发酵筛选，获得突变菌株SD-136；步骤3）中，突变菌株SD-136对数生长中期的菌体，做成细胞浓度为1×108－109cfu/ml的菌悬液，在亚硝基胍处理液的作用下诱变，间隔挑取不同处理时间的样品，进行平板筛选、斜面培养后，发酵筛选；发酵筛选的菌株进行发酵复筛，获得突变菌株SDSPY-136。
该保藏菌株的生物学特征是：在固体培养（分离培养基）平板上30℃培养24h后观察，菌落可形成红色、表面光滑湿润的圆形菌落，微凸起，光学显微镜下观察菌体为近球形短杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽孢。用于菌体形态观察的固体培养基组成（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，琼脂18，pH值7.0。上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，能利用葡萄糖和海藻糖作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵不产气体，触酶阳性。
该菌株生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。菌株CGMCC N0.10584生理生化实验结果详见表 1。
所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株16S rDNA 的部分基因序列为：
CCCGAAGGTT AAGCTACCTA CTTCTTTTGC AACCCACTCC CATGGTGTGA 50
CGGGCGGTGT GTACAAGGCC CGGGAACGTA TTCACCGTAG CATTCTGATC 100
TACGATTACT AGCGATTCCG ACTTCATGGA GTCGAGTTGC AGACTCCAAT 150
CCGGACTACG ACGTACTTTA TGAGGTCCGC TTGCTCTCGC GAGGTCGCTT 200
CTCTTTGTAT ACGCCATTGT AGCACGTGTG TAGCCCTACT CGTAAGGGCC 250
ATGATGACTT GACGTCATCC CCACCTTCCT CCAGTTTATC ACTGGCAGTC 300
TCCTTTGAGT TCCCGGCCGA ACCGCTGGCA ACAAAGGATA AGGGTTGCGC 350
TCGTTGCGGG ACTTAACCCA ACATTTCACA ACACGAGCTG ACGACAGCCA 400
TGCAGCACCT GTCTCAGAGT TCCCGAAGGC ACCAATCCAT CTCTGCTAAG 450
TTCTCTGGAT GTCAAGAGTA GGTAAGGTTC TTCGCGTTGC ATCGAATTAA 500
ACCACATGCT CCACCGCTTG TGCGGGCCCC CGTCAATTCA TTTGAGTTTT 550
AACCTTGCGG CCGTACTCCC CAGGCGGTCG ATTTAACGCG TTAGCTCCGG 600
AAGCCACGCC TCAAGGGCAC AACCTCCAAA TCGACATCGT TTACAGCGTG 650
GACTACCAGG GTATCTAATC CTGTTTGCTC CCCACGCTTT CGCACCTGAG 700
CGTCAGTCTT CGTCCAGGGG GCCGCCTTCG CCACCGGTAT TCCTCCAGAT 750
CTCTACGCAT TTCACCGCTA CACCTGGAAT TCTACCCCCC TCTACGAGAC 800
TCTAGCTTGC CAGTTTCAAA TGCAGTTCCC GGGTTGAGCC CGGGGATTTC 850
ACATCTGACT TAACAAACCG CCTGCGTGCG CTTTACGCCC AGTAATTCCG 900
ATTAACGCTT GCACCCTCCG TATTACCGCG GCTGCTGGCA CGGAGTTAGC 950
CGGTGCTTCT TCTGCGAGTA ACGTCAATTG ATGAGCGTAT TAAATTCACC 1000
ACCTTCCTCC TCGCTGAAAG TGCTTTACAA CCCGAAGGCC TTCTTCACAC 1050
ACGCGGCATG GCTGCATCAG GCTTGCGCCC ATTGTGCAAT ATTCCCCACT 1100
GCTGCCTCCC GTAGGAGTCT GGACCGTGTC TCAGTTCCAG TGTGGCTGGT 1150
CATCCTCTCA GACCAGCTAG GGATCGTCGC CTAGGTGAGC CATTACCCCA 1200
CCTACTAGCT AATCCCATCT GGGCACATCT GATGGCAAGA GGCCCGAAGG 1250
TCCCCCTCTT TGGTCTTGCG ACGTTATGCG GTATTAGCTA CCGTTTCCAG 1300
TAGTTATCCC CCTCCATCAG GCAGTTTCCC AGACATTACT CACCCGTCCG 1350
CCGCTCGTCA CCCAGGGAGC AAGCTCCCCT TGTGCTACCG CTCGACTGCA 1400
TGGTA 1405。
对本发明的菌株CGMCC NO.10548测定16S rDNA 的部分基因序列的结果显示，该菌属于粘质沙雷氏菌。
通过使用美国生物工程信息中心（ National Center for Biotechnology Information , NCBI ）BLAST 程序比对，发现本发明的CGMCC NO.10548菌株 16S rDNA 的基因序列与NCBI注册的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）N2.4 16S rDNA的基因序列具有高度同源性，并结合生理生化实验，初步鉴定CGMCC NO.10548菌株是一株沙雷氏菌（Serratia sp）。
所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株用于2-酮基-D-葡萄糖酸的生产。
采用所述产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其步骤为：
1）将菌株移接至活化培养基，活化菌株；
2）将活化菌株接种于种子培养基，扩大培养；
3）将扩大培养后的菌株接种到以葡萄糖或海藻糖为碳源的发酵培养基上，进行发酵，发酵液中生成2-酮基-D-葡萄糖酸。
