KR101417235B1 - 최적화된 발효 배지 - Google Patents

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이안 린드스트랜드 워너
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Abstract

본 발명은 미생물 발효에 의한 알콜의 생산량 증대, 특히 CO를 함유하는 기질의 미생물 발효에 의한 알콜의 제조에 관한 것이다. 특히, 1종 이상의 미생물이 CO 함유 기질을 에탄올 등 1종 이상의 알콜로 변환시키는 것과 같은 발효계에 니켈을 함유하는 개선된 발효 배지를 제공하는 것에 관한 것이다. 특정 실시 상태에서, 미생물 배양에 의한 CO 흡수를 증가시키고 에탄올 생산성이 개선되도록, 미생물 배양체에 최소 10 μM의 니켈을 제공한다.

Description

최적화된 발효 배지 {OPTIMISED FERMENTATION MEDIA}
본 발명은 일반적으로 미생물 생장 및 미생물 발효에 의한 알콜 및 산 등의 산물 제조 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명은 일산화탄소 함유 기질의 미생물 발효에 의한 알콜, 특히 에탄올 제조 공정에 관한 것이다.
에탄올은 수소가 풍부한 주요 수송용 액상 연료로서 급속하게 전세계적으로 각광 받고 있다. 2005년 전세계의 에탄올 소비량은 122억 갤런에 달하는 것으로 추산되었다. 에탄올 연료 산업의 세계적 시장은 또한 유럽, 일본, 미국 및 일부 개발도상국에서 에탄올에 대한 관심이 증가되고 있기에 장래 가파르게 성장을 계속할 것으로 예상된다.
예를 들어, 미국에서는, 에탄올이 가솔린에 에탄올을 10% 혼합한 혼합물, E10을 제조하는데 사용된다. E10 혼합물에서, 에탄올 성분은 연소 효율을 증진시키고 공기 오염원 발생을 감소시키는 산소화제(oxygenating agent)로 작용한다. 브라질에서는, 에탄올이 가솔린에 혼합되는 산소화제로 또는 그 자체로 순수 연료로서 수송용 연료 수요의 대략 30%를 충족시킨다. 또한, 유럽의 경우, 온실 가스(GHG) 방출 결과를 둘러싼 환경에 관한 관심으로 인하여, 유럽 연합(EU)의 회원국에서는, 바이오매스에 기원하는 에탄올과 같이 환경 파괴 없이 지속 가능한 수송용 연료의 소비가 강제되고 있다.
에탄올 연료의 막대한 대부분은 주요 탄소 공급원으로서 사탕수수로부터 추출한 자당 또는 곡물로부터 추출한 녹말 등의 작물 유래 탄수화물을 사용하는 전통적인 효모계 발효 공정을 통하여 생산되고 있다. 그러나, 이들 탄수화물 공급 원료의 단가는 인간이 필요로 하는 식량이나 동물 사료로서의 그들의 가치에 의하여 영향을 받고, 에탄올 생산을 위한 녹말 또는 자당 생산용 작물의 재배는 모든 지역에서 경제적으로 지속 가능한 것이 아니다. 그러므로, 적은 비용으로 및/또는 더 많은 탄소 원료를 에탄올 연료로 변환하는 기술을 개발하는 것이 관심사이다.
CO는 석탄 또는 석유 및 석유 유래 제품 등 유기 물질의 불완전 연소시 생성되는 주요한 부산물로서 에너지가 풍부한 공짜 물질이다. 예를 들어, 호주의 철강 산업은 연간 500,000톤 이상의 CO를 만들어내고 대기중으로 배출하는 것으로 보고되었다.
주로 CO 및/또는 CO와 수소(H2)로 이루어지는 가스를 다양한 연료 및 화학물질로 전환시키는데 촉매공정이 이용될 수 있다. 미생물도 이 가스들을 연료 및 화학물질로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 이들 생물학적 공정은, 일반적으로 화학 반응보다 더딤에도 불구하고 높은 특이성, 높은 수율, 낮은 에너지 비용 및 독성에 대한 큰 저항성 등 촉매 공정과 비교할 때 몇 가지 장점을 가진다.
