CN103597087A - 丁酸、丁醇及丁酯的制备方法 - Google Patents

丁酸、丁醇及丁酯的制备方法 Download PDF

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Abstract

本公开是有关于丁酸的制备方法，其包括利用一细菌对一原料进行发酵。该原料包括乳酸，或该原料包括乳酸及至少一醣类。

Description

丁酸、丁醇及丁酯的制备方法
本申请主张于2011年4月14日所申请美国临时案61/475,454的优先权，其整体内容引入本文作为参考。
技术领域
此处，公开一种新颖制备丁酸(butyric acid)、丁醇(butanol)及丁酸酯(butyrate ester)的方法。该方法使用乳酸或选择性地使用乳酸及至少一醣类作为原料进行发酵以产生丁酸及丁醇，其较传统仅使用醣类作为碳源的发酵方法具有较高碳产率。
背景技术
丙酮-丁醇-乙醇发酵(acetone-butanol-ethanol fermentation,ABEfermentation)为一种利用细菌发酵以自醣类产生丙酮、丁醇及乙醇的厌氧(anaerobic)制程。该制程亦经常利用来自梭菌纲(Clostridia Class)的菌株。丙酮-丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)是最为知名的菌株，而拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)亦经常被使用。在丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵过程中，先产生丁酸及醋酸，之后，培养基经代谢转换(metabolic shift)再产生例如丁醇、丙酮及乙醇的溶剂。该制程依3:6:1的比例(3份丙酮、6份丁醇及1份乙醇)产生上述溶剂。发酵的实际机制可能相当复杂且难以控制，导致丁醇产率低，且上述溶剂的生产进一步为严重的产物抑制(product inhibition)所限制。该方法曾广泛应用于工业发酵制程。惟自1950年以来，与上述溶剂自石油的生产相较，由于某些缺点使其获利较低，致工业丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵已逐渐为石油化学方法(petroleum chemical methods)所取代。
一般来说，发酵制程受限于低产率、低生产力及低产物浓度。低产率归因于发酵过程中生成二氧化碳所造成基质与产物的低转换率(conversion rate)。发酵过程所产生的挥发性有机化合物包括乙醇或丁醇。此外，由于产生大量(一般为40～50%)二氧化碳，致这些溶剂被称为半燃烧燃料(half-burn fuel)。
随着石油价格波动，自再生资源(renewable resources)生产生质燃料(biofuels)已日趋获重视。研究人员寻求各种改善发酵制程的方法，以提升醣类转换为丁酸或丁醇的产率。然，产率并未显著改善。
例如，美国专利US 7,455,997描述一两步骤发酵制程，其使用包括两多醣类的植物性原料，第一个较易水解，第二个则较难水解。在该制程中，先后以酸及酶对该两多醣类进行水解以产生一发酵产物混合物，例如乙醇、甘油、丙酮、正丁醇、丁二醇、异丙醇、丁酸、甲烷、柠檬酸(citric acid)、反丁烯二酸(fumaric acid)、乳酸、丙酸等。美国专利US 5,132,217教示使用选自果糖、葡萄糖、甘油及蔗糖的营养物质作为主要碳源，于梭菌(Clostridium)存在下进行发酵以产生丁酸。根据此例，34%的碳产率来自葡萄糖，而33%的碳产率来自蔗糖。另一制程描述于美国专利US 2008/0248540，其提供一高达48%(g/g)的产率，为葡萄糖转换为丁酸的理论转换率。此专利亦公开将葡萄糖转换为丁醇的一两步骤制程。
改善碳产率
当使用传统葡萄糖发酵制程并寻求改善之道时，对于生产生质燃料可行性的因素为二氧化碳的生成。在制程中，至少三分之一的碳会因二氧化碳生成而损失。与传统醣类发酵过程相较，本公开提供具有较佳碳转换(carbonconversion)及碳产率(carbon yield)的丁酸及丁醇制备方法。
发明内容
本公开提出一种新颖制备丁酸(butyric acid)的方法，其利用一产丁酸菌(butyric acid-producing bacterium)对一原料进行发酵，其中该原料包括乳酸或选择性地包括乳酸及至少一醣类。
本公开是有关于制备丁酸的方法，其包括以至少一产丁酸菌(butyricacid-producing bacterium)对一原料进行发酵以产生丁酸，其中该原料包括乳酸或选择性地包括乳酸及至少一醣类。例如，该至少一产丁酸菌包括至少一梭菌株(Clostridium strain)。
在部分实施例中，该至少一梭菌株(Clostridium strain)选自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)。在另一实施例中，该至少一梭菌株(Clostridium strain)为酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)。
在部分实施例中，该至少一醣类选自单醣、双醣、多醣及其混合物。在部分实施例中，该至少一醣类选自单醣及双醣，例如，该单醣为葡萄糖(glucose)、木糖(xylose)、半乳糖(galactose)或其混合物，例如，该双醣为乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、纤维二糖(cellobiose)或其混合物。在部分实施例中，该多醣选自淀粉(starch)、肝糖(glycogen)、纤维素(cellulose)及其混合物。在部分实施例中，该至少一醣类包括至少一可溶性醣类，以一酶糖化制程(enzymaticsaccharification process)处理生质物(biomass)而获得。
当该原料包括乳酸(lactic acid)及至少一醣类(carbohydrate)时，在本公开方法的部分实施例中，于该原料中，乳酸与该至少一醣类的重量比介于0.1～10，介于0.3～3，或介于0.5～1.5。
在部分实施例中，该至少一梭菌株(Clostridium strain)为酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)，而该原料包括乳酸及葡萄糖。
在本公开的部分实施例中，该发酵方法所达到的丁酸碳产率(butyriccarbon yield)，高于传统使用醣类作为单一基质的发酵过程的丁酸碳产率，例如，该方法提供一丁酸碳产率(butyric carbon yield)，约高于66%，例如，高于69%的丁酸碳产率。