进一步的，步骤1）中活化培养基为斜面培养基，其组成为：蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.0；步骤2）中种子培养基为液体种子培养基，其组成为：蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，pH值7.0；步骤3）中发酵培养基为：葡萄糖110 g/L，玉米浆10 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，FeSO4·7H2O 0.036 g/L，CaCO3 50 g/L，pH7.0。
作为优选方案，生产2-酮基-D-葡萄糖酸的具体步骤为：
1）将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株移接斜面活化；
2）配制液体种子培养基，250ml三角瓶装液量为30-40ml，121℃蒸汽灭菌，冷却至室温，接种斜面菌种2环后置于旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，29-31℃培养10-15小时，得种子液；
3）配制发酵培养基，250ml三角瓶装液量为30-40ml，115℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种种子液3-4ml后置于转转速为200r/min、旋转半径为40mm摇床上，29-31℃培养65-80小时结束发酵，离心，取上清液，测发酵液中定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，并计算葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率。
作为另一种优选方案，生产2-酮基-D-葡萄糖酸具体步骤为：
1）将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株移接斜面活化；
2）配制液体种子培养基，250ml三角瓶装液量为30-40ml，121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环后置于旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，29-31℃培养10-15小时，得种子液；
3）以5L发酵罐按3L装液量配制发酵培养基，调整pH7.0，115℃实罐灭菌，循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液300 ml，进行发酵，初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为350r/min，通气量2L/min，罐内压力0.065MPa；发酵过程中控制发酵温度30±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为30%-35%；发酵周期为30-40h；离心，取上清液，测发酵液中定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，并计算葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率。
本发明的有益效果为：
本发明所述菌株可有效地转化葡萄糖生产2-酮基-D-葡萄糖酸，同时发酵副产物较少，经过简单处理后即可作为转化生产异抗坏血酸钠的原料，是一株极具研究开发价值的2-酮基-D-葡萄糖酸生产菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136 筛选平板变色圈照片；
图2粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌落形态特征照片；
图3粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136结晶紫染色照片；
图4粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株发酵液高效液相色谱图；
图5粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136构建系统发育树；
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.10548，保藏时间：2015年2月9日。
具体实施方式
实施例1 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548菌的获取
产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：10548，其保藏时间为：2015年2月9日。
本发明的收藏菌株，即，产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，其获取步骤为：
1）花园土样中的微生物接种于富集培养基，经富集培养后，梯度稀释，然后涂布到溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板中，30℃培养1-2天；挑取变色圈大的单菌落转接至斜面培养基中30℃培养1-2天，然后再进行摇瓶发酵筛选，30mL摇瓶发酵培养基装于250mL三角瓶中，1支接1瓶接入1～2环斜面菌种，30℃、200r/min振荡培养72小时左右，然后测发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量，最终筛选获得一株高纯2-酮基-D-葡萄糖酸的出发菌株，命名为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）S-136。
2）将出发菌株粘质沙雷氏菌S-136接种液体种子培养基，30℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108－109cfu/ml。取上述菌悬液10ml放入平皿中，置30W紫外灯下照射，照射距离15cm，照射时间为3分钟、5分钟、7分钟、10分钟，间隔取样适当稀释后涂布于溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板，30℃培养1-2天，挑取生长状况良好、变色透明圈大的单菌落进行斜面培养，30℃培养1-2天，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，30℃摇瓶发酵72小时，取发酵液4000r/min离心10分钟，取上清液测定发酵液中残留葡萄糖2-酮基-D-葡萄糖酸含量，选取残留葡萄糖浓度低、2-酮基-D-葡萄糖酸产量高且转化率高的菌株为目的菌株。
将目的菌株再经摇瓶发酵复筛以进一步分离筛选，选育得到一株耗糖速率稳定和2-酮基-D-葡萄糖酸产量及转化率都有提高的突变菌株SD-136。