유일한 탄소원으로서 CO 상에서 미생물이 생장하는 능력은 1903년에 처음 발견되었다. 이것은 독립 영양 생장 아세틸 코엔자임 A(acetyl CoA) 생화학적 경로[Woods-Ljungdahl 경로 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸 CoA 합성효소(CODH/ACS) 경로라고도 알려져 있음]를 사용하는 미생물들의 특징이라는 것이 후에 알려졌다. 일산화탄소 영양(carboxydotrophic) 미생물, 광합성 미생물, 메탄 생성 미생물 및 초산 생성 미생물을 비롯한 혐기성 미생물의 대다수는 CO를 여러 가지 최종 산물, 예컨대 CO2, H2, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올로 대사시키는 것으로 나타났다. 이러한 모든 미생물은 유일한 탄소원으로서 CO를 사용하면서 이들 최종 생성물 중 2종 이상을 생산한다.
클로스트리듐(Clostridium)속에 속하는 것과 같은 혐기성 세균은 아세틸 CoA 생화학적 경로를 통해 CO, CO2 및 H2로부터 에탄올을 생산하는 것으로 입증되었다. 예컨대, WO 00/68407호, EP 117309호, US 특허 제 5,173,429호, 5,593,886호, 및 6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에는 여러 가지 가스로부터 에탄올을 생산하는 다양한 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii) 균주가 설명되어 있다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 종(Clostridium autoethanogenum sp) 역시 다양한 가스로부터 에탄올을 생성하는 것으로 알려져 있다(Abrini 외, Archives of Microbiology 161, pp 345-351(1994)).
유일한 탄소원 및 에너지원으로 일산화탄소를 이용하는 미생물의 능력과 관련되어 있는 몇 가지 효소들은 그 활성에 금속 보조 인자(metal co-factor)를 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 활성에 금속 보조 인자의 결합을 요하는 핵심 효소로는 일산화탄소 탈수소효소(CODH), 및 아세틸-CoA 합성효소(ACS)를 들 수 있다.
본 발명에 참고로 통합된 WO 2007/117157호, WO 2008/115080호, WO 2009/022925호, WO 2009/058028호, WO 2009/064200호, WO 2009/064201호 및 WO 2009/113878호에는 일산화탄소를 함유하는 가스를 혐기적으로 발효시킴으로써 알콜, 특히 에탄올을 생산하는 공정이 설명되어 있다. WO 2007/117157호에 개시되어 있는 발효 공정의 부산물로서 생산된 아세테이트는 수소 가스와 일산화탄소 가스로 전환되고 이들 중 한 가지 또는 두 가지 모두는 혐기성 발효 공정에 이용될 수 있다. WO 2009/022925호에는 CO를 함유하는 기질을 발효에 의하여 산 및 알콜 등의 생산물로 전환시키는데 있어서 pH 와 ORP의 효과가 설명되어 있다. WO 2009/058028호에는 발효에 의하여 알콜 등의 생산물을 생산하기 위한 산업 폐기 가스의 용도가 설명되어 있다. WO 2009/064200호에는 CO의 담체 및 발효에 있어서의 CO의 용도가 설명되어 있다. WO 2009/113878호에는 CO를 함유하는 기질의 발효 과정 중 산의 알콜로의 전환이 설명되어 있다.
CO 함유 가스에서 생장할 수 있는 미생물이 전통적인 방식으로 당에서 생장하는 미생물보다 더딘 속도로 자란다는 것이 알려져 있다. 상업적 측면에서, 발효 공정 중에 미생물 수가, 제조하고자 하는 산물을 경제적으로 실행 가능한 수준으로 만들기에 충분하게 많은 세포 밀도로 생장하는데 필요한 시간은 공정의 수익성에 영향을 미치는 가장 주요한 비용 원인이다. 배양 속도를 향상시키고 따라서 미생물 수가 높은 세포 밀도에 도달하는데 걸리는 시간을 단축시키는데 작용하는 기술은 전체 공정의 상업적 생산성을 향상시키는데 기여할 수 있다.
가스 공급 원료로부터 알콜을 생산하는 발효 공정 중에, 적당한 금속 보조 인자가 정확한 농도로 존재하도록 하는 것은 최적 알콜 생산성을 유지하는데 매우 중요할 수 있다. 이에 더하여, 많은 산업 발효 공정에서 사용되는 큰 부피의 배지에 투여되는 배지 성분의 비용도 또한 공정의 수익성에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 공급 원료로서 일산화탄소를 함유하는 가스를 이용하는 발효 시스템에서 요구되는 알콜 제조에 필수적인 미량 금속 보조 인자를 선별하고 보조 인자의 농도를 최적화하는 것이 알콜 생산률을 높이고 공정 가동 비용을 낮추는데 주요한 부분이 된다.
