CN111334532A - 一种丁酸连续发酵的方法 - Google Patents

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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明提供了一种丁酸连续发酵的方法，涉及丁酸发酵技术领域。本发明所述方法中，丁酸菌进行试管培养、三角瓶深层培养、种子罐扩大培养，而后进行连续发酵。利用本发明所述方法，一个发酵周期可达30天，利用连续循环发酵，在稳定的发酵循环周期内可节约种子原料、种子培养时间及罐体设备等资源；循环发酵在单位时间内，增加了发酵罐批和总产量，增加利润，降低成本。

Description

一种丁酸连续发酵的方法
技术领域
本发明属于丁酸发酵技术领域，具体涉及一种丁酸连续发酵的方法。
背景技术
丁酸是反刍动物瘤胃和杂食动物结肠中微生物发酵碳水化合物的产物，具有较强的杀菌作用，被认为是抗生素的潜在替代物。丁酸与抗生素合用可提高疗效，大量实验表明它无毒副作用，广泛应用于医药、功能性保健食品和动物饲料的添加剂。目前丁酸发酵培养仍大都停留在实验室阶段，产物浓度基本在20～40g/L左右，在工业化生产中，由于丁酸菌为厌氧培养，发酵环境如有氧气存在菌体将不会生长，甚至死亡；另外菌体对生长最佳pH要求严格，若偏离最佳pH则可能得不到目标产物，因此存在发酵效率偏低，成本偏高的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种丁酸连续发酵的方法，所述方法发酵条件合理，成本低廉，产品质量稳定，适合工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种丁酸连续发酵的方法，包括以下步骤：(1)将丁酸菌接种于种子培养基上进行深层培养，得一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种于扩大培养基上进行扩大培养，得二级种子液；
(3)将所述二级种子液移种发酵10～20h后，得第一发酵液；
(4)将所述第一发酵液接种于发酵罐中进行发酵，得第二发酵液，待所述第二发酵液中葡萄糖的质量百分含量低于0.5％时，带放体积量80％的第二发酵液至储罐中，并向所述发酵罐中补入等体积的第一发酵液。
优选的，步骤(1)所述深层培养为将所述丁酸菌接种在500mL的容器中，所述容器中包含200mL的种子培养基。
优选的，所述深层培养的温度为37℃，所述深层培养的时间为10～20h，所述深层培养在厌氧条件下进行。
优选的，步骤(2)所述一级种子液的接种量为2％。
优选的，步骤(2)所述扩大培养为在37℃下震荡培养，所述震荡的转速为200rpm，培养时间12～24h；所述种子培养基包括以下质量百分含量的成分：酵母浸粉1％、蛋白胨0.5％、可溶性淀粉0.1％、葡萄糖0.5％、氯化猛0.01％、氯化钠0.05％和乙酸钠0.3％，余量为水。
优选的，步骤(3)所述移种发酵的接种量为2％。
优选的，所述移种发酵时二级种子液的OD600为1.0～2.0，pH值低于4.0。
优选的，步骤(4)所述发酵时的接种量为10％。
优选的，步骤(4)带放80％的第二发酵液至储罐中后，控制储罐中发酵液的pH为6.0。
本发明提供了一种丁酸连续发酵的方法，丁酸菌进行试管培养、三角瓶深层培养、种子罐扩大培养，而后进行连续发酵。利用本发明所述方法，一个发酵周期可达30天，利用连续循环发酵，在稳定的发酵循环周期内可节约种子原料、种子培养时间及罐体等设备资源；循环发酵在单位时间内，增加了发酵罐批及产量，增加利润降低成本；在一个连续发酵周期内，丁酸总产量相对非连续发酵提高30％。
具体实施方式
本发明提供了一种丁酸连续发酵的方法，包括以下步骤：(1)将丁酸菌接种于种子培养基上进行深层培养，得一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种于扩大培养基上进行扩大培养，得二级种子液；
(3)将所述二级种子液移种发酵10～20h后，得第一发酵液；
(4)将所述第一发酵液接种于发酵罐中进行发酵，得第二发酵液，待所述第二发酵液中葡萄糖的质量百分含量低于0.5％时，带放体积量80％的第二发酵液至储罐中，并向所述发酵罐中补入等体积的第一发酵液。
本发明将丁酸菌接种于种子培养基上进行深层培养，得一级种子液。本发明所述丁酸菌在所述接种前优选还包括进行试管培养，所述试管培养所用的培养基优选包括以下质量百分含量的成分：葡萄糖0.5％、酵母浸粉1％、蛋白胨0.5％和氯化钠0.1％，余量为水。本发明所述试管培养优选为在37℃，200rpm的条件下培养24～48小时。本发明优选将试管中的丁酸梭菌接入至500mL的三角瓶中，所述三角瓶内的种子培养基装量为200mL，在温度为37℃，厌氧条件下于培养10～20h。本发明所述种子培养基优选包括以下质量百分含量的成分：酵母浸粉1％、蛋白胨0.5％、可溶性淀粉0.1％、葡萄糖0.5％、氯化猛0.01％、氯化钠0.05％和乙酸钠0.3％，余量为水。本发明所述种子培养基所用的可溶性淀粉优选包括玉米淀粉，本发明对所述玉米淀粉的来源并没有特殊限定，实施例中选自购于自天津市大茂化学试剂厂的玉米淀粉。
本发明将所述一级种子液接种于扩大培养基上进行扩大培养，得二级种子液。本发明优选将经过三角瓶培养后的丁酸菌按2％的接种量投入15L种子罐中进行扩大培养。本发明所述扩大培养基优选包括以下质量百分含量的成分：酵母浸粉1％、蛋白胨0.5％、可溶性淀粉0.5％、葡萄糖1％和氯化钠0.05％，余量为水。本发明所述扩大培养的温度优选为37℃，所述扩大培养时伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为200rpm，所述扩大培养的时间优选为24～48小时。本发明所述扩大培养基中所用的可溶性淀粉优选优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明将所述二级种子液移种发酵10～20h后，得第一发酵液。本发明所述移种发酵移种发酵的接种量优选为2％。