CN103725719A - 生产羧酸和/或醇的方法 - Google Patents

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CN103725719A CN201310481989.8A CN201310481989A CN103725719A CN 103725719 A CN103725719 A CN 103725719A CN 201310481989 A CN201310481989 A CN 201310481989A CN 103725719 A CN103725719 A CN 103725719A
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Abstract

本发明涉及通过发酵工艺生产羧酸和/或醇，包括：在有机培养基存在下，使能够产生羧酸和/或醇的固定化微生物在水性培养基中生长，和从所述有机培养基中回收所述羧酸和/或醇；其中所述有机培养基和所述水性培养基的界面处放置一网；以及进一步地其中所述有机培养基包括至少一种有机溶剂和至少一种选自三烷基氧化膦和三烷基胺的萃取剂。

Description

生产羧酸和/或醇的方法
技术领域
本发明涉及生产羧酸和/或醇的方法。
背景技术
羧酸/醇可以用石油或天然气作为起始原料通过化学合成方法来生产或者通过例如发酵糖或淀粉的生物方法来生产。
生物方法与化学合成方法相比具有一定的优势。其一，化学合成方法中常用的石油材料是不可再生的资源，并可能导致产生不需要的副产物。
在可用于生物方法的发酵工艺中，微生物产生羧酸/醇并释放至发酵培养基中。然而，当羧酸/醇在发酵培养基中达到一定浓度后，产生的羧酸/醇可能抑制该微生物的活性和生产力，从而限制发酵工艺的总产率。这种现象通常被称作最终产物抑制。
减轻最终产物抑制的一种途径是在发酵期间从发酵液中分离出羧酸和/或醇，使得它们不会达到抑制浓度。然而，一些常用的去除羧酸/醇的分离工艺（例如，蒸馏或沉淀法）可能会导致更高的生产成本，产生不需要的固体废物，和/或降低工艺的总效率。
发明内容
在本发明的一些实施方式中，公开了一种生产羧酸和/或醇的发酵工艺，该工艺是一种可减轻最终产物抑制问题的整合的溶剂萃取工艺。在一些实施方式中，所公开的工艺可以比传统的主要依赖蒸馏和/或沉淀法回收羧酸/醇的发酵工艺更有效率且更具成本效益。
本发明公开的其他特点和优点部分将在说明书随后提出，部分可从说明书中明显看出，或者通过本发明的实践而得知。本发明的特点和优点将通过在所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
可以理解的是，前面的一般描述和以下详细描述只是示例性和解释性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。
将附图纳入本说明书中并构成本说明书的一部分，解释公开的实施方式，并与说明书一起用来解释某些实施方式的原理。
附图说明
图1A-1B示出了以连续模式进行的示例性的发酵工艺的示意图。
图2提供了一个萃取发酵塔反应器的示意图。
图3示出了在实施例4A所述发酵工艺的水性培养基中葡萄糖、丁酸、丙酸、OD600的浓度。
图4A-C示出了如实施例4F所描述，在不同时间点测得的水性培养基中葡萄糖、乙酸、丁酸和丙酸的浓度，以及发酵约115小时后有机培养基中丁酸的浓度；固定化微生物是PVA-固定的酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）ITRI04001（图4A），丁酸梭菌（C.butyricum）ITRI04003（图4B）或酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）ITRI04004（图4C）。
图5提供了在实施例5中使用的萃取发酵塔反应器的示意图。
图6示出了如实施例6中所述，在不同时间点基础培养基（水性培养基）中以及仅包含油醇作为有机相的反应器中葡萄糖、丁酸和丙酸的浓度。
图7示出了如实施例6中所述，在不同时间点基础培养基（水性培养基）中以及包含1M TOPO的油醇溶液作为有机相的反应器中葡萄糖、丁酸和丙酸的浓度。
具体实施方式
现对本发明实施方式进行详细描述，其实施例在附图中有解释说明。
本发明提供了一种可减轻最终产物抑制问题的用于制备羧酸和/或醇的发酵工艺。