미생물에 의한 가스 발효 에탄올 생산은 통상 아세테이트 및/또는 아세트산을 동시에 생산하게 된다. 이용 가능한 일부 탄소가 에탄올이 아닌 아세테이트/아세트산으로 전환되기 때문에, 이러한 발효 공정을 이용한 에탄올 제조의 효율은 생각보다 낮을 수 있다. 또한, 상기 아세테이트/아세트산 부산물이 어떤 다른 목적으로 사용되지 않는다면, 폐기물 처리 문제도 발생할 수 있다. 아세테이트/아세트산은 미생물에 의하여 메탄으로 전환되기 때문에 GHG 방사의 잠재적 원인이 된다. 기타 폐기물 생산물, 예컨대 부티르산/부티르산염(butyric acid/butyrate)이 또한 통상 이용되는 발효 공정 중에 생성될 수 있다.
아세테이트 등 산이 미생물 배양에 의한 알콜 생산에 억제 효과를 가질 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 발효 공정은 좋기로는 산의 수준을 낮게 유지해야만 한다.
상기 단점들을 극복하기 위한 적어도 몇 가지 방식의 공정을 제공하는 것, 또는 적어도 공중에게 유용한 선택을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
발명의 요약
CO를 함유하는 기질의 미생물 발효 효율을 향상시키는 방법으로서, 본 방법은 1종 이상의 미생물의 CO 흡수를 증가시키기 위하여 니켈을 제공하는 단계를 포함한다.
또 다른 광의의 측면에서, 상기 발명은 CO를 함유하는 기질의 미생물 발효 효율을 유지 또는 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 반응 배지에서 니켈 농도를 원하는 농도보다 높게 유지하는 단계를 포함하는 것이다.
제1 관점 및 제2 관점의 특정 실시 상태에서, CO 함유 기질은 미생물 배양에 의하여 산 및/또는 알콜 등의 대사 산물로 전환된다. 특정 실시 상태에서, 미생물 배양체의 CO 흡수를 증가시킴으로써 효율이 유지 또는 증가된다.
제1 관점 및 제2 관점의 특정 실시 상태에서, CO 흡수를 증가시키면 미생물 배양의 생장률 및/또는 생장 수준이 증가한다. 이에 더하여 또는 별법으로, CO 흡수를 증가시키면 대사 산물 생산성 및/또는 대사 산물 생성이 증가한다. 본 발명의 특정 실시 상태에서, 알콜 생산이 실질적으로 증가하였다. 통상, 알콜 생산은 실질적으로 증가한 반면, 아세테이트 생성은 일정하거나 감소하였다. 특정 실시 상태에서, 알콜은 알콜:산의 비가 10:1 보다 큰, 또는 적어도 20:1, 또는 적어도 30:1, 또는 적어도 50:1, 또는 적어도 100:1인 발효 반응의 주요 산물이다.
특정 실시 상태에서, 알콜은 실질적으로 산의 생성 없이 만들어진다.
또 다른 광의의 측면에서, 본 발명은 CO를 함유하는 기질의 발효에 의하여 알콜을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 미생물 배양체의 CO 흡수를 증가시키는 것을 포함한다. 특정 실시 상태에서, 상기 방법은 미생물 배양체에 니켈을 첨가하는 것을 포함한다. 특정 실시 상태에서, 아세테이트를 적게 또는 전혀 생성하지 않고 알콜이 만들어진다.
또 다른 광의의 측면에서, 본 발명은 미생물 발효에 의하여 1종 이상의 산 및/또는 알콜을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 일산화탄소, 이산화탄소 및/또는 수소를 함유하는 기질을 제공하는 단계와,
(b) 1종 이상의 미생물의 배양체를 함유하는 바이오리액터에서 상기 기질을 혐기 발효시켜 산 및/또는 알콜로 이루어지는 1종 이상의 산물을 제조하는 단계, 여기서 산 생성 및/또는 알콜 생성을 증가시키기 위하여 배양체에 니켈이 제공된다.
