CN105695520B - 一种提高发酵法生产2-酮基-d-葡萄糖酸产量的方法 - Google Patents

一种提高发酵法生产2-酮基-d-葡萄糖酸产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高发酵法2‑酮基‑D‑葡萄糖酸产量的方法，属于发酵工程领域。本发明以产2‑酮基‑D‑葡萄糖酸的沙雷氏菌(Serratia sp.)ATCC 39006为生产菌株，溶氧控制在40％，在发酵16、22及28h时分别补加64、80和96g硫酸铵，并且当残糖浓度降至15‑25g/L时，补加890g葡萄糖，共补加5次时，发酵效果最好。本发明发酵44h，2‑KGA产量达到265.8g/L，产率达到1.03g/g。2‑酮基‑D‑葡萄糖酸的产量由180.1g/L提高至265.8g/L，提高幅度为47.6％，效果显著。

Description

一种提高发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高发酵法2-酮基-D-葡萄糖酸产量的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
2-酮基-D-葡萄糖酸(2-Keto-D-gluconic Acid,2-KGA)，是目前大规模生产的有机酸之一，主要用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠(sodium erthorbate，EN)以及D-抗坏血酸(Erthorbate acid，EA)的合成，D-异抗坏血酸又称异维生素C，在食品工业上被广泛用为食品抗氧化剂。在自然界中，有许多微生物能发酵生产2-KGA，高产菌株列于表，主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia sp)和产碱杆菌属(Alcaligenes)等。其中，荧光假单胞菌因产量高、易培养而成为国内工业化生产的常用菌种。但发酵过程中仍存在一些弊端：工业化生产培养基通常采用的是蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等有机氮源，价格昂贵，成分复杂，不利于下游提取且难以透彻灭菌容易引发噬菌体污染。通过筛选抗噬菌体菌株进行发酵以解决噬菌体污染问题，并协同采用补料分批发酵及固定化方式提高生产效率、降低后期提取难度和生产成本，但仍避免不了噬菌体感染问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸产量的方法。
所述方法是采用沙雷氏菌(Serratia sp.)为出发菌株，在将活化后的菌株接种到发酵培养基，对葡萄糖、硫酸铵进行分批补料，并控制溶氧。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基以g/L计，初始葡萄糖100，初始硫酸铵5，KH2PO4 1，Na2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnCl2·4H2O 0.036，FeSO4·7H2O 0.036。
在本发明的一种实施方式中，所述沙雷氏菌(Serratia sp.)是沙雷氏菌ATCC39006。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵罐是30L发酵罐，起始装液量为16L，接种比例为13％。
在本发明的一种实施方式中，在发酵16、22及28h时分别补加64、80和96g硫酸铵，并且当发酵液中残糖浓度降至15-25g/L时补加801g葡萄糖，共补加5次；溶氧控制在40％。
在本发明的一种实施方式中，发酵温度为30℃，30L发酵罐装有16L发酵培养基，初始搅拌转速500r/min，通气量24.0L/min，接种量13％，自动流加8mol/L NaOH控制pH值在6.0。
本发明发酵44h，2-KGA产量达到265.8g/L，产率达到1.03g/g，2-酮基-D-葡萄糖酸的产量由180.1g/L提高至265.8g/L，提高幅度为47.6％，效果显著。
附图说明
图1 2-酮基-D-葡萄糖酸钙标准曲线。
图2色谱检测结果，3g/L 2-酮基-D-葡萄糖酸钙标样。
图3色谱检测结果，44h发酵液(稀释100倍)。
具体实施方式
2-酮基-D-葡萄糖酸产量的测定：
取发酵液10000rpm离心10min，收集上清液并稀释适当倍数，并以2-酮基-D-葡萄糖酸钙作为标准品，配制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定2-酮基-D-葡萄糖酸的含量。
色谱条件：高效液相色谱仪：Agilent 1200system；色谱柱：BioRad公司AminexHPX-87H；流动相：0.5mmol/L稀硫酸用0.45μm滤膜过滤；柱温：35℃；检测器：示差检测器(RID)；进样量：10μL流速:0.6ml/min。标准曲线在1-10g/L之间呈现良好的线性关系(图1)，回归方程：y＝1.9196x-0.0377R2＝0.9997。
斜面培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂0.2，pH 7.0；培养条件：30℃培养箱中培养20h。
种子培养基(g/L)：蛋白胨5，牛肉浸取物3，NaCl 5，pH 7.0；培养条件：温度30℃、摇床转速200rpm条件下，培养12-14h。
基础发酵培养基(g/L)：初始葡萄糖100，初始硫酸铵浓度为5，KH2PO4 1，Na2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnCl2·4H2O 0.036，FeSO4·7H2O 0.036。
以下实施例所用菌种为沙雷氏菌(Serratia sp.)ATCC 39006，购自ATCC。
实施例1发酵培养基中葡萄糖含量对发酵结果的影响
将活化的保藏菌种接至斜面培养基上，在30℃培养箱中培养20h。用接种针从新鲜斜面上挑取3-4环菌，然后接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中。在30℃、200r/min转速下培养12-14h。以13％的接种量接入装有16L发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为30℃，初始搅拌转速500r/min，通气量24.0L/min，校罐时的溶氧设为100％，自动流加8mol/L NaOH控制pH值在6.0。