与传统使用醣类作为单一基质的发酵过程相较，本公开方法产生较少二氧化碳。在部分实施例中，原料中的乳酸转换为丁酸，并不产生二氧化碳。例如，于丁酸的转换中，未产生可侦测量的二氧化碳。
如本公开部分实施例所提供，该发酵步骤持续进行与否取决于当大部分原料已被消耗时，或当观察到丁酸已无显著增加时。例如，该发酵步骤持续进行约10～80小时，例如持续进行约30～75小时。
于该发酵步骤(fermenting step)开始之前或之后，可将乳酸或选择性地将乳酸及至少一醣类以任意顺序分次地加至该原料中。
该发酵方法更包括以化学或生化制程对丁酸进行氢化以产生丁醇。例如，该氢化步骤可以化学氢化进行，例如催化氢化(catalytic hydrogenation)或转移氢化(transfer hydrogenation)。在部分实施例中，该氢化步骤利用至少一产丁醇微生物(butanol-producing microorganism)。例如，该至少一产丁醇微生物的微生物为一梭菌株的溶剂生产相(solventogenesis phase)，所述梭菌株例如，丙酮-丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)及假破伤风梭菌(C.tetanomorphum)。该发酵方法更包括于一催化剂与一醇类存在下，对该丁酸进行酯化以产生一丁酸酯(butyrate ester)。在部分实施例中，该丁酸酯可进一步还原获得丁醇(butanol)。
为让本发明的上述目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举一较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下:
附图说明
图1公开一种用于发酵的悬浮液系统(free suspension system)；
图2公开一种用于发酵的搅拌式反应槽系统(stirred-tank reactor system)；
图3公开一种用于发酵的固定化填充床系统(immobilized pack-bedsystem)；
图4公开使用葡萄糖及L-乳酸作为基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程（顶部）；以及使用葡萄糖作为单一基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程（底部）；
图5公开使用葡萄糖及L-乳酸作为基质以丁酸梭菌(C.butyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程（顶部）；以及使用葡萄糖作为单一基质以丁酸梭菌(C.butyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程（底部）；
图6公开使用葡萄糖及L-乳酸作为基质以拜氏梭菌(C.beijerinckii)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程；
图7公开使用葡萄糖作为单一基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程；
图8公开使用葡萄糖及L-乳酸作为基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程；
图9公开使用L-乳酸作为单一基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程；
图10公开于一搅拌式反应槽系统中以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)和以丁酸梭菌(C.butyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程（顶部图表）；以及于一搅拌式反应槽系统中以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)和以丁酸梭菌(C.butyricum)进行发酵所产生的二氧化碳体积（底部图表）；
图11公开于一搅拌式反应槽系统中以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行重复批次发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程，第一批次基质包括葡萄糖及L-乳酸，第二批次基质包括葡萄糖、L-乳酸及醋酸，第三批次基质仅包括L-乳酸；
图12公开于一搅拌式反应槽系统中使用葡萄糖及L-乳酸作为基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程；
图13公开于一固定化填充床系统中使用木糖及L-乳酸作为基质以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)进行发酵其悬浮细胞、基质及产物浓度的时间历程。
具体实施方式
定义
此处，”酸”一词，例如乳酸及丁酸，包含游离酸(free acid)及这些酸与过程中可存在于培养基的适当基质结合而形成的盐类，举例来说，乳酸可包含游离乳酸、乳酸钠、乳酸铵、乳酸锂、乳酸钙、乳酸钾、乳酸镁及乳酸铝。此外，根据环境pH值，”丁酸”与”丁酸盐”一词可相互替换，以描述该酸或其去质子化(deprotonated)型式。此一概念亦可应用于其他酸，例如乳酸/乳酸盐、丙酸/丙酸盐及醋酸/醋酸盐。
除非另有限定，此处所述的化学名称即指该化学名称的所有异构体形式，例如对映异构体(enantiomers)、非对映异构体(diastereomers)及构象异构体(conformational isomers)。举例来说，”乳酸”、”葡萄糖”、”木糖”、”半乳糖”一词即同时包括D及L异构体。当该醣类可同时存在开环及环状形式时，其椅形(chair form)的构象异构体及α、β异构体均包含在内。
除非文意另有所指，单数形式的”一”及”该”亦包括复数概念。
”大约”一词表示与一提及的数字或数值几乎相同。此处，”大约”一词应理解为包括一特定数量(或数值)的±10%。此外，除非另有所指，在说明书与申请专利范围中所有表示数量的数字，例如浓度、反应条件、时间、温度及产率均以”大约”一词加以修饰。此处，当给定一数字范围时，该范围两端亦包含在内。
”实质地”一词表示真实的价值或重要性或相当大的数值，举例来说，实质地增加或减少表示大于前测量数值5%以上的改变。