특정 실시 상태에서, 니켈은 적어도 10 μM; 또는 적어도 50 μM; 또는 적어도 100 μM; 또는 적어도 500 μM; 또는 적어도 1 mM; 또는 적어도 3 mM의 원하는 농도로 제공된다. 니켈은 미생물 생장 및/또는 산물의 생합성을 뒷받침하기에 적합한 영양 성분을 함유하는 액체 영양 배지에 적어도 2.5 mg/L; 또는 적어도 10 mg/L; 또는 적어도 100 mg/L; 또는 적어도 500 mg/L의 농도로 제공될 수 있다. 특정 실시 상태에서, 니켈은 최소 2.5 mg/L/미생물 건조 중량 그램; 또는 최소 10 mg/L/g; 또는 최소 100 mg/L/g; 또는 최소 500 mg/L/g의 농도로 유지된다. 특정 실시 상태에서, 니켈의 농도는 기정 시간에 기정 양의 니켈을 배양체에 첨가함으로써 원하는 수준보다 높게 유지된다.
특정 실시 상태에서, 니켈은 1종 이상의 니켈염의 형태로 배양체 또는 바이오리액터로 첨가된다. 염은 염화 니켈, 황산 니켈, 탄산 니켈 또는 아세트산 니켈을 포함한다. 특정 실시 상태에서 니켈은 1종 이상의 희석제, 담체 및/또는 기타 성분들과 함께 니켈을 함유하는 조성물의 형태로 첨가된다.
본 발명의 특정 실시 상태에서, 니켈을 첨가하기 전에, 상기 방법은 또한 다음의 단계들을 포함한다:
(a) 바이오리액터 내로 담겨질 배양체 시료를 채취하는 단계 및
(b) 니켈, 생성된 알콜 및/또는 산의 농도, 및/또는 미생물 세포 밀도를 측정하는 단계, 여기서 기정 양과 기정 시간은 미생물 세포 밀도 및/또는 알콜 및/또는 산의 농도 및/또는 니켈의 농도로부터 계산된다.
특정 실시 상태에서, 기질은 가스상이고 산업 공정의 부산물로 얻어지는 가스로 이루어진다. 특정 실시 상태에서, 산업 공정은 철 금속 제품 제조, 비철 금속 제품 제조, 석유 정제 공정, 바이오매스의 가스화, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 좋기로는, 가스상 기질은 스틸 밀(steel mill)로부터 얻어지는 가스를 포함한다.
CO 함유 기질은 통상 주요 부분으로 CO를 함유한다, 예컨대 적어도 약 20 부피% CO 내지 약 100 부피% CO, 40 부피% CO 내지 95 부피% CO, 40 부피% CO 내지 60 부피% CO, 및 45 부피% CO 내지 55 부피% CO이다. 특정 실시 상태에서, 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%의 CO, 또는 약 55 부피% CO, 또는 약 60 부피% CO를 함유한다. 특히 H2 및 CO2가 또한 존재하는 경우에는 예컨대 6%와 같이 낮은 농도의 CO를 함유하는 기질도 적당할 수 있다.
다양한 실시 상태에서, 발효는 1종 이상의 일산화탄소 영양 세균 균주들의 배양체를 이용하여 수행된다. 다양한 실시 상태에서, 일산화탄소 영양 세균은 클로스트리듐(Clostridium), 무렐라(Moorella), 옥소박터(Oxobacter), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 아세토박테리움(Acetobacterium), 유박테리움(Eubacterium) 또는 부티리박테리움(Butyribacterium)으로부터 선택된다. 하나의 실시 상태에서, 상기 일산화탄소 영양 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔세럼병Clostridium autoethanogenum)이다. 또 다른 실시 상태에서, 상기 일산화탄소 영양 세균은 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxydivorans)이다. 또 다른 실시 상태에서, 상기 일산화탄소 영양 세균은 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii)이다.
또 다른 광의의 측면에서, 본 발명은 미생물 발효를 뒷받침하도록 조정된 영양 배지를 제공하는데, 상기 배지는 적어도 10 μM 농도의 니켈과 1종 이상의 희석제 및/또는 담체를 함유한다. 특정 실시 상태에서 니켈 농도는 적어도 50 μM; 또는 적어도 100 μM; 또는 적어도 500 μM; 또는 적어도 1 mM; 또는 적어도 3 mM이다. 특정 실시 상태에서, 니켈은 적어도 2.5 mg/L/미생물 건조 중량 그램; 또는 적어도 10 mg/L/g; 또는 적어도 100 mg/L/g; 또는 적어도 500 mg/L/g의 농도로 액체 영양 배지 내로 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 니켈은 적어도 철, 코발트 및/또는 아연을 함유하는 액체 영양 배지 내로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 니켈은 니켈:철 비가 적어도 1:2; 또는 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:코발트 비가 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:아연 비가 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다.