在一些实施方式中，用于制备羧酸和/或醇的发酵工艺包括：使能够产生羧酸和/或醇的微生物在水性培养基中并且在有机培养基存在下生长，和从所述有机培养基中回收所述羧酸和/或醇；其中所述有机培养基和所述水性培养基的界面处放置一固体网；以及进一步地其中所述有机培养基包括至少一种有机溶剂和至少一种选自三烷基氧化膦和三烷基胺的萃取剂。
在一些实施方式中，本发明公开的发酵工艺可用于生产羧酸，如乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、苹果酸、丙烯酸、柠檬酸、葡糖酸、衣康酸、或它们的混合物。例如，本发明公开的发酵工艺可用于生产丁酸。
在一些实施方式中，本发明公开的发酵工艺可用于生产醇，如乙醇、丙醇、丁醇、或它们的混合物。例如，本发明公开的发酵工艺可用于生产丁醇。
在一些实施方式中，能够产生羧酸和/或醇的微生物选自能够产生羧酸如丁酸的细菌。在一些实施方式中，所述微生物选自酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）、热丁酸梭菌（C.thermobutyricum）、丁酸梭菌（C.butyricum）、杨木梭菌（C.populeti）、尸毒梭菌（C.cadaveros）、产纤维二糖梭菌（C.cellobioparum）、匙形梭菌（C.cochlearium）、巴斯德梭菌（C.pasteurianum）、玫瑰色梭菌（C.roseum）、红色梭菌(C.rubrum)和生孢梭菌（C.sporogenes）。
在一些实施方式中，能够生产羧酸和/或醇的微生物选自能够产生醇如丁醇的细菌。在一些实施方式中，所述微生物选自醋酪酸梭状芽胞杆菌（C.acetobutyricum）、拜氏梭菌（C.beijerinckii）、金黄丁酸梭菌（Clostridiumaurantibutyricum）和假破伤风梭菌（C.tetanomorphum）。
在一些实施方式中，能够生产羧酸和/或醇的微生物选自能够将乳酸转化为丁酸的细菌。
在一些实施方式中，能够生产羧酸和/或醇的微生物可用细菌培养领域通常知晓的任何培养基、底物、条件和工艺来培养。
根据微生物的具体要求，应当注意选择适当的生长培养基、pH、温度、搅拌速度、接种量和/或需氧、微需氧或厌氧条件用于发酵工艺。
例如，在一些实施方式中，微生物可能需要在厌氧条件下进行培养。本发明所用的“厌氧条件”是指在气相中氧（O2）的水平低于百万分之0.5。在这种情况下，发酵工艺中使用的水性培养基可能需要用无氧气体如氮气来调节或冲洗以降低培养基中的氧水平。
作为一个非限制性的实施例，微生物可以在约20℃至约80℃的温度范围内培养。例如，微生物可在37℃培养。
在发酵过程中，将微生物接种到固定化形式的水性培养基中。用于固定化的方法和材料可以参考G.F.Bickerstaff出版的“Immobilization of enzymesand cells:methods in biotechnology,vol.1Humana Press,Totowa(1997)”。在一些实施方式中，通过将微生物包埋在天然或合成的聚合物中来制备固定化微生物。适用于包埋微生物的天然或合成的聚合物包括但不限于醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚乙烯醇或聚氨酯。
在一些实施方式中，通过将微生物封装在例如琼脂、明胶或藻酸盐等水凝胶中来制备固定化微生物。
在一些实施方式中，根据Chen,K.C.,“Immobilization of microorganismwith phosphorylated polyvinyl alcohol(PVA)gel,”Enzyme Microbio.Technol.1994,16,679-83中所述的方法，通过将微生物固定在磷酸化的聚乙烯醇（PVA）凝胶珠中来制备固定化微生物。
在一些实施方式中，为了微生物的生长和羧酸/醇的生产，水性培养基可包括适用于培养微生物或促进所需产物生产的任何营养素、成分和/或补充剂。根据Dwidar M.“The Future of Butyric Acid in Industry”.The ScientificWorld Journal,2012,471417中所述的方法，通过微生物来生产酸。作为一个非限制性的实施例，水性培养基可包括至少一种成分，选自：碳源，包括但不限于单糖（如葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖或木酮糖）、二糖（如乳糖或蔗糖）、寡糖以及多糖（如淀粉或纤维素）、一碳底物、和/或它们的混合物；氮源，如铵盐、酵母萃取物或蛋白胨；矿物盐；辅因子；缓冲剂；维生素；和可促进细菌生长的任何其他组分和/或萃取物。