此处，”发酵”一词是指例如细菌、酵母菌及其他小有机体的微生物使一或多种物质代谢以产生能量及生存与繁殖所必须化学物质的过程。此化学反应过程将产生某些形式的副产物。当发酵终止时，微生物可产生一系列分子，举例来说，二氧化碳与乙醇即是酵母菌酿造过程中所产生的副产物，而丙酮酸(pyruvate)于乳酸发酵过程中转变为乳酸。发酵(fermentation)为一种产生ATP的过程，以有机化合物作为电子的供应者与接受者，且可发生于厌氧环境下(Berg,M.Jeremy et al.Biochemistry chap.16(2002))。此处，”传统发酵”是指仅使用醣类(carbohydrate(s))作为基质的发酵。
此处，”原料”或”发酵培养基”一词为发酵原料，其可为适合发酵的培养基，亦可进一步包括可发酵基质。该基质可包括，但不限定于，醣类及/或乳酸或其混合物。若有需要，于培养基中亦可存在其他物质，例如可添加氢氧化钠、氢氧化铵(NH4OH)、磷酸二氢钠(NaH2PO3)、磷酸氢二钠(Na2HPO3)、柠檬酸(citric acid)、氯化氢、氯化铵(NH4Cl)以调整原料pH值至一预期数值，例如pH6，或调整其他物理、化学或生理性质。
此处，”微生物”一词是指太小而使裸眼无法看见的生物体，包括细菌、真菌(fungi)、原生动物(protozoans)、藻类(algae)及病毒。
此处，细菌株可为野生株或突变株。接种量(inoculum size(w/v))是指细胞(例如固定化细胞颗粒)重量相对于原料总体积的比例。
评估碳保留效率
此处，”碳产率”一词是指在一化学或生物转换中，保留于预期产物中的碳数(number of carbons)相对于基质中的碳数。
碳产率=预期产物中的碳数/基质中的碳数
为评估预期产物中碳保留的效率，于利用不同原料及细菌的发酵过程中进行”碳产率”的比较。举例来说，在一利用葡萄糖作为基质以产生丁酸或丁醇的发酵过程，可能的化学转换为：
葡萄糖(C6H12O6)→1丁酸(C4H8O2)+2二氧化碳(CO2)+2氢(H2)
葡萄糖(C6H12O6)→1丁醇(C4H10O)+2二氧化碳(CO2)+水(H2O)
在传统发酵过程中，1分子的葡萄糖(C6H12O6，6个碳)转换产生1分子的丁酸(C4H8O2，4个碳)或1分子的丁醇(C4H10O，4个碳)，因此，丁酸或丁醇碳产率为4/6=0.66。然，测量的碳产率往往低于理论碳产率。
当丁酸为发酵过程中的主要产物时，”丁酸碳产率(butyric carbon yield)”可作为碳保留效率的指标。举例来说，在一利用葡萄糖及乳酸作为基质的发酵过程，丁酸碳产率可以如下表示：
丁酸碳产率=丁酸中的碳数/原料(葡萄糖+乳酸)中的碳数
在发酵过程中，气体产物-二氧化碳(CO2)通常非为预期产物，通常视为”碳损失(carbon loss)”。然，醋酸及丙酸(propionic acid)为发酵过程中常见的产物，且可视为”总碳产率”中的预期产物。对于一产生大量醋酸及/或丙酸的发酵过程来说，其更适合以”总碳产率”评估碳保留效率。举例来说，一利用葡萄糖及乳酸作为基质的发酵过程的总碳产率如下表示：
总碳产率=预期产物(丁酸+丙酸+醋酸)中的碳数/原料(乳酸+醣类)中的碳数
提升碳产率
此处提供一种新颖的产生丁酸及丁醇的方法，其可提升碳转换(carbonconversion)及碳产率(carbon yield)，特别是丁酸碳产率。
在部分实施例中，上述结果是藉由使用乳酸或选择性地使用乳酸及至少一醣类作为发酵过程的基质而达成。藉由在发酵过程中使用上述两者的结合作为原料，与传统仅使用醣类作为基质的发酵过程相较，可达到较高碳产率，特别是丁酸碳产率。举例来说，目前所公开的方法中，丁酸碳产率约可超过66%(或0.49g/g)，其为传统发酵过程(假设使用醣类进行于传统发酵机制)的理论丁酸碳产率。不为特定理论所约束，乳酸发酵进行于未包含产生二氧化碳的不同生化路径。此或许可解释为何此处所公开方法的总碳产率超过传统丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol,ABE)路径的理论碳产率。
进行一比较性发酵过程研究，其使用乳糖(lactose)作为单一基质及使用酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)。此发酵过程可包含不同生合成路径。虽于48小时后可定量碳产率，然，与其他发酵过程相较，此发酵过程产生大量(约50%)醋酸及丙酸(propionic acid)，因此，丁酸碳产率相对较低(约50%)。
乳酸或选择性结合乳酸及至少一醣类的发酵过程
此处公开产生丁酸的方法，其包括以至少一产丁酸菌(butyricacid-producing bacterium)对原料进行发酵以产生丁酸，其中该原料包括乳酸或选择性地包括乳酸及至少一醣类。
此公开的方法可藉由对包括乳酸或选择性地包括乳酸及至少一醣类的原料进行发酵而增加丁酸的碳产率。假设丁酸为唯一发酵产物(fermentationproduct)，该转换的化学式如下：
1乳酸(C3H6O3)+3H++3e-→0.75丁酸(C4H8O2)+1.5H2O
理论转换率(theoretical conversion rate)为0.73g/g，碳产率为100%。
此外，上述方法以至少一产丁酸菌(butyric acid-producing bacterium)对包括乳酸或选择性地包括乳酸及至少一醣类的原料进行发酵以产生丁酸。上述产丁酸菌例如为一梭菌株(Clostridium strain)，该梭菌株包括，但不限定于酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、嗜热丁酸梭菌(C.thermobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、波氏梭菌(C.populeti)、尸体梭菌(C.cadaveros)、产纤维二糖梭菌(C.cellobioparum)、匙形梭菌(C.cochlearium)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、蔷薇色梭菌(C.roseum)、深红梭菌(C.rubrum)及产孢梭菌(C.sporogenes)；例如酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)。