当发酵培养基的葡萄糖的初始浓度为100g/L时，不同补加葡萄糖次数、补加时间都对发酵产2-KGA有影响。采用以下三种补料方式进行补料分批发酵，葡萄糖以800g/L糖液的形式加入，发酵结果见表1。
对照：发酵初始一次性补加4005g。
方式1，一次定量补料：在葡萄糖浓度降为15-25g/L时，一次性补加含4005g葡萄糖。
方式2，二次定量补料：当葡萄糖浓度降为15-25g/L时，分二次相等的量进行补加(2002.5g/次)，使发酵过程中补加总糖质量为4005g。
方式3，五次定量补料：当葡萄糖浓度降为15-25g/L时，分五次相等的量进行补加(801g/次)，使发酵过程中补加总糖质量为4005g。
表1不同葡萄糖补料方式对2-KGA发酵的影响
补料方式 菌体干重(g/L) 2-KGA(g/L) 糖酸转化率(g/g) 生产强度(g/L/h)
对照 5.00 180.1 0.80 3.87
一次定量 5.54 208.1 0.83 4.21
二次定量 5.70 214.2 0.86 4.50
五次定量 5.95 222.7 0.91 5.10
通过比较2-KGA的产量、产率和生产强度发现分五次相等量的补加葡萄糖策略的效果最好(表1)。此时，2-KGA的产量、产率和生产强度分别达到222.7g/L、0.91g/g和5.10g/L/h。出现这种情况的原因是通过补料分批发酵可以降低发酵液中底物的浓度、发酵液黏度，提高菌体对氧和营养成分的利用率，解除高糖浓度对产酸的抑制，提高了葡萄糖向2-KGA的转化速率提高了2-KGA的生产强度。
实施例2硫酸铵补料对发酵结果的影响
在最优葡萄糖补料方式、维持种子和发酵条件以及补料液相同条件下，在基础发酵培养基的初始硫酸铵浓度为5g/L时，分别采用以下三种补料方式进行补料分批发酵。
方式1：一次定量补料：在发酵16h，一次性补加含240g硫酸铵补料液。
方式2：间歇定量补料：在发酵16h补加含64g硫酸铵补料液，22h补加含80g硫酸铵补料液，28h补加含96g硫酸铵补料液。
方式3：间歇恒速补料：在发酵16h，就以1.25g/L的速度流加补料液，直至含240g硫酸铵补料液全部补完。
表2不同硫酸铵补料方式对2-KGA发酵的影响
补料方式 菌体干重(g/L) 2-KGA(g/L) 糖酸转化率(g/g) 生产强度(g/L/h)
对照 5.95 222.7 0.91 5.10
一次定量 7.40 230.2 0.92 5.14
间歇定量 7.48 240.1 0.96 5.20
间歇恒速 7.42 235.1 0.94 5.20
表2表明，硫酸铵的分次添加可以使发酵液中硫酸铵质量浓度维持在一个稳定的水平，既利于菌体的生长又利于葡萄糖向2-KGA的转化。通过比较发现间歇定量补料方式效果最好，2-KGA的产量、糖酸转化率和生产强度分别达到240.1g/L，0.96g/g和5.20g/L/h。选择间歇定量补硫酸铵方式。
实施例3溶氧控制对发酵结果的影响
在实施例1、2的最优补料策略下，考察不同DO浓度对2-KGA合成的影响。
表3不同溶氧水平对2-KGA发酵的影响
补料方式 菌体干重(g/L) 2-KGA(g/L) 糖酸转化率(g/g) 生产强度(g/L/h)
对照 7.48 2401 0.96 5.20
20 7.54 248.7 0.99 5.23
30 7.75 250.4 1.00 5.32
40 8.37 265.8 1.03 6.13
50 8.56 261.4 1.01 5.98
由表3可知，随着DO的升高，菌体量逐步增加，至DO为40％时达最大；当DO升高至50％时，菌体生物量反而减少。当DO控制在40％时，2-KGA产量、得率和产率达到最高，分别为265.8g/L、1.03g/g和6.13g/L/h。由此可见，虽然2-KGA发酵过程中需要氧气，但也并不是DO越高越好。这可能的原因是过多的氧通过形成超氧化物自由基O-2或羟自由基OH-破坏细胞组分，进而对菌体的代谢产生严重的影响。因此，控制DO＝40％为发酵生产2-KGA的适宜溶氧浓度。
结果表明：溶氧控制在40％，在发酵16、22及28h时分别补加64、80和96g硫酸铵，并且当残糖浓度降至15-25g/L时，补加890g葡萄糖，共补加5次时，发酵效果最好。
此时，发酵44h，2-KGA产量达到265.8g/L，产率达到1.03g/g。2-酮基-D-葡萄糖酸的产量由180.1g/L提高至265.8g/L，提高幅度为47.6％，效果显著。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种提高发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸产量的方法，其特征在于，采用沙雷氏菌(Serratia sp.)为发酵菌株，将活化后的菌株接种到发酵培养基，30L发酵罐装有16L发酵培养基，对葡萄糖、硫酸铵进行分批补料，并控制溶氧；所述沙雷氏菌(Serratia sp.)是沙雷氏菌ATCC 39006；在发酵16、22及28h时分别补加64、80和96g硫酸铵；当发酵液中残糖浓度降至15-25g/L时补加801g葡萄糖，共补加5次；所述发酵培养基以g/L计，初始葡萄糖100，初始硫酸铵5，KH2PO4 1，Na2SO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnCl2·4H2O 0.036，FeSO4·7H2O0.036。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵罐是30L发酵罐，起始装液量为16L，发酵温度为30℃，初始搅拌转速500r/min，初始通气量24.0L/min，接种比例为13％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，溶氧控制在40％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，自动流加8mol/L NaOH控制pH值在6.0。
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沙雷氏菌Serratia sp.BK-98发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺优化及动力学研究;张炜等;《化工学报》;20110531;第62卷(第5期);第1372 1.3 培养条件，第1373页2．2 DO对2-KDG合成的影响，第1375页3结论 *

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