본 발명의 기타 실시 상태에서 상기 방법은 수소를 생산하기 위하여 사용될 수도 있다.
본 발명이 광의로 상기와 같이 정의되지만, 그것에 국한되는 것이 아니며 이하 상세한 설명이 제공하는 실시예들의 실시 상태를 또한 포함한다.
발명의 상세한 설명
일산화탄소 영양 미생물의 CO 흡수 능력(또는 CO 흡수율)은 생장률 및/또는 산물 생합성률과 관련있다는 것이 알려져 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 일산화탄소 영양 미생물 배양체의 CO 흡수율은 증가하였다. CO 흡수율이 증가한 결과, 생장률 및/또는 산물 생합성이 증가하였다. 본 발명의 특정 실시 상태에 따르면, 니켈 또는 1종 이상의 니켈염과 같은 1종 이상의 보조 인자가 배양체에 의한 CO 흡수를 향상 또는 증강시키기 위하여 일산화탄소 영양 미생물을 함유하는 미생물 배양체에 첨가될 수 있다.
니켈염은 통상 미생물 생장 및/또는 산물 생합성을 돕기 위해 일산화탄소 영양 미생물 배양체에 첨가된다. 그러나, 놀랍게도 공지의 배지 제조법에는 충분한 니켈이 함유되어 있지 않고 이것이 미생물 배양체에 의하여 이용될 CO 비율을 제한할 수 있다는 것이 알려졌다. 이론에 얽매일 필요 없이 클로스트리듐 오토에타노게눔 등의 특정 일산화탄소 영양 세균에서 CODH/ACS 효소계가 니켈 보조 인자를 포함한다는 것은 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법에 따라, CODH/ACS 효소계의 작동은 니켈염과 같은 추가적인 보조 인자들을 제공함으로써 증강될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제공되는 니켈의 농도가 CODH/ACS 효소에서 필요로 하는 양보다 실질적으로 크다는 것을 알게 되었다. 그러나, 실시예를 통하여, 액체 영양 배지 내에 니켈의 수준을 높이면 CO 흡수가 증가한다.
특정 실시 상태에서, 생장률 및/또는 미생물 배양체의 총 생장은 배양체에 추가적인 니켈을 제공함으로써 실질적으로 향상될 수 있다. 이에 더하여 또는 별법으로 미생물 배양에 의한 대사 산물의 생성률 및/또는 총 대사 산물 생성이 또한 실질적으로 증가될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태에서, 알콜 생성률 및/또는 총 알콜 생성은 실질적으로 증가한 반면 산 생성은 무시할 정도이다. 이론에 얽매일 필요없이, 증가된 CO 흡수에 의하여 이용 가능한 추가적인 환원 당량으로 인하여 미생물 배양체가 아세테이트와 같은 산을 감소시키고, 따라서 산이 발효 배지 내에서 실질적으로 축적되지 않는다고 여겨진다. 그러므로, 본 발명의 특정 실시 상태에서, 발효 배지 내에서 산의 수준을 낮게 유지하면서 알콜을 생산하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시 상태에서, 산의 부재하에 알콜을 생산하는 방법이 제공되고, 여기서 니켈이 일반적인 경우보다 높은 수준으로 발효 배지에 첨가된다.
특정 실시 상태에서 니켈은 신규 영양 배지 내로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 신규 영양 배지는 또한 최소한 철, 코발트 및/또는 아연을 함유한다.
본 발명은 일산화탄소 이외의 기질을 이용하는, 에탄올 이외의 알콜을 생산하는, 및 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리이 및 클로스트리듐 카르복시디보란스 이외의 미생물을 이용하는 발효 반응에도 쉽게 응용될 수 있다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서를 통하여 사용되는 이하의 용어들은 다음과 같이 정의한다:
용어 "효율을 증가시키다", "증가된 효율" 등의 용어는 발효 공정과 관련하여 사용될 경우, 비제한적인 예로서 다음 중 하나 이상, 즉 발효를 촉매하는 미생물의 생장률, 소비된 기질(예컨대 일산화탄소)의 부피당 제조된 산물(예컨대 알콜)의 부피 , 원하는 산물의 생산률 또는 생산 수준, 및 다른 발효 부산물에 대한, 원하는 생산된 산물의 상대적인 비율을 증가시키는 것을 의미한다.