适合于此丁酸产生方法的醣类包括，但不限定于可发酵单醣、双醣、多醣及其混合物。上述单醣可为五碳醣或六碳醣。五碳醣包括，但不限定于阿拉伯糖(arabinose)、来苏糖(lyxose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)及其混合物；例如木糖(xylose)。六碳醣包括，但不限定于阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖(galactose)、塔罗糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖(fructose)、山梨糖(sorbose)、塔格糖(tagatose)及其混合物；例如葡萄糖及果糖；例如葡萄糖。上述双醣包括，但不限定于蔗糖(sucrose)、乳酮糖(lactulose)、乳糖(lactose)、麦芽糖(maltose)、海藻糖(trehalose)、纤维二糖(cellobiose)及其混合物；例如乳糖、蔗糖及纤维二糖；例如乳糖。上述多醣包括，但不限定于环糊精(cyclodextrin)、淀粉(starches)、肝糖(glycogen)、阿拉伯聚糖(arabinoxylans)、纤维素(cellulose)、关华豆胶(guar gum)、阿拉伯胶(gum arabic)、几丁质(chitin)及果胶(pectins)。上述醣类可为可溶性醣类，以一酶糖化制程(enzymatic saccharification process)处理生质物(biomass)而得到。适合的生质物原料来源包括例如玉米穗轴(corn stovers)、玉米芯(corn cobs)与稻草(rice straw)的农业废弃物及例如玉米纤维的加工废弃物。适合用于糖化制程的微生物包括，但不限定于细菌、酵母菌及丝状真菌(filamentous fungi)。
当原料包括乳酸及至少一醣类时，于此原料中，乳酸与该至少一醣类的重量比可介于0.1～10，例如介于0.3～3，或介于0.5～1.5。
除非另有限定，”碳产率”是指”丁酸碳产率”或”总碳产率”，不论丁酸是否为主要产物，即作为一般碳保留效率(carbon retention efficiency)的指标。此处所公开利用乳酸或选择性地利用乳酸及至少一醣类作为原料的方法提供高的”丁酸碳产率”及”总碳产率”，其”丁酸碳产率”及”总碳产率”可高于45%，高于50%，高于55%，高于60%，高于66%，高于67%，高于68%，高于70%，高于72%，高于73%或高于82%，其”丁酸碳产率”及”总碳产率”可介于45%～100%，介于50%～100%，介于55%～95%，介于60%～90%，介于63%～90%，介于66%～90%，介于67%～85%或介于69%～85%。
丁酸碳产率(butyric carbon yield)及总碳产率(total carbon yield)会因多项原因而改变，例如细菌的科(family)及株(strains)、细菌是否固定化或为悬浮液、醣类、乳酸与醣类的浓度及比例、温度、发酵槽的搅拌速度、发酵模式(批次、连续等)。在另一实施例中，于适当发酵条件下，此发酵过程可较传统仅使用醣类作为基质的发酵过程提供较高的丁酸碳产率。较高的丁酸碳产率可藉由(1)抑制醋酸、丙酸及其他产物的生成，及/或(2)减少二氧化碳产生及最小化碳损失(carbon loss)而达成。丁酸碳产率可超过66%(理论(最大)丁酸碳产率)。举例来说，丁酸碳产率可大于66%，大于67%，大于68%，大于70%，大于72%，大于73%，大于75%，大于82%，例如介于66%～90%，介于67%～88%，介于69%～85%。
举例来说，原料中的乳酸(lactic acid)可转换为丁酸(butyric acid)及其他少量产物，而发酵过程中仅产生少量或不产生二氧化碳(CO2)。在所公开的发酵过程中，乳酸转换为丁酸的效率可由以下评估：
乳酸转换为丁酸的碳产率=所产生丁酸中的碳数/乳酸中的碳数
在一利用结合乳酸与醣类作为基质的发酵试验中，产自乳酸的丁酸是藉由对所产生的总丁酸减去醣类所产生的理论(最大)丁酸而计算得到。假设醣类(例如葡萄糖)以理论效率(约66%碳产率)进行转换，与传统仅使用醣类作为基质的发酵过程相较，此处，乳酸仍可产生高的碳产率。举例来说，乳酸可产生高于45%，高于55%，高于60%，高于65%，高于70%，高于80%，高于90%及100%的高碳产率。
目前所公开的发酵过程可较传统发酵过程产生更低二氧化碳。原料中的乳酸可转换为丁酸，并伴随产生低于1摩尔当量的二氧化碳，例如低于0.5摩尔当量的二氧化碳。在其他实施例中，原料中的乳酸转换为丁酸，并不产生二氧化碳。
此处，所公开方法的发酵时间取决于多项因素，例如发酵时间(fermentationtime)可取决于细菌株、基质浓度、操作模式等。乳酸可较醣类更快或更慢消耗，或两者以相同速度消耗。在许多情况下，于所有基质均消耗完毕后，仍会产生丁酸及其他产物，持续进行发酵，直至大部分基质已被消耗及/或观察到丁酸已无显著增加。举例来说，由于产物抑制(product inhibition)，于一特定时间后，丁酸的量通常会停止增加甚或减少。发酵过程的时间可能持续10～80小时，例如持续20～80小时，持续30～75小时，持续35～70小时或持续40～55小时。
将基质及细菌添加至原料的顺序可依任意顺序添加并无限制。于发酵过程开始之前及期间，每一基质可添加多次。乳酸及醣类可依任意顺序连续或分次添加至原料。举例来说，于接种(inoculation)之前，可制备包含所有基质的原料。于接种后，可将一或多个基质重复地添加至原料。具体而言，又例如可以是在发酵步骤(fermenting step)开始之前，先将包含醣类的原料与细菌进行培养，于发酵开始后，再将乳酸或乳酸及至少一醣类添加至该原料中，持续进行发酵反应产生丁酸。在其他一些实施例中，原料可与细菌(例如固定化细胞颗粒(immobilized cell beads))分离并自发酵槽移除。之后，将新鲜原料添加至发酵槽中留下的细菌以启动第二次发酵。上述操作可适当地重复多次。
在部分实施例中，原料(feedstock)包括乳酸(lactic acid)及至少一醣类(carbohydrate)，而乳酸与醣类的比例可作改变。举例来说，乳酸与醣类的重量比可介于0.1～10，例如介于0.3～3，介于0.5～1.5。在另一实施例中，该比例可大约为1。
由发酵过程所产生的丁酸可进一步转换为其他有机分子，例如丁醇。举例来说，丁酸可经氢化产生丁醇。该氢化步骤可为一化学氢化，例如催化氢化(catalytic hydrogenation)或转移氢化(transfer hydrogenation)，其在金属催化剂存在下，藉由氢气或氢供应者(hydrogen donor)对丁酸进行还原。可利用一产丁醇微生物(butanol-producing microorganism)进行上述氢化步骤。该产丁醇微生物例如为一细菌或一细菌的溶剂生产相(solventogenesis phase)，例如一梭菌(Clostridium)。适合参与上述转换的梭菌株包括，但不限定于丙酮-丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)及假破伤风梭菌(C.tetanomorphum)。由发酵过程所获得的丁酸例如在催化剂与醇类存在下可进一步酯化产生丁酸酯(butyrate ester)，例如美国专利(U.S.Patent Application Publication No.2010/0124773)所载的方法。利用一胺类溶剂可自发酵原料萃取出丁酸。催化剂包括，但不限定于脂解酶(lipase)。醇类包括，但不限定于甲醇、乙醇、丙醇及丁醇。催化剂可为一酶，例如脂解酶(lipase)。若醇类为丁醇，或具有一或多种例如己烷、丙酮、乙腈、环己烷、2-辛醇、阿拉明叔胺(Alamine)336的溶剂及其混合物，即可在无溶剂状态下进行酯化。利用化学或生化方法可进一步将产生的丁酸酯还原为丁醇。