在一些实施方式中，水性培养基的pH可为约3.0至约9.0的范围。作为一个非限制性的实施例，根据所需产物的电离常数和微生物的生长，水性培养基的pH可为约3.0至约6.0的范围。在一些实施方式中，通过在发酵期间加入酸/碱，使水性培养基的pH保持在约3.0至约6.0的范围。
在发酵工艺中，微生物是在有机培养基存在下，在水性培养基中进行生长，其中有机培养基与水性培养基是分离的。有机培养基能够在发酵期间从水性培养基中萃取出羧酸和/或醇。
在一些实施方式中，所述有机培养基包括至少一种有机溶剂和至少一种选自三烷基氧化膦和三烷基胺的萃取剂。
在一些实施方式中，所述至少一种有机溶剂选自C8-C18醇、甘油三酯、C6-C16烷烃和脂肪酸甲基酯。
在一些实施方式中，所述至少一种有机溶剂是油醇。
在一些实施方式中，所述至少一种有机溶剂选自己烷和大豆油。
在一些实施方式中，所述至少一种萃取剂选自三辛胺（TOA）和三辛基氧化膦（TOPO）。
在一些实施方式中，所述至少一种萃取剂在有机培养基中的浓度小于或等于1M，如小于或等于0.9M、0.8M、0.7M、0.6M或0.5M。
在一些实施方式中，所述有机培养基包括三辛胺和油醇。
在一些实施方式中，所述有机培养基包括三辛基氧化膦和油醇。
反应器中的有机培养基和水性培养基的体积比可能取决于多个因素，包括但不限于，微生物的生长类型、反应器的大小、溶剂对产物的分配系数以及所选的发酵模式，正如下面所述。
在一些实施方式中，有机培养基与水性培养基的体积比可为1:5至20:1的范围。更好的体积比可为5:1至15:1的范围。
在发酵工艺中，反应器中放置固体网，以避免固定化微生物与有机培养基直接接触。
在一些实施方式中，在有机培养基和水性培养基的界面处放置固体网。
在一些实施方式中，固体网是由金属或聚合物制成。孔径的直径小于固定化细胞珠的直径，以防止微生物接触到萃取剂。
在一些实施方式中，发酵工艺可用搅拌发酵釜以连续模式进行，例如通常如图1A所示的搅拌釜反应器100。
作为一个非限制性实施例，用于固定化微生物生长的搅拌釜反应器100可配备有由不锈钢制成的圆形网102、机械搅拌器104，温度计（未图示）以及pH计（未图示）。搅拌器、温度计和pH计都可连接到综合控制站106并被综合控制站106控制。水性培养基和有机培养基之间放置圆形网102，以避免固定化微生物与有机培养基直接接触。
此外作为一个非限制性实施例，可在培养基釜108和反应器100之间使用蠕动泵连续地抽取水性培养基。例如，可将水性培养基连续地从培养基釜108引入到反应器100中，并从反应器100返回培养基釜108。或者，可将水性培养基连续地从反应器移除，并且将新鲜的水性培养基连续添加到反应器100中。
再作为一个非限制性实施例，含有羧酸/醇的有机培养基可通过萃取回路110被抽取至分离装置，如蒸馏塔112，以从有机培养基中回收羧酸/醇。分离后，所述至少一种有机溶剂和/或萃取剂可以再循环返回到发酵釜中进行羧酸/醇的进一步萃取。或者，可将新鲜的有机培养基连续添加到发酵釜以补充除去的有机培养基。
在一些实施方式中，反应器可以设置为连续反应器，如图1B中所示。
在连续模式的发酵工艺中，由于不断地从反应器中除去产物，因此会需要较小体积的有机培养基，从而能够使用较大体积的发酵液（水性培养基）。这可导致更高的产物收率。
在一些实施方式中，发酵工艺可以分批发酵模式进行。在这种模式下，在发酵工艺期间，不管水性培养基还是有机培养基都不从反应器中被去除。该模式比上述连续模式简单，但它可能需要较大体积的有机培养基，以尽可能减少水性培养基中抑制产物的浓度。因此，可能要使水性培养基的体积比反应器中有机培养基的体积小。从有机培养基中回收羧酸/醇可通过本领域中已知的任何方法完成，包括但不限于蒸馏、树脂吸附、分子筛分离或沉淀。在一些实施方式中，通过蒸馏从有机培养基中回收羧酸/醇。
鉴于本说明书和本发明公开的实施方式的实践，其他实施方式对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书和实施例应被视作示例性的，本发明的真正范围和精神由所附权利要求书限定。
实施例
实施例1从CGM发酵培养基萃取丁酸
实施例1.1