"보조 기질(co-substrate)"라는 용어는 산물의 합성시 반드시 주요한 1차 에너지원 및 원료로 작용하는 것은 아니지만, 1차 기질에 첨가되는 경우 산물 합성에 이용될 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 배양체 또는 바이오리액터에 "산"을 첨가한다고 언급되는 경우 "산" 등의 용어는 임의의 모노카르복시산 및 디카르복시산을 포함하여 넓게 해석되어야 한다. 이에 더하여 "산"의 첨가라는 말은 등가의 염 또는 염과 산의 혼합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 본 명세서의 특정 산에 대한 언급도 등가의 염을 포함하는 것으로(예컨대 부티르산 및 부티르산염) 이해되어야 하고 그 역도 마찬가지이다. 발효 배지 내에서 분자산(molecular acid)과 카르복실레이트의 비는 계의 pH에 달려있다. 산의 예로는 아세트산, 프로피온산, n-부티르산, n-펜타노산, n-헥사노익산, 및 벤조산을 들 수 있다.
"바이오리액터"라는 용어는 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR:Continuous Stirred Tank Reactor), 고정형 셀 반응기(ICR: Immobilized Cell Reactor), 살수층 반응기(TBR: Trickle Bed Reactor), 유동상 생물막 리액터(moving bed biofilm reactor), 기포 컬럼, 가스 리프트 발효기, 막 반응기, 예컨대 중공 섬유막 바이오리액터(HFMBR: Hollow Fibre Membrane Bioreactor), 정전식 믹서, 또는 가스-액체 접촉에 적합한 기타의 용기나 장치를 비롯한, 1 이상의 용기 및/또는 탑 또는 파이프 배관으로 이루어진 발효 장치를 포괄한다.
달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 "발효", "발효 공정" 또는 "발효 반응" 등의 용어는 그 공정에 있어서 성장 단계와 생성물의 생합성 단계를 모두 포괄하는 것이다. 본 명세서에서 더 설명할 바와 같이, 일부 실시 상태에서 상기 바이오리액터는 첫번째 생장 리액터와 두번째 발효 리액터로 구성될 수 있다. 따라서, 발효 반응에 금속 또는 조성물을 첨가하는 것은 이들 리액터 중 어느 하나 또는 양자 모두에 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 "일산화탄소를 함유하는 기질"이라는 용어는 발효를 위하여 바이오리액터에 도입될 수 있는 일산화탄소를 함유하는 임의의 고체, 액체 또는 가스상 물질을 포함한다. "일산화탄소를 함유하는 가스상 기질"은 일산화탄소를 함유하는 임의의 가스를 포함한다. 상기 가스상 기질은 통상적으로 예컨대 적어도 약 15 부피% 내지 약 95 부피%의 CO를 실질적 분율로 함유할 것이다.
이하 본 명세서에서 설명할 것과 같이, "금속" 등의 용어는 문맥상 필요한 경우 금속 이온 및 염을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"보조 인자" 등의 용어는 효소와 상호 작용 및 효소의 기능을 보조하는 화학 화합물, 금속 또는 이온을 포함한다. 통상적으로, 보조 인자는 효소 촉매 반응에 필요하거나, 속도를 증가시키는 무기 물질로 종종 분류된다.
본 발명은 미생물 발효 공정 효율을 증가시키는 방법 및 발효 공정에 사용되는 미생물의 생장을 증가시키는 방법을 제공한다. 이들 방법은 발효 반응에서 향상된 영양 배지 또는 생장 배지를 이용하거나 발효 공정 중 배지를 보충하는 것을 포함한다.
이하의 설명은 본 발명의 양호한 실시 상태, 다시 말하여 1차 기질로서 CO를 사용하여 에탄올 및/또는 아세테이트를 제조하는 것에 초점을 맞추지만, 본 발명과 관련되는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 알려진 대안 알콜 및/또는 산의 제조 및 대안 기질의 사용에 적용할 수 있다고 이해되어야 한다. 예를 들어, 이산화탄소 및 수소를 함유하는 가스상 기질이 사용될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 부티레이트, 프로피오네이트, 카프로에이트, 에탄올, 프로판올, 및 부탄올을 생산하기 위한 발효에도 적용될 수 있다. 본 방법은 수소를 생산하기 위하여도 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 생성물은 무렐라(Moorella), 클로스트리디아(Clostridia), 루미노코커스(Ruminococcus), 아세토박테리움(Acetobacterium) 유박테리움(Eubacterium), 부티리박테리움(Butyribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 메타노사르시나(Methanosarcina), 및 데설포토마쿨룸(Desulfotomaculum) 속의 미생물을 이용한 발효에 의해 생산될 수 있다.