发酵装置
发酵过程可依批次、馈料批次(fed-batch)或连续模式进行，以最适化产率或降低生产成本。适合本公开发酵过程的装置可为一悬浮液系统，如图1所示。该系统包括一原料26，具有一细胞悬浮液，置于一发酵槽10。发酵槽10配有一机械式搅拌器12、一温度计14与一pH计16，均连接至一整合式控制台(integrated control station)30或由整合式控制台30控制之。整合式控制台30藉由添加一酸溶液32与一碱溶液34通过管(70、72)至发酵槽10的一酸入口18与一碱入口20以控制发酵过程的pH值，以及藉由一恒温器36控制发酵温度，以及控制搅拌速度38。可选择性地将一气体收集装置(gas collecting device)50附于发酵槽10的任意位置，藉由位于发酵槽10顶部的一气体出口22及管74收集发酵过程所产生例如二氧化碳及氢气的气体。产生的气体可藉由气相层析法(gas chromatography)进行分析。
在另一实施例中，本公开方法包括先将细胞固定于例如聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的颗粒(beads)中。举例来说，可将细胞颗粒加至充满原料的瓶中，而于密封瓶中进行发酵。
在另一实施例中，本公开方法使用固定化细胞颗粒(immobilized cell beads)于一搅拌式反应槽系统，如图2所示。该系统包括固定化细胞颗粒24与一原料26，置于一发酵槽10。发酵槽10配有一机械式搅拌器12、一温度计14与一pH计16，均连接至一整合式控制台(integrated control station)30或由整合式控制台30控制之。整合式控制台30藉由添加一酸溶液32与一碱溶液34通过管(70、72)至发酵槽10的一酸入口18与一碱入口20以控制发酵过程的pH值，以及藉由一恒温器36控制发酵温度，以及控制搅拌速度38。可选择性地将一气体收集装置(gas collecting device)50附于发酵槽10的任意位置，藉由位于发酵槽10顶部的一气体出口22及管74收集发酵过程所产生例如二氧化碳及氢气的气体。产生的气体可藉由气相层析法(gas chromatography)进行分析。
此外，固定化细胞颗粒可使用于包括一发酵槽与一填充床生物反应器(pack-bed bioreactor)的一再循环式填充床发酵系统(recirculating pack-bedfermentation system)，如图3所示。该系统包括一原料26，置于一发酵槽10。发酵槽10配有一机械式搅拌器12、一温度计14与一pH计16，均连接至一整合式控制台(integrated control station)30或由整合式控制台30控制之。整合式控制台30藉由添加一酸溶液32与一碱溶液34通过管至发酵槽10的一酸入口18与一碱入口20以控制发酵过程的pH值，以及藉由一恒温器36控制发酵温度，以及控制搅拌速度38。该发酵系统亦包括一填充床生物反应器60。填充床生物反应器60包括固定化细胞颗粒62，其藉由再循环回路64与搅拌式发酵槽10连接。整合式控制台30亦包括一泵40，以将原料26藉由再循环回路64自发酵槽10顶部传输至填充床生物反应器60底部。发酵过程所产生的气体藉由位于发酵槽10顶部的一气体出口22与位于填充床生物反应器60顶部的一气体出口66以及管74释放至选择性设置的一气体收集装置50。收集的气体可藉由气相层析法(gas chromatography)进行分析。
实施例
除非另有所指，此处，将采用传统细胞生物(cell biology)、细胞培养(cellculture)及发酵技术实施本公开。上述技术将于文中作完整说明。
培养基
此处所使用的微生物包括酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)(ATCC25755)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)(IAM19001)及拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)(ATCC8260)，皆购自生物资源保存及研究中心(BioresourceCollection and Research Center,BCRC)。将储存培养基(stock culture)存放于血清瓶并置于4℃厌氧环境。使用前，取包含100ml强化梭状芽孢菌培养基(Reinforced Clostridial Medium,RCM;Merck)的一血清瓶，对其储存培养基进行厌氧预培养(pre-cultured)，于37℃搅拌48小时。
基础培养基(basal medium)于每升去离子水中包含以下成分：5g酵母菌萃取物(yeast extract)、5g蛋白栋(peptone)、3g硫酸铵(ammonium sulphate)、1.5g磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.6g含水硫酸镁(MgSO4·7H2O)及0.03g含水硫酸铁(FeSO4·7H2O)(请参见Wu et al.,Biotechnology and Bioengineering 2003,82(1),93-102)。将适当基质(substrate)加入基础培养基以制备原料(feedstock)。使用前，对所有培养基及原料进行121℃、15psig高压灭菌消毒30分钟。
细胞固定
为使细胞生长以便进行固定化(immobilization)，将约300ml于血清瓶中所制备的细胞悬浮液接种于5L发酵槽，该发酵槽充满4L以葡萄糖及乳酸作为基质的基础培养基。之后，允许细胞生长7天，直至细胞浓度约达光密度(OD600)=5。
根据Chen,K.所公开方法(请参见“Immobilization of microorganism withphosphorylated polyvinyl alcohol(PVA)gel.”Enzyme Microbiob.Technol.1994,16,679-83)，将细胞固定于磷酸化聚乙烯醇凝胶颗粒(phosphorylated PVA-gelbeads)。藉由离心(6,500rpm)(KUBOTA,model 7780)10分钟收集细胞并将其悬浮于一聚乙烯醇(PVA)水溶液(约为9%(w/v);即每升聚乙烯醇(PVA)溶液具有20g湿细胞的比例)。将细胞与聚乙烯醇(PVA)溶液完全混合，之后，将聚乙烯醇-细胞(PVA-cell)混合物滴至饱和硼酸(boric acid)与磷酸钠(sodium phosphate)溶液并轻微搅拌1～2小时，以形成球状颗粒。将所形成直径3～4mm颗粒以水进行清洗。