在37℃下，将50ml含有5%的丁酸的CGM培养基（基础培养基）（溶液的pH减小至4）与5ml的0.7M、1M或1.4M的三辛胺（C24H51N，CASNo.1116-76-3，缩写：TOA）在油醇中混合。下表提供了CGM培养基（基础培养基）的组分。
Figure BDA0000396052850000071
每12小时，通过高效液相色谱法测定CGM培养基（即水相）和三辛胺溶液（即有机相）中的丁酸浓度。
表1示出了以不同浓度的三辛胺萃取的CGM培养基的丁酸分配比。
表1
TOA的浓度 0.7M 1M 1.4M
丁酸分配比(D) 7.38 10.21 13.82
丁酸分配比(D)是通过有机培养基中丁酸的浓度除以水性培养基中丁酸的浓度计算得出：
[001]
Figure BDA0000396052850000072
当比较不同有机溶剂的萃取效率时，分配比越高，萃取效率越好。
表1示出了萃取效率随着有机相中三辛胺的浓度增加而提高。
实施例1.2
在37℃下，将10ml含有1%、2%或5%的丁酸的CGM培养基与10ml的0.1M、0.5M或1M的三辛基氧化膦（C24H51OP，CAS No.78-50-2，缩写：TOPO）在油醇（C18H36O）中混合。用4N NaOH和4N HCl将培养基溶液的pH值调节到4至6的范围。
24小时后，通过高效液相色谱法测定CGM培养基（水相）和TOPO溶液（有机相）中的丁酸浓度。
表2示出以不同浓度的TOPO萃取的CGM培养基的丁酸分配比。
表2
Figure BDA0000396052850000073
Figure BDA0000396052850000081
实施例1.3
在37℃下，将10ml含有1%、2%或5%的丁酸的CGM培养基与10ml的0.1M、0.5M或1M的磷酸三丁酯（C12H27O4P CAS No.126-73-8，缩写：TBP）在油醇中混合。用4N NaOH和4N HCl将培养基溶液的pH值调节到4至6的范围。
24小时后，通过高效液相色谱法测定CGM培养基（水相）和TBP溶液（有机相）中的丁酸浓度。
表3示出了以不同浓度的TOPO萃取的CGM培养基的丁酸分配比。
表3
Figure BDA0000396052850000082
实施例2
将12mg葡萄糖、4mg酵母萃取物、4mg蛋白胨、2.4mg(NH4)2SO4、1.2mg K2HPO4、0.48mg MgSO4·7H2O和0.024mg FeSO4·7H2O溶于0.8ml水中制得培养基。然后，用0.08ml包含C.tyrobutyricum ATCC25755的细菌株接种培养基。在波长600nm处测得初始光密度（OD）为0.2。接种后，将0.8ml有机溶液（如下表4所列）加到培养基上方。然后于37℃在Tecaninfinite200Pro多功能酶标仪中（Tecan Group Ltd.，Switzerland）培养细菌24小时，每30分钟摇一摇。
如下表4所示，在包含TOPO和（1）油醇、（2）异戊醇或（3）乙酸环己酯作为溶剂的有机培养基存在下，细菌的生长速度和葡萄糖消耗速度非常不明显。
表4
Figure BDA0000396052850000091
实施例3
将12mg葡萄糖、4mg酵母萃取物、4mg蛋白胨、2.4mg(NH4)2SO4、1.2mg K2HPO4、0.48mg MgSO4·7H2O和0.024mg FeSO4·7H2O溶于0.8ml水中制得培养基。然后，用0.08ml包含酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）ATCC25755的细菌株接种培养基。在波长为600nm处测得初始光密度（OD）为0.2。接种后，将0.8ml有机溶液（下表4所列）加到培养基上方。然后，于37℃在Tecan infinite200Pro多功能酶标仪中（Tecan GroupLtd.，Switzeriand）培养细菌24小时，每30分钟摇一摇。
如下表5所示，当将TOA/己烷有机溶液加至培养基中时，细菌不能生长和产生丁酸。
此外，当油醇或大豆油作为有机溶液的溶剂时，以1M TOA观察不到细胞生长或者葡萄糖消耗。而且，大豆油似乎几乎不能将丁酸萃取至有机相。
表5
Figure BDA0000396052850000101
实施例4
细菌培养
本实施例使用购自生物资源保存及研究中心（BCRC）的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）（ATCC25755）。原种最初于4℃在厌氧条件下保存在血清瓶中，随后在含有100ml Reinforced Clostridial Medium（RCM，Merck）的血清瓶中进行厌氧预培养，在使用前于37℃搅拌48h。