本发明所述二级培养基优选包括以下质量百分含量的成分：酵母浸粉1％、蛋白胨0.5％、可溶性淀粉0.5％、葡萄糖1％和氯化钠0.05％，余量为水。本发明所述移种发酵时，所述二级种子液的OD600值优选为1.0～2.0，pH值低于4.0。本发明所述二级培养基中的可溶性淀粉优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明将所述第一发酵液接种于发酵罐中进行发酵，得第二发酵液，待所述第二发酵液中葡萄糖的质量百分含量低于0.5％时，带放体积量80％的第二发酵液至储罐中，并向所述发酵罐中补入等体积的第一发酵液。本发明所述发酵时的接种量优选为10％。本发明所述发酵罐中的发酵培养基优选包括以下质量百分含量的成分：葡萄糖2％、淀粉0.5％、玉米淀粉0.5％、硫酸铵0.1％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.2％、磷酸二氢钾0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.07％，硫酸锰0.02％和消泡剂0.1％，余量为水。本发明所述消泡剂优选的包括泡敌。本发明所述发酵优选为在37℃的发酵罐中进行，所述发酵罐内的罐压优选为0.01mpa，所述发酵过程中优选伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为200rpm；所述发酵的时间优选为培养48h。本发明在带放体积量80％的第二发酵液至储罐中后，优选控制pH为6.0，将发酵液中甲酸和乙酸继续进行丁酸转化，可用于进行后续丁酸提取。本发明在补入等体积的第一发酵液后，继续进行发酵培养，以此不断重复步骤(4)，发酵周期可达30天(因丁酸梭菌为厌氧发酵，不用担心染菌问题，长时间循环发酵菌体活力下降，导致放罐含量低于40g/L即清洁罐体，重新接种发酵循环培养)。
下面结合实施例对本发明提供的丁酸连续发酵的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
丁酸菌进行试管培养、三角瓶深层培养、种子罐扩大培养，将试管中的丁酸梭菌接入至500mL(装量为200mL)的种子培养基中，在温度为37℃，厌氧条件下于培养12h；将经过三角瓶培养后的丁酸菌按2％的接种量投入15L种子罐中进行扩大培养；二级种子培养10～20小时移种发酵得到第一发酵液进行培养。
发酵培养40～50h得到第二发酵液，检测葡萄糖接近为0.5％以下时，带放80％的第二发酵液至储罐，控制pH在6.0将发酵液中甲酸和乙酸继续进行丁酸转化，检测丁酸含量为50g/L，用于进行后续提取；同时补入等量的第一发酵液，继续进行发酵培养以此循环往复，发酵周期可达30天。(以30天作为一个周期，同一个周期内循环连续发酵总产量(63kg)比非循环连续发酵(48kg)提高30％)。
实施例2
在27t发酵罐验证循环发酵效果，50L一级种子罐培养10～20小时；移种量为2％，移种二级种子罐中进行扩大培养，培养时间10～20小时；移种量为10％，移种发酵培养，培养时间40～50h，控制pH为6.0，过程检测OD，产物浓度，底物浓度，若检测底物中葡萄糖浓度低于0.5％，发酵时间40～50h，含量为50g/L，带放80％的第二发酵液至储罐，控制pH在6.0将发酵液中甲酸和乙酸继续进行丁酸转化，检测丁酸含量为50g/L，用于进行后续提取；同时补入等量的第一发酵液，继续进行发酵培养以此循环往复，发酵周期可达30天，单位周期内中试罐使用循环连续发酵法产量比非循环连续发酵法提高20％～30％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种丁酸连续发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将丁酸菌接种于种子培养基上进行深层培养，得一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种于扩大培养基上进行扩大培养，得二级种子液；
(3)将所述二级种子液移种发酵10～20h后，得第一发酵液；
(4)将所述第一发酵液接种于发酵罐中进行发酵，得第二发酵液，待所述第二发酵液中葡萄糖的质量百分含量低于0.5％时，带放体积量80％的第二发酵液至储罐中，并向所述发酵罐中补入等体积的第一发酵液。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述深层培养为将所述丁酸菌接种在500mL的容器中，所述容器中包含200mL的种子培养基。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述深层培养的温度为37℃，所述深层培养的时间为10～20h，所述深层培养在厌氧条件下进行。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述一级种子液的接种量为2％。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述扩大培养为在37℃下震荡培养，所述震荡的转速为200rpm，培养时间12～24h；所述种子培养基包括以下质量百分含量的成分：酵母浸粉1％、蛋白胨0.5％、可溶性淀粉0.1％、葡萄糖0.5％、氯化猛0.01％、氯化钠0.05％和乙酸钠0.3％，余量为水。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述移种发酵的接种量为2％。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述移种发酵时二级种子液的OD600值为1.0～2.0，pH值低于4.0。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述发酵时的接种量为10％。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)带放80％的第二发酵液至储罐中后，控制储罐中发酵液pH为6.0。
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