分析
以一分光亮度计(OPTIZEN,model 2120UV plus)测量细胞悬浮液于波长600nm(OD600)的光密度以分析悬浮细胞密度(free cell density)。
以配有Aminex HPX-87H管柱(300x7.8mm)、75℃管柱恒温器(columnoven)及折射率侦测器(refractive index detector)的高效液相层析仪(HPLC)(Agilent HP-1100)分析例如有机酸及醣类的液体产物。流动相为18mM硫酸(H2SO4)，其流速为6ml/min。根据标准校正曲线，决定醣类及有机酸的浓度。
以配有ShinCarbon ST 100/120mesh管柱(2meterx1mm ID micropacked)的气相层析仪(GC)(YL6100GC)分析例如二氧化碳及氢气的气体产物。将注射器及侦测器的温度分别设定为100℃及200℃。载流气体为氦，流速为10ml/min。将滞留时间与标准滞留时间作比较，以定义出二氧化碳峰。
【实施例1】于悬浮细胞悬浮液系统中的批次发酵
进行酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)三梭菌株的批次发酵。于一悬浮液系统(如图1所示)中进行该试验。该系统包括一2L发酵槽以及一pH计，连接至一整合式控制台。该整合式控制台藉由添加酸/碱溶液至发酵槽以控制发酵过程的pH值。
于1.0L以葡萄糖及L-乳酸作为基质(浓度请见表1)的原料中进行每一发酵过程。以氮气曝气培养基以达厌氧状态(anaerobiosis)。于接种100ml如上所制备的细胞悬浮液之前，以2N氢氧化钠调整原料pH值至6.0。于37℃进行每一试验并利用2N氢氧化钠溶液将pH值控制在大约6±0.1。持续进行发酵，直至由于产物抑制(product inhibition)停止产生可侦测的丁酸。对于酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)及丁酸梭菌(C.butyricum)，另进行仅使用葡萄糖作为基质的分离发酵，以比较碳产率及模拟传统葡萄糖发酵。持续进行每一发酵过程，直至观察无丁酸浓度的增加。发酵时间限定于表1。
重复每一批次发酵过程两次，以进行发酵动力学研究。于固定间隔取样，以分析悬浮细胞(free cell)、基质及产物浓度。浓度的时间历程公开于图4～图6。每一发酵过程的丁酸碳产率、产自乳酸的丁酸碳产率及发酵时间整理于下表1。图中的水平虚线代表产自葡萄糖的丁酸其理论的最大浓度。
表1 使用不同细菌的发酵过程其碳产率的比较
Figure BDA0000395444520000161
*1发酵时间显示于括号内。
*2产率过少未测出。
*3使用葡萄糖作为单一基质的试验。
碳产率(carbon yield)随使用在发酵过程中的梭菌株(Clostridium strain)而变化。酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)总的来说提供56%丁酸碳产率，而乳酸本身提供48%碳产率(假设葡萄糖转换为丁酸的转换率为其理论产率66%)，请参阅图4。当使用丁酸梭菌(C.butyricum)时，一部分乳酸为该菌株所使用，然，在整个发酵过程中，大量乳酸残留的现象并无改变(请参阅图5，顶部)。此即表示，该特定菌株并未如酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)一般能有效地转换乳酸，然，仍会消耗乳酸。此观察与使用葡萄糖作为单一基质的发酵过程的结果(请参阅图5，底部)一致，其提供一可比较的碳产率(40%(有乳酸)，37%(无乳酸))。最后，使用拜氏梭菌(C.beijerinckii)的发酵过程在发酵过程的第一个20小时内消耗葡萄糖，然，该细菌却以一相当慢的速度转换乳酸。于发酵80小时后，约2/3的乳酸为该菌株所消耗，而约1/3未反应的乳酸留于发酵槽中(请参阅图6)。在此实施例中，酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)以几乎相同的效率转换葡萄糖及乳酸，且两者于30小时后完全消耗。此反应总的来说提供56%丁酸碳产率，而乳酸本身提供48%碳产率(假设葡萄糖转换为丁酸的转换率为其理论产率(66%))。
【实施例2】于密封瓶中的固定化细胞颗粒
在实施例2中，探讨乳酸-醣类结合对于密封瓶中固定化酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)颗粒进行发酵所得碳产率的影响。在此实施例中，利用一改良基础培养基(以磷酸盐缓冲溶液(包含0.2M磷酸氢二钠(Na2HPO4)与0.2M磷酸二氢钠(NaH2PO4))取代蒸馏水)制备原料。第一次试验的原料仅以3.3g/L葡萄糖作为基质。第二次试验的原料以3.3g/L葡萄糖及5.9g/L L-乳酸作为基质。第三次试验的原料仅以5.7g/L L-乳酸作为基质。
于每次试验，将100mL原料置于一168mL血清瓶，并使用一磷酸盐缓冲溶液(包含0.2M磷酸氢二钠(Na2HPO4)与0.2M磷酸二氢钠(NaH2PO4))以维持整个试验过程中培养基的pH值。以氮气曝气培养基以达厌氧状态(anaerobiosis)。于接种5g聚乙烯醇固定化酪丁酸梭菌颗粒(PVA-immobilized C.tyrobutyricumbeads)之前，将原料pH值调整至6.0。
于37℃，以150rpm搅拌速度进行每一试验。持续进行发酵，直至侦测到无丁酸浓度的增加。重复每一批次发酵过程两次，以进行发酵动力学研究。于固定间隔取样，以分析悬浮细胞、基质及产物浓度。浓度的时间历程公开于图7～图10。基质起始浓度及碳产率整理于下表2。图中的水平虚线代表产自葡萄糖的丁酸其理论的最大浓度。
表2 使用不同基质的发酵过程其碳产率的比较
原料 葡萄糖 乳酸/葡萄糖 乳酸
图式 图7 图8 图9
葡萄糖(g/L) 3.3 3.3 -
L-乳酸(g/L) - 5.9 5.7
乳糖(g/L) - - -
丁酸碳产率 61% 69% 73%
总碳产率 93% 74% 96%
发酵时间 27小时 27小时 27小时