SD-136菌株接种初始葡萄糖浓度为110g/L的发酵培养基，30℃摇瓶培养72小时结束发酵，发酵液中检测不到葡萄糖，2-酮基-D-葡萄糖酸产量为98.7g/L，转化率为89.7%。
3）将筛选到的突变菌株SD-136菌株接种液体种子培养基中，30℃培养到对数生长期中期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次，然后加无菌生理盐水做成菌悬液，使细胞浓度在1×108－109 cfu/ml，备用。
亚硝基胍处理液配制：称取亚硝基胍20mg，放置于100ml无菌三角瓶中，加丙酮2ml使其溶解，再加入18ml Tris缓冲液（pH6.0,0.5mol/L）混匀，备用。
取上述亚硝基胍处理液10ml，加入10ml菌悬液，30℃保温振荡50-60分钟，每隔10分钟取样一次，取样后首先稀释1000倍终止反应，然后再稀释2-10倍，涂布溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板，30℃培养1-2天，挑取单菌落移接斜面，斜面成熟后接种装有发酵培养基的摇瓶，30℃摇瓶发酵72小时，发酵液4000r/min离心10分钟，取上清液测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，选取残留葡萄糖浓度低、2-酮基-D-葡萄糖酸产量及转化率高的菌株为目的菌株。
将目的菌株再经摇瓶发酵复筛，经进一步分离筛选得到一株遗传性质稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量最高达104.6g/L，转化率为95.1%的突变菌株SDSPY-136。
上述菌株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136，已于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCC N0.10548。
上述富集培养基组成为（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，pH值7.0；
上述溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板培养基组成为（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，溴甲酚紫0.01，碳酸钙10，pH值7.0；
上述斜面培养基组成为（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，琼脂20，pH值7.0；
上述液体种子培养基组成为（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，pH值7.0；
上述摇瓶发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖110，玉米浆10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.036，CaCO3 50，pH7.0。
实施例2 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548菌株生物学特征、生理生化特性及16S rRNA基因测序
A该保藏菌株的生物学特征是：在固体培养平板（分离培养基）上30℃培养24h后观察，菌落可形成红色、表面光滑湿润的圆形菌落，微凸起（如图1、图2所示），光学显微镜下观察菌体为近球形短杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽孢（如图3所示）。用于菌体形态观察的固体培养基组成（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，琼脂18，pH值7.0。上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
B该菌株生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。菌株CGMCC N0.10584生理生化实验结果详见表 1。
所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，能利用葡萄糖和海藻糖作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵不产气体，触酶阳性。
C将实施例1选育得到的2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株SDSPY-136即CGMCC N0.10584菌株委托济南力戈科技有限公司（Jinan lige tecnotoly Co.,Ltd）进行16S rRNA基因测序。
测试方法：挑取斜面培养物于10μl灭菌水中，99℃变性后离心取上清液作为模板，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No.D310)，以Forward/Reverse primer2为引物，扩增目的片段。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (Code No.DV805A) 切胶回收目的片断，以Seq Forward、 Seq Reverse Seq Internal为引物对上述回收产物进行DNA测序。
测序结果：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548 16S rDNA测序核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
<110>山东省食品发酵工业研究设计院
<120>一株产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌
<141> 2015-01-21
<212> DNA
<213>粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)
<221>粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) CGMCC N0.10548 16S rDNA
<400>
CCCGAAGGTT AAGCTACCTA CTTCTTTTGC AACCCACTCC CATGGTGTGA 50
CGGGCGGTGT GTACAAGGCC CGGGAACGTA TTCACCGTAG CATTCTGATC 100