발효 반응
본 발명은 특히 CO 함유 산업상 연도 가스(flue gases)와 같은 가스상 기질로부터 에탄올 제조를 뒷받침하는 데 적용된다. 본 발명의 일부 실시 상태에서, CO를 함유하는 기질은 탄소 함유 폐기물, 예컨대 산업 폐기물 가스에서 유래한 것이거나 기타 폐기물의 가스화로부터 유래한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 다르게는 주변 환경으로 배출될 수 있는 탄소를 포획하는 효과적인 공정을 나타내고 있다. 산업상 연도 가스의 예는 철 금속 제품 제조, 비철 금속 제품 제조, 석유 정제 공정, 바이오매스의 가스화, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조 중에 생성되는 가스를 포함한다. 본 발명은 또한 대안 알콜을 제조하는 반응에도 적용될 수 있다.
가스상 기질로부터 에탄올 및 기타 알콜을 제조하기 위한 공정이 알려져 있다. 공정의 예로는 예컨대 WO 2007/117157호, WO 2008/115080호, US 6,340,581호, US 6,136,577호, US 5,593,886호, US 5,807,722호 및 US 5,821,111호에 기재되어 있는 것들을 포함하며, 각각은 본 명세서에 참조로 포함되는 것이다.
많은 혐기성 세균이 CO를 예컨대 n-부탄올 및 에탄올 등의 알콜 및 예컨대 아세트산 등의 산으로 발효를 수행할 수 있는 것으로 알려져 있고 본 발명의 공정에 사용하기에 적합하다. 본 발명에서 사용되기에 적합할 수 있는 이러한 세균의 예로는 WO 00/68407호, EP 117309호, US 5,173,429호, 5,593,886호, 및 6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에 개시되어 있는 것들을 비롯한 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii) 균주, 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxydivorans)(Liou 외, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei)(WO/2008/028055호) 및 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)(Abrini 외, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)과 같은 클로스트리듐(Clostridium)속 균주를 들 수 있다. 기타 적절한 세균으로 무렐라(Moorella)속 균주로서, 예컨대 무렐라(Moorella sp) HUC22-1(Sakai 외, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), 및 카르복시도써무스(Carboxydothermus) 속 균주(Svetlichny, V.A., 외(1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260)를 들 수 있다. 추가의 예로는 무렐라 써모아세티(Moorella thermoacetica), 무렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica), 루미노코쿠스 프로덕투스(Ruminococcus productus), 아세토박테리움 우디이(acetobacterium woodii), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 옥소박터 페니기이(Oxobacter pfennigii), 메타노사르시나 바르켄(Methanosarcina barken), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 데설포토마쿨룸 쿠츠네초비이(Desulfotomaculum kuznetsovii)(Simpa 외, Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41-65)를 들 수 있다. 이에 더하여, 이 기술 분야에서 숙련된 자가 이해할 수 있다면 기타 일산화탄소 영양 혐기성 세균도 본 발명에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명이 2종 이상의 세균의 혼합 배양체에 적용될 수도 있다는 것이 또한 이해될 것이다.
본 발명에 사용되기에 적합한 미생물의 한 예는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 한 실시 상태에서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 식별 수탁 번호 19630으로 독일생물자원센터(DSMZ)에 기탁된 동정(식별) 특성을 가지는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 또 다른 실시 상태에서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 수탁 번호 DSMZ 10061로 DSMZ에 기탁된 동정 특성을 가지는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 또 다른 미생물 예는 클로스트리듐 륭달리이이다. 한 실시 상태에서, 상기 클로스트리듐 륭달리이는 식별 수탁 번호 DSMZ 13528로 DSMZ에 기탁된 동정 특성을 가지는 클로스트리듐 륭달리이이다. 또 다른 미생물의 예는 클로스트리듐 카르복시디보란스이다. 한 실시 상태에서, 상기 클로스트리듐 카르복시디보란스는 식별 수탁 번호 DSMZ 15243으로 DSMZ에 기탁된 동정 특성을 가지는 클로스트리듐 카르복시디보란스이다.