当使用葡萄糖作为单一基质时，如第一次试验，其总碳产率与丁酸碳产率之间的差异大于当使用葡萄糖与L-乳酸的结合，此因在发酵过程中产生较大量的醋酸及丙酸，请参阅图7。此外，该丁酸碳产率(61%)明显高于悬浮细胞发酵过程的丁酸碳产率(请见表1，36%)，此因固定化细胞颗粒可长时间重复使用，致产生细胞适应(cell adaptation)承受较高丁酸浓度，而获得较高丁酸碳产率。使用原料包含葡萄糖与L-乳酸的第二次试验提供69%丁酸碳产率(高于理论产率)，其抑制醋酸及丙酸的产生(其总碳产率与丁酸碳产率之间的差异仅5%)，参阅图8。第三，当使用L-乳酸作为单一基质时，产生相当大量的丁酸，然，亦会产生醋酸及丙酸(其总碳产率与丁酸碳产率之间的差异为23%)，请参阅图9，其总碳产率为96%，已非常接近理论值100%。鉴于以上，在发酵过程中，将乳酸与醣类结合作为基质已超过传统发酵过程使用葡萄糖作为单一基质所预期的结果，在部分情况下，可视为提升丁酸碳产率的协同作用。
【实施例3】批次发酵-固定化搅拌式反应槽
在实施例3中，探讨细菌对于利用一固定化搅拌式反应槽系统进行发酵所得碳产率的影响，请参阅图2。该系统包括一2L搅拌式发酵槽。该搅拌式发酵槽配有一机械式搅拌器以及一pH计，连接至一整合式控制台(integratedcontrol station)。该整合式控制台藉由添加酸或碱溶液至发酵槽以控制发酵过程的pH值。当固定化细胞颗粒加至发酵槽时，即开始进行发酵。发酵过程所产生的气体藉由位于发酵槽顶部的出口进行收集并以气相层析法(gaschromatography)分析之。
对于酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)及丁酸梭菌(C.butyricum)，于一搅拌式发酵槽进行批次发酵。于发酵槽充满以葡萄糖及L-乳酸作为基质(浓度请见表3)的原料后，以氮气曝气培养基以达厌氧状态(anaerobiosis)。于接种70g固定化聚乙烯醇细胞颗粒(PVA-immobilized cell beads)(包含酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)或丁酸梭菌(C.butyricum))之前，以2N氢氧化钠调整培养基pH值至6.0。于37℃，以600rpm搅拌速度进行发酵，并维持pH值大约6±0.1。持续进行此反应，直至由于产物抑制(product inhibition)停止产生丁酸。
重复批次发酵过程两次，以进行发酵动力学研究。于固定间隔取样，以分析悬浮细胞、基质及产物浓度。收集发酵过程所产生的气体(例如氢气或二氧化碳)并以气相层析仪(GC)分析之。浓度的时间历程及二氧化碳体积公开于图10。基质起始浓度及碳产率整理于下表3。图中的水平虚线代表产自葡萄糖的丁酸其理论的最大浓度。
表3 使用不同细菌的固定化搅拌式反应槽其发酵过程的碳产率
细菌 酪丁酸梭菌 丁酸梭菌
葡萄糖(g/L) 12.8 13.0
L-乳酸(g/L) 15.1 15.2
丁酸碳产率 67% 51%
总碳产率 69% 52%
发酵时间 64小时 64小时
在传统发酵过程(无乳酸，含12.9g葡萄糖)中，自葡萄糖所产生的理论二氧化碳为：
= 12.9 g 180 g / mol × 2 ( mol / mol ) × 22.4 ( L / mol ) = 3.2 L
监测发酵过程所产生的二氧化碳。如图10的底部图表所示，整个过程中，所观察二氧化碳的累积量低于1.0L(低于0.5摩尔当量)，远低于传统仅使用葡萄糖的发酵过程所预测的理论量。此表明其具有不同生合成路径，于发酵过程中可降低二氧化碳生成。
【实施例4】重复批次发酵
在实施例4中，探讨藉由重复使用相同固定化细胞颗粒于一搅拌式反应槽系统所进行的重复批次发酵，如实施例3及图2所载。
于一2L搅拌式发酵槽进行酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)的批次发酵。在第一发酵循环中，使用1.0L包含葡萄糖(13g/L)及L-乳酸(15g/L)的原料。以氮气曝气培养基以达厌氧状态(anaerobiosis)。于接种70g固定化酪丁酸梭菌颗粒(immobilized C.tyrobutyricum beads)(接种量(inoculum size)约为5%(w/v))之前，以2N氢氧化钠调整培养基pH值至6.0。于37℃，以600rpm搅拌速度进行试验，并维持pH值大约6±0.1。于固定间隔取样，以分析悬浮细胞、基质及产物浓度。浓度的时间历程公开于图11。基质起始浓度及碳产率整理于下表4。持续进行发酵，直至不再产生丁酸(约发酵开始后的70小时)。移除原料，将细胞颗粒留于发酵槽。丁酸碳产率为65%，而乳酸的丁酸碳产率为64%(假设葡萄糖以理论产率66%进行转换)。图11中的水平虚线代表产自葡萄糖的丁酸其理论的最大浓度。
表4 重复批次发酵的碳产率
Figure BDA0000395444520000201
在第二批次中，于第80小时，将包含额外醋酸的新鲜原料添加至发酵槽，即使醋酸浓度高，在反应过程中仍会产生丁酸。因人为添加醋酸可能引起的产物抑制似乎并未抑制丁酸生成。其基质与乳酸的丁酸碳产率(63%、60%)仅稍低于第一批次的丁酸碳产率(65%、64%)。于40小时后终止发酵并移除原料。在第三批次中，以相同固定化细胞颗粒对仅含L-乳酸的新鲜原料进行发酵。乳酸转换为丁酸的碳产率为68%。此试验证明即使在一高醋酸浓度下，于重复批次发酵(repeated batch fermentation)中藉由重复利用固定化细胞颗粒仍可达成再现碳产率(reproducible carbon yields)。其亦证明在固定化细胞颗粒存在下，每一基质可分次地加至原料(发酵液)中。
【实施例5】
在实施例5中，提供使用固定化酪丁酸梭菌颗粒(immobilized C.tyrobutyricum beads)的发酵过程，其程序及发酵系统大体与实施例3所描述者类似。
于一2L搅拌式发酵槽进行批次发酵。于发酵槽充满包含葡萄糖(15g/L)及L-乳酸(15g/L)的原料后，以氮气曝气培养基以达厌氧状态(anaerobiosis)。于接种70g包含酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)(接种量(inoculum size)约为5%(w/v))的固定化聚乙烯醇细胞颗粒(PVA-immobilized cell beads)之前，以2N氢氧化钠调整培养基pH值至6.0。于37℃，以600rpm搅拌速度进行发酵，并藉由加入2N氢氧化钠溶液以维持pH值大约6±0.1。持续进行此反应，直至由于产物抑制(product inhibition)停止产生丁酸。浓度的时间历程公开于图12，其水平虚线代表产自葡萄糖的丁酸其理论的最大浓度。最终丁酸浓度为17.2g/L，而产物中的醋酸量极低。丁酸碳产率为83%，远超过传统发酵的理论产率66%(假设葡萄糖以理论碳产率进行转换)。自乳酸至丁酸的转换可予定量。也就是说，未因生成二氧化碳而发生碳损失(carbon loss)。本实施例中极高的碳产率表明自乳酸至丁酸的一替代生合成路径，与未添加乳酸的发酵过程相较，其可降低二氧化碳生成并提高最大碳产率(maximum carbon yield)。
【实施例6】结合乳酸与木糖于填充床发酵系统