基础培养基包含如下成分：每升去离子水：5g酵母萃取物、5g蛋白胨、3g硫酸铵、1.5g KH2PO4、0.6g MgSO4·7H2O和0.03g FeSO4·7H2O（Wu et al.,Biotechnology and Bioengineering2003,82(1),93-102）。通过将适宜的底物添加至基础培养基中制备原种。使用前，所有培养基和原种在121℃，15psig高压灭菌30分钟。
细胞固定化
为了生长细胞进行固定化，用约300ml在上述血清瓶制备的细胞悬液接种5L发酵罐，该罐装有4L包括葡萄糖和乳酸作为底物的基础培养基。然后细胞生长7天，直至细胞浓度达到光密度（OD600）约5。
根据Chen,K.,“Immobilization of microorganism with phosphorylatedpolyvinyl alcohol(PVA)gel,”Enzyme Microbio.Technol.1994,16,679-83中所述的方法，以磷酸化聚乙烯醇（PVA）凝胶珠固定细胞。这些细胞通过在6,500rpm（KUBOTA，model7780）离心10min进行收集，并以每升PVA溶液20g湿细胞的比例悬浮在9%（W/V）的PVA水溶液中。在充分混合细胞悬液和PVA溶液之后，将PVA-细胞混合物加入至饱和的硼酸与磷酸钠溶液中，并且轻轻搅拌1-2小时以形成球形珠。将所得的直径为3mm至4mm珠状物用水冲洗。
分析
通过用分光光度计（OPTIZEN，型号2120UV plus）测定细胞悬液在600nm波长处的光密度（OD600）来分析游离细胞密度。
液体产物如有机酸和碳水化合物的分析是在配备Aminex HPX-87H柱（300x7.8mm）（柱温75℃）和折射率检测器的HPLC(Agilent HP-1100)上进行。流动相为18mM H2SO4，流速6ml/min。根据标准校正曲线测定碳水化合物和有机酸的浓度。
实施例4A萃取发酵塔反应器
本实验的目的是研究某种萃取变量（油醇与三辛胺的比，培养液与萃取剂的比，以及萃取时间）对萃取效率、丁酸的选择性和碳发酵量的影响。本实验使用图2所示的100ml玻璃柱反应器200。不锈钢制成的圆形网片202将反应器200分为两部分：上部204具有70ml的工作体积，而下部206具有30ml的工作体积。
对于萃取发酵，反应器200的下部206以约6g按如上所述制备的PVA固定的C.cadaveris细胞株进行接种，然后加入60ml含有10g/L葡萄糖作为底物的基础培养基。然后，将柱反应器200于厌氧室中静置一段时间以减低氧浓度。随后，将12ml萃取剂（油醇:三辛胺=3.24:1）从位于柱反应器顶部的开口注入反应器上部204。然后采用紧口器将反应器200用铝盖密封。
在每一实验中，发酵在37℃搅拌进行（在磁力搅拌台孵化器，速度为100rpm）。萃取发酵持续进行直至因产物抑制不再进一步产生可检测量的丁酸。每一萃取发酵过程重复进行两次用于动力学研究。每隔一定时间（～10小时）从水相中取样，用于分析水相中游离细胞密度、底物和产物浓度。
图3示出了不同时间点发酵物水相中的葡萄糖、丁酸和丙酸以及OD600的浓度。发酵培养基初始含有3.8g/L葡萄糖，其在发酵的首个30小时内被C.cadaveris消耗。在发酵开始约110小时之后，发酵液具有光密度（(OD600）约0.56以及丁酸约1.5g/L。
实施例4B
本实施例中使用的萃取发酵塔反应器与图2所示的类似。反应器的下部装有50ml含有10g/L葡萄糖的基础培养基，并且以约5ml PVA-固定的clostridium tyrobutyricum接种。此外，反应器上部装有50ml表6中列出的含有0.7M三辛胺的不同有机溶剂。发酵在37℃进行100小时。
如表6所示，当双相培养基含有通常用于萃取丁酸的溶剂时，100小时后观察不到明显的细胞生长。
表6
Figure BDA0000396052850000121
(-)表示没有检测到细胞生长
实施例4C
本实施例中使用的萃取发酵塔反应器与图2所示的类似，不同的是反应器的下部装有40ml含有10g/L葡萄糖作为底物的基础培养基，并且以约4mlPVA-固定的酪丁酸梭菌（clostridium tyrobutyricum）接种。此外，反应器上部装有40ml的1M TOPO的油醇溶液或40ml的1M TBP的油醇溶液。发酵在37℃进行100小时。