TACGATTACT AGCGATTCCG ACTTCATGGA GTCGAGTTGC AGACTCCAAT 150
CCGGACTACG ACGTACTTTA TGAGGTCCGC TTGCTCTCGC GAGGTCGCTT 200
CTCTTTGTAT ACGCCATTGT AGCACGTGTG TAGCCCTACT CGTAAGGGCC 250
ATGATGACTT GACGTCATCC CCACCTTCCT CCAGTTTATC ACTGGCAGTC 300
TCCTTTGAGT TCCCGGCCGA ACCGCTGGCA ACAAAGGATA AGGGTTGCGC 350
TCGTTGCGGG ACTTAACCCA ACATTTCACA ACACGAGCTG ACGACAGCCA 400
TGCAGCACCT GTCTCAGAGT TCCCGAAGGC ACCAATCCAT CTCTGCTAAG 450
TTCTCTGGAT GTCAAGAGTA GGTAAGGTTC TTCGCGTTGC ATCGAATTAA 500
ACCACATGCT CCACCGCTTG TGCGGGCCCC CGTCAATTCA TTTGAGTTTT 550
AACCTTGCGG CCGTACTCCC CAGGCGGTCG ATTTAACGCG TTAGCTCCGG 600
AAGCCACGCC TCAAGGGCAC AACCTCCAAA TCGACATCGT TTACAGCGTG 650
GACTACCAGG GTATCTAATC CTGTTTGCTC CCCACGCTTT CGCACCTGAG 700
CGTCAGTCTT CGTCCAGGGG GCCGCCTTCG CCACCGGTAT TCCTCCAGAT 750
CTCTACGCAT TTCACCGCTA CACCTGGAAT TCTACCCCCC TCTACGAGAC 800
TCTAGCTTGC CAGTTTCAAA TGCAGTTCCC GGGTTGAGCC CGGGGATTTC 850
ACATCTGACT TAACAAACCG CCTGCGTGCG CTTTACGCCC AGTAATTCCG 900
ATTAACGCTT GCACCCTCCG TATTACCGCG GCTGCTGGCA CGGAGTTAGC 950
CGGTGCTTCT TCTGCGAGTA ACGTCAATTG ATGAGCGTAT TAAATTCACC 1000
ACCTTCCTCC TCGCTGAAAG TGCTTTACAA CCCGAAGGCC TTCTTCACAC 1050
ACGCGGCATG GCTGCATCAG GCTTGCGCCC ATTGTGCAAT ATTCCCCACT 1100
GCTGCCTCCC GTAGGAGTCT GGACCGTGTC TCAGTTCCAG TGTGGCTGGT 1150
CATCCTCTCA GACCAGCTAG GGATCGTCGC CTAGGTGAGC CATTACCCCA 1200
CCTACTAGCT AATCCCATCT GGGCACATCT GATGGCAAGA GGCCCGAAGG 1250
TCCCCCTCTT TGGTCTTGCG ACGTTATGCG GTATTAGCTA CCGTTTCCAG 1300
TAGTTATCCC CCTCCATCAG GCAGTTTCCC AGACATTACT CACCCGTCCG 1350
CCGCTCGTCA CCCAGGGAGC AAGCTCCCCT TGTGCTACCG CTCGACTGCA 1400
TGGTA 1405
通过使用美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information , NCBI ）BLAST 程序比对，发现CGMCC N0.10548菌株 16S rDNA序列与NCBI注册的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）N2.4 16S rDNA序列具有高度同源性，结合生理生化实验，说明CGMCC NO.10548菌株是一株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136构建系统发育树如图5所示。
实施例3 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548菌株的应用
培养基：
斜面培养基组成为（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，琼脂20，pH值7.0；
液体种子培养基组成为（g/L）：蛋白胨5，氯化钠5，牛肉膏3，pH值7.0；
发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖110，玉米浆10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.8，FeSO4·7H2O 0.036，CaCO3 50，pH7.0。
采用该收藏菌株生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法
1）将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CGMCC N0.10548菌株移接斜面培养基进行活化；
按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基，250ml三角瓶装液量为30ml，121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环，置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，30℃培养12小时，得种子液，取种子液置600nm测吸光值为0.267；
按上述发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始葡萄糖浓度实测为12.3g/L，250ml三角瓶装液量为30ml，115℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种种子液3ml，置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm摇床上，30℃培养72小时结束发酵，发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量分别为0g/L、104.5g/L，葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为95%,，所得2-酮基-D-葡萄糖酸的纯度为99.08%。
或者：