在实施例6中，探讨使用葡萄糖以外醣类的发酵过程。以下试验所使用的填充床发酵系统揭示于图3。发酵系统包括一0.5L填充床生物反应器，其藉由一再循环回路与一2L搅拌式发酵槽连接。该再循环回路由整合式控制台中的泵给予动力。整合式控制台调整发酵槽内的pH值及温度。整合式控制台中的泵将原料藉由再循环回路自发酵槽顶阀传输至填充床生物反应器底部。过程所产生的气体藉由填充床生物反应器及发酵槽顶部释放至一气体收集装置。上述发酵过程于控制的pH值与温度及良好混合条件下进行操作。
将约200g固定化聚乙烯醇酪丁酸梭菌细胞颗粒(PVA-immobilized C.tyrobutyricum cell beads)填充于填充床生物反应器。发酵槽充满1.5L包含木糖及L-乳酸的原料。以氮气曝气发酵槽原料以达厌氧状态(anaerobiosis)。于开始进行发酵之前，以2N氢氧化钠调整原料pH值至6.0。于37℃，泵速率10ml/min条件下，藉由填充床生物反应器对发酵槽中的培养基进行再循环以进行发酵。于第53小时，将第二批次原料加至发酵槽。于固定间隔取样，以分析悬浮细胞、基质及产物浓度。基质及产物浓度的时间历程公开于图13。基质起始浓度及最终碳产率整理于下表5。
表5 使用木糖及乳酸作为基质其发酵过程的碳产率
醣类 木糖
醣类(g/L) 14.4
L-乳酸(g/L) 15.3
丁酸碳产率 61%
总碳产率 64%
发酵时间 55小时
木糖碳产率为两次进料的平均值。在使用五碳醣例如木糖的发酵过程中，可获得极佳丁酸碳产率及总碳产率。本试验证明在发酵过程中，将葡萄糖以外醣类与乳酸结合作为基质已超过传统发酵过程使用葡萄糖作为单一基质所预期的结果，在部分情况下，可视为提升丁酸碳产率的协同作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (25)

1.一种丁酸的制备方法，包括：
以至少一梭菌株(Clostridium strain)对一原料进行发酵以产生丁酸，
其中所述原料包括乳酸。
2.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，其中所述原料更包括至少一醣类。
3.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一梭菌株(Clostridium strain)选自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)。
4.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一梭菌株(Clostridium strain)为酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)。
5.如权利要求2所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一醣类选自单醣、双醣、多醣及其混合物。
6.如权利要求5所述的丁酸的制备方法，其中所述单醣选自葡萄糖、木糖、半乳糖及其混合物。
7.如权利要求5所述的丁酸的制备方法，其中所述双醣选自乳糖、蔗糖、纤维二糖及其混合物。
8.如权利要求5所述的丁酸的制备方法，其中所述多醣选自淀粉、肝糖、纤维素及其混合物。
9.如权利要求2所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一醣类包括至少一可溶性醣类，以一酶糖化制程处理生质物而获得。
10.如权利要求2所述的丁酸的制备方法，其中于所述原料中，乳酸与至少一醣类的重量比介于0.1～10。
11.如权利要求2所述的丁酸的制备方法，其中于所述原料中，乳酸与至少一醣类的重量比介于0.3～3。
12.如权利要求2所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一梭菌株(Clostridium strain)为酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)，而所述至少一醣类为葡萄糖。
13.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，其中所述制备方法提供一丁酸碳产率，高于66%。
14.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，其中所述制备方法提供一丁酸碳产率，高于69%。
15.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，其中所述发酵步骤的持续时间为当大量所述原料已被消耗时为止，或当观察到丁酸已无显著增加时为止。
16.如权利要求15所述的丁酸的制备方法，其中所述发酵步骤持续进行10～80小时。
17.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，更包括于一催化剂存在下，对所述丁酸进行氢化以产生丁醇。
18.如权利要求1所述的丁酸的制备方法，更包括于一催化剂与一醇类存在下，对所述丁酸进行酯化以产生一丁酸酯。
19.一种丁酸的制备方法，包括：
以至少一梭菌株(Clostridium strain)对一原料进行发酵以产生丁酸，
其中所述原料包括乳酸，以及
其中于所述发酵步骤开始之前或之后，将所述乳酸分次地加至所述原料中。
20.如权利要求19所述的丁酸的制备方法，其中所述原料更包括至少一醣类，以及其中于所述发酵步骤开始之前或之后，将所述乳酸与所述至少一醣类以任意顺序分次地加至所述原料。
21.如权利要求19所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一梭菌株(Clostridium strain)选自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)。
22.如权利要求20所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一醣类选自单醣、双醣、多醣及其混合物。
23.如权利要求20所述的丁酸的制备方法，其中于所述原料中，乳酸与至少一醣类的重量比介于0.1～10。
24.如权利要求20所述的丁酸的制备方法，其中所述至少一梭菌株(Clostridium strain)为酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)，而所述原料包括乳酸及葡萄糖。
25.一种丁酸的制备方法，包括：
以至少一梭菌株(Clostridium strain)对一原料进行发酵以产生丁酸，
其中所述原料包括乳酸及至少一醣类。
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