如表7所示的结果，细胞能够在含有1M的TOPO的油醇溶液作为有机相的反应器中生长，但是不能在含有1M的TBP的油醇溶液中生长。
表7
萃取剂 磷酸三丁酯 三辛基氧化膦
溶剂 油醇 油醇
细胞生长(ΔOD600) 0 6.0
实施例4D
本实施例中使用的萃取发酵塔反应器与图2所示的类似。通过将12g葡萄糖、4g酵母萃取物、4g 蛋白胨、2.4g (NH4)2SO4、1.2g K2HPO4、0.48gMgSO4·7H2O和0.024g FeSO4·7H2O溶于800ml蒸馏水中制得发酵培养基。为进行发酵，将40ml发酵培养基与4ml PVA-固定的酪丁酸梭菌（clostridiumtyrobutyricum）添加到反应器的下部。将40ml含有1M TOPO的三种不同类型溶剂（表5所列）添加到反应器上部。发酵在37℃进行40小时。
如表8所示的结果显示，细胞能够生长并且消耗发酵培养基中的大部分葡萄糖。此外，丁酸已经被萃取至包含TOPO的有机相中。
表8
Figure BDA0000396052850000131
实施例4E
本实施例中使用的萃取发酵塔反应器与图2所示的类似。通过将12g 葡萄糖、4g酵母萃取物、4g 蛋白胨、2.4g (NH4)2SO4、1.2g K2HPO4、0.48gMgSO4·7H2O和0.024g FeSO4·7H2O溶于800ml蒸馏水中制得发酵培养基。为进行发酵，将40ml发酵培养基和4ml PVA-固定的酪丁酸梭菌（clostridiumtyrobutyricum）添加到反应器的下部。将40ml 含有0.7M TOPO的三种不同类型溶剂（表6所列）添加到反应器上部。发酵在37℃进行40小时。
如表9所示的结果显示，细胞能够生长并且消耗发酵培养基中的大部分葡萄糖。此外，丁酸已经被萃取至包含TOA的有机相中。
表9
实施例4F
本实施例中使用的萃取发酵塔反应器与图2所示的类似，不同的是反应器的下部装有40ml含有15g/L葡萄糖作为底物的CGM培养基，并且以约4ml PVA-固定的酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）ITRI04001、丁酸梭菌（C.butyricum）ITRI04003或酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum ITRI）04004接种。此外，反应器上部装有40ml1M TOPO的油醇溶液。发酵在37℃进行115小时。
图4A-C示出了不同时间点发酵培养基中葡萄糖、丁酸和丙酸的浓度，以及在以PVA-固定的酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）ITRI04001（图4A）、丁酸梭菌（C.butyricum ITRI）04003（图4B）或酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）ITRI04004（图4C）培养约115小时后有机溶剂中丁酸的浓度。
表10示出了使用不同细菌类型的发酵培养基（即水相）中pH的变化。
表10
Figure BDA0000396052850000142
实施例5
本实施例中使用如图5所示的2L发酵罐500。与综合控制站（未在图5中示出）连接的pH计安装在发酵罐500中，通过向发酵罐500中添加酸或碱溶液控制发酵培养基的pH。
为进行发酵，发酵罐500的下部502装有约1.0升含有葡萄糖作为底物的基础培养基。然后将该培养基以氮气吹洗至厌氧。进一步以2N NaOH将基础培养基的pH调节至6.0。随后，用按上述方法制备的约100g的PVA-固定的C.tyrobutyricum细胞珠接种该基础培养基。
本实施例中使用如图5所示的萃取发酵塔反应器。反应器的下部装有700ml含有葡萄糖作为底物的基础培养基，并且以约70ml PVA-固定的酪丁酸梭菌（clostridium tyrobutyricum）进行接种。此外，反应器上部装有700ml1M TOPO的油醇溶液或700ml不含TOPO的油醇。发酵在37℃进行40小时，在本实施例中不控制发酵培养基的pH。
图6示出在不同时间点仅含有油醇作为有机相的反应器中基础培养基中的葡萄糖、丁酸和丙酸的浓度。基础培养基的pH在发酵初始时是6.0，发酵结束时降至4.2。