以5L发酵罐按3L装液量配制发酵培养基，调整pH7.0，115℃实罐灭菌20分钟，循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液300 ml，接种后立即取样测定葡萄糖浓度为176 g/L。
初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为350r/min，通气量2L/min，罐内压力0.065MPa。发酵过程中控制发酵温度30±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧 35%。
发酵过程中每4小时取样，测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量及菌体浓度，当葡萄糖含量低于10 g/L时，每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，至发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量不再增加时结束发酵，发酵周期为36小时。
发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸的含量分别为0.04g/L、187.8g/L，葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为106.72%,，所得2-酮基-D-葡萄糖酸的纯度为99.11%。
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株发酵罐中所得发酵液高效液相色谱图如图4所示，图4明显看出，发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量非常高，副产物（杂质）非常少，因此本发明方法得到的2-酮基-D-葡萄糖酸纯度极高。
上述葡萄糖按下述方法测定：
使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
上述2-酮基-D-葡萄糖酸按下述方法测定：
碘量法测定，测定原理是：2-酮基-D-葡萄糖酸分子内含有可直接发生酯化反应的羧基和醇羟基，还含有可发生互变异构反应的羰基，在强酸性条件下加热2-酮基-D-葡萄糖酸水溶液可以将其定量转化为D-异抗坏血酸。利用D-异抗坏血酸与I2的氧化还原反应可以定量测定D-异抗坏血酸的质量浓度，然后换算成2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度。
上述2-酮基-D-葡萄糖酸转化率按下述公式计算：
Claims (10)
1.产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：10548，其保藏时间为：2015年2月9日。
2.如权利要求1所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，其特征在于，其获取步骤为：1）由土样中的微生物经培养、筛选获得出发菌株，即，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）S-136；2）将出发菌株接种于种子培养基培养，经诱变、筛选获得耗糖速率稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量及纯度都有提高的突变菌株SD-136；3）将突变菌株SD-136接种于种子培养基培养，经诱变、筛选、复筛，获得遗传性质稳定、2-酮基-D-葡萄糖酸产量最高达104.6g/L，转化率高达95.1%的突变菌株SDSPY-136。
3.如权利要求2所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，其特征在于：步骤1）中由土样中的微生物经富集培养、溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培养后，接入发酵培养基，筛选获得产高纯2-酮基-D-葡萄糖酸的出发菌株，命名为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）S-136；步骤2）中，出发菌株对数生长中期的菌体，做成细胞浓度为1×108－109cfu/ml的菌悬液，在紫外灯照射下诱变，间隔挑取不同紫外灯照射时间的样品，进行溴甲酚紫-碳酸钙筛选平板筛选、斜面培养后，发酵筛选，获得突变菌株SD-136；步骤3）中，突变菌株SD-136对数生长中期的菌体，做成细胞浓度为1×108－109cfu/ml的菌悬液，在亚硝基胍处理液的作用下诱变，间隔挑取不同处理时间的样品，进行平板筛选、斜面培养后，发酵筛选；发酵筛选的菌株进行发酵复筛，获得突变菌株SDSPY-136。
4.如权利要求1所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，其特征在于：所述菌株能利用葡萄糖和海藻糖作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵不产气体，触酶阳性。
5.如权利要求1所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株，其特征在于，其16S rDNA 的部分基因序列为：
CCCGAAGGTT AAGCTACCTA CTTCTTTTGC AACCCACTCC CATGGTGTGA 50
CGGGCGGTGT GTACAAGGCC CGGGAACGTA TTCACCGTAG CATTCTGATC 100
TACGATTACT AGCGATTCCG ACTTCATGGA GTCGAGTTGC AGACTCCAAT 150
CCGGACTACG ACGTACTTTA TGAGGTCCGC TTGCTCTCGC GAGGTCGCTT 200
CTCTTTGTAT ACGCCATTGT AGCACGTGTG TAGCCCTACT CGTAAGGGCC 250
ATGATGACTT GACGTCATCC CCACCTTCCT CCAGTTTATC ACTGGCAGTC 300
TCCTTTGAGT TCCCGGCCGA ACCGCTGGCA ACAAAGGATA AGGGTTGCGC 350
TCGTTGCGGG ACTTAACCCA ACATTTCACA ACACGAGCTG ACGACAGCCA 400
TGCAGCACCT GTCTCAGAGT TCCCGAAGGC ACCAATCCAT CTCTGCTAAG 450
TTCTCTGGAT GTCAAGAGTA GGTAAGGTTC TTCGCGTTGC ATCGAATTAA 500
ACCACATGCT CCACCGCTTG TGCGGGCCCC CGTCAATTCA TTTGAGTTTT 550