图7示出在不同时间点仅含有1M TOPO的油醇溶液作为有机相的反应器中基础培养基中的葡萄糖、丁酸和丙酸的浓度。基础培养基的pH在发酵初始时是6.0，发酵结束时降至约5.0。
下表11提供了反应器上部不同有机相的发酵结果的同步对比。
表11
Figure BDA0000396052850000151
对本领域的技术人员来说，对本发明公开的实施方式进行各种修改或者变化是显而易见的。可以理解的是说明书和实施例仅是示例性的，本发明的真正范围由所附权利要求书和其等同物来表示。

Claims (19)

1.一种制备羧酸和/或醇的发酵工艺，包括：
在有机培养基存在下，使能够产生羧酸和/或醇的微生物在水性培养基中生长，和
从所述有机培养基中回收所述羧酸和/或醇；
其中所述有机培养基和所述水性培养基的界面处放置一网；和
进一步地其中所述有机培养基包括至少一种有机溶剂和至少一种选自三烷基氧化膦和三烷基胺的萃取剂。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述微生物选自（C.tyrobutyricum）、热丁酸梭菌（C.thermobutyricum）、丁酸梭菌（C.butyricum）、杨木梭菌（C.populeti）、尸毒梭菌（C.cadaveros）、产纤维二糖梭菌（C.cellobioparum）、匙形梭菌（C.cochlearium）、巴斯德梭菌（C.pasteurianum）、玫瑰色梭菌（C.roseum）、红色梭菌（C.rubrum）、生孢梭菌（C.sporogenes）、醋酪酸梭状芽胞杆菌（C.acetobutyricum）、拜氏梭菌（C.beijerinckii）、金黄丁酸梭菌（Clostridium aurantibutyricum）和假破伤风梭菌（C.tetanomorphum）。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述至少一种有机溶剂选自C8-C18醇、甘油三酯、C6-C16烷烃和脂肪酸甲基酯。
4.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述至少一种有机溶剂选自油醇、己烷和大豆油。
5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述至少一种萃取剂选自三辛基氧化膦和三辛胺。
6.根据权利要求5所述的发酵工艺，其中所述至少一种萃取剂是三辛基氧化膦。
7.根据权利要求6所述的发酵工艺，其中所述三辛基膦是以小于或等于1M的浓度存在于有机培养基中。
8.根据权利要求5所述的发酵工艺，其中所述至少一种萃取剂是三辛胺。
9.根据权利要求8所述的发酵工艺，其中所述三辛胺是以小于或等于0.7M的浓度存在于有机培养基中。
10.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述水性培养基的pH是在约3至约6的范围。
11.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述羧酸包括选自乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、苹果酸、丙烯酸、柠檬酸、葡糖酸和衣康酸的至少一种酸。
12.根据权利要求1所述的发酵工艺，其中所述醇包括选自乙醇、丙醇和丁醇的至少一种醇。
13.一种制备丁酸的发酵工艺，包括：
在有机培养基存在下，使能够产生丁酸的微生物在水性培养基中生长，和
从所述有机培养基中回收丁酸；
其中所述有机培养基和所述水性培养基的界面处放置一网；和
进一步地其中所述有机培养基包括至少一种有机溶剂和至少一种选自三烷基氧化膦和三烷基胺的萃取剂。
14.根据权利要求13所述的发酵工艺，其中所述至少一种有机溶剂选自油醇、己烷和大豆油。
15.根据权利要求13所述的发酵工艺，其中所述至少一种萃取剂选自三辛基氧化膦和三辛胺。
16.根据权利要求15所述的发酵工艺，其中所述至少一种萃取剂是三辛基氧化膦。
17.根据权利要求16所述的发酵工艺，其中所述三辛基膦是以小于或等于1M的浓度存在于有机培养基中。
18.根据权利要求15所述的发酵工艺，其中所述至少一种萃取剂是三辛胺。
19.根据权利要求18所述的发酵工艺，其中所述三辛胺是以小于或等于0.7M的浓度存在于有机培养基中。
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