AACCTTGCGG CCGTACTCCC CAGGCGGTCG ATTTAACGCG TTAGCTCCGG 600
AAGCCACGCC TCAAGGGCAC AACCTCCAAA TCGACATCGT TTACAGCGTG 650
GACTACCAGG GTATCTAATC CTGTTTGCTC CCCACGCTTT CGCACCTGAG 700
CGTCAGTCTT CGTCCAGGGG GCCGCCTTCG CCACCGGTAT TCCTCCAGAT 750
CTCTACGCAT TTCACCGCTA CACCTGGAAT TCTACCCCCC TCTACGAGAC 800
TCTAGCTTGC CAGTTTCAAA TGCAGTTCCC GGGTTGAGCC CGGGGATTTC 850
ACATCTGACT TAACAAACCG CCTGCGTGCG CTTTACGCCC AGTAATTCCG 900
ATTAACGCTT GCACCCTCCG TATTACCGCG GCTGCTGGCA CGGAGTTAGC 950
CGGTGCTTCT TCTGCGAGTA ACGTCAATTG ATGAGCGTAT TAAATTCACC 1000
ACCTTCCTCC TCGCTGAAAG TGCTTTACAA CCCGAAGGCC TTCTTCACAC 1050
ACGCGGCATG GCTGCATCAG GCTTGCGCCC ATTGTGCAAT ATTCCCCACT 1100
GCTGCCTCCC GTAGGAGTCT GGACCGTGTC TCAGTTCCAG TGTGGCTGGT 1150
CATCCTCTCA GACCAGCTAG GGATCGTCGC CTAGGTGAGC CATTACCCCA 1200
CCTACTAGCT AATCCCATCT GGGCACATCT GATGGCAAGA GGCCCGAAGG 1250
TCCCCCTCTT TGGTCTTGCG ACGTTATGCG GTATTAGCTA CCGTTTCCAG 1300
TAGTTATCCC CCTCCATCAG GCAGTTTCCC AGACATTACT CACCCGTCCG 1350
CCGCTCGTCA CCCAGGGAGC AAGCTCCCCT TGTGCTACCG CTCGACTGCA 1400
TGGTA 1405。
6.如权利要求1所述的产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株用于2-酮基-D-葡萄糖酸的生产。
7.采用如权利要求1所述产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，其步骤为：
1）将菌株移接至活化培养基，活化菌株；
2）将活化菌株接种于种子培养基，扩大培养；
3）将扩大培养后的菌株接种到以葡萄糖或海藻糖为碳源的发酵培养基上，进行发酵，发酵液中生成2-酮基-D-葡萄糖酸。
8.如权利要求7所述生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，步骤1）中活化培养基为斜面培养基，其组成为：蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.0；步骤2）中种子培养基为液体种子培养基，其组成为：蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，pH值7.0；步骤3）中发酵培养基为：葡萄糖110 g/L，玉米浆10 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，FeSO4·7H2O 0.036 g/L，CaCO3 50 g/L，pH7.0。
9.如权利要求8所述生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，具体步骤为：
1）将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株移接斜面活化；
2）配制液体种子培养基，250ml三角瓶装液量为30-40ml，121℃蒸汽灭菌，冷却至室温，接种斜面菌种2环后置于旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，29-31℃培养10-15小时，得种子液；
3）配制发酵培养基，250ml三角瓶装液量为30-40ml，115℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种种子液3-4ml后置于转转速为200r/min、旋转半径为40mm摇床上，29-31℃培养65-80小时结束发酵，离心，取上清液，测发酵液中定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，并计算葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率。
10.如权利要求8所述生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，具体步骤为：
1）将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）SDSPY-136菌株移接斜面活化；
2）配制液体种子培养基，250ml三角瓶装液量为30-40ml，121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种斜面菌种2环后置于旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上，29-31℃培养10-15小时，得种子液；
3）以5L发酵罐按3L装液量配制发酵培养基，调整pH7.0，115℃实罐灭菌，循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液300 ml，进行发酵，初始发酵罐参数设置为：搅拌转速为350r/min，通气量2L/min，罐内压力0.065MPa；发酵过程中控制发酵温度30±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为30%-35%；发酵周期为30-40h；离心，取上清液，测发酵液中定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量，并计算葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率。
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