본 발명의 방법에 사용되는 세균의 배양은 혐기성 세균을 이용하여 기질을 배양 및 발효시키기 위한 여러 가지 공지 공정을 이용하여 수행할 수 있다. 예시적인 기술은 하기 "실시예" 란에 제시되어 있다. 추가 예시를 위해, 발효시 가스상 기질을 이용하는 다음 문헌에 일반적으로 설명된 방법들도 사용할 수 있다:(i) K. T. Klasson,외(1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165;(ii) K. T. Klasson, 외(1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614;(iii) K. T. Klasson, 외(1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608;(iv) J. L. Vega, 외(1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793;(vi) J. L. Vega, 외(1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784;(vii) J. L.Vega, 외(1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; 상기 문헌들은 모두 본 발명에 참조되었다.
발효는 예컨대 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR:Continuous Stirred Tank Reactor), 고정형 셀 반응기(ICR: Immobilized Cell Reactor), 기포 컬럼 반응기(BCR: bubble column reactor), 막 반응기, 예컨대 중공 섬유막 바이오리액터(HFMBR: Hollow Fibre Membrane Bioreactor) 또는 살수층 반응기(TBR: Trickle Bed Reactor)와 같은 모든 적합한 바이오리액터에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 실시 상태에서, 바이오리액터는 미생물이 배양되는 제1의 성장 반응기, 상기 성장 반응기로부터의 발효 배지가 주입되고, 대부분의 발효 산물(예컨대 에탄올 및 아세테이트)가 생성되는 제2의 발효 반응기를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 다양한 실시 상태에 따라, 발효 반응의 탄소원은 좋기로는 CO를 함유하는 가스상 기질이다. 이러한 가스상 기질은 산업 공정으로부터 나오거나 또는 자동차 배기 매연과 같은 다른 원료로부터의 부산물로서 얻어지는 CO 함유 폐가스일 수 있다. 특정 실시 상태에서, 산업 공정은 스틸 밀과 같은 금속 제품 제조, 비금속 제품 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시 상태에서 CO 함유 가스는 임의의 편리한 방법을 이용하여, 대기중에 방출되기 전에 산업 공정으로부터 포집될 수 있다. 가스상 CO 함유 기질의 조성에 따라, 이를 발효 공정에 도입시키기 전에, 먼지 입자와 같은 원치 않는 불순물을 제거하는 처리를 하는 것이 요구될 수도 있다. 예를 들어, 가스상 기질은 공지 방법을 이용하여 여과 또는 스크러빙 처리할 수 있다.
혹은, CO 함유 가스상 기질은 바이오매스의 가스화로부터 원료화된 것일 수 있다. 가스화 공정은 공기 또는 산소의 공급이 제한된 상태에서 바이오매스의 부분 연소를 수반한다. 결과물인 가스는 통상적으로 주로 CO 및 H2, 최소량의 CO2, 메탄, 에틸렌 및 에탄을 포함한다. 예를 들어, 사탕수수로부터 당, 또는 옥수수나 곡물로부터 전분과 같은 식품, 또는 산림 산업에 의하여 발생하는 비식품 바이오매스 폐기물의 추출 및 공정 중에 생겨나는 바이오매스 부산물들이 본 발명에서 사용되는 데 적합한 CO 함유 가스를 생성하기 위하여 가스화될 수 있다.
CO 함유 기질은 통상적으로 CO를 주요 부분으로, 예컨대 적어도 약 20 부피% 내지 약 100 부피% CO, 40 부피% 내지 95 부피% CO, 40 부피% 내지 60 부피% CO, 및 45 부피% 내지 55 부피% CO를 함유한다. 특정 실시 상태에서, 상기 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 또는 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%, 또는 약 55 부피%, 또는 약 60 부피%를 함유한다. 예컨대 6% 등의 저농도의 CO를 가지는 기질이 H2 및 CO2도 역시 존재하는 경우에는 특히 적당할 수 있다.
가스상 기질이 수소를 함유할 필요는 없으나, 본 발명의 방법에 따른 산물 생성에 H2의 존재가 유해하지는 않다. 특정 실시 상태에서, 수소의 존재는 알콜 제조의 총 효율을 향상시키는 결과를 낳는다. 가스상 기질은 또한 예를 들어 약 1 부피% 내지 약 80 부피%의 CO2, 또는 1 부피% 내지 약 30 부피%의 CO2 등의 어느 정도의 CO2를함유할 수도 있다.
통상적으로, 일산화탄소는 가스상 상태로 발효 반응에 첨가된다. 그러나, 본 발명의 방법은 이 상태로 기질을 첨가하는 것에 국한되지 않는다. 예를 들어, 일산화탄소는 액체로 제공될 수 있다. 예를 들어, 액체를 일산화탄소 함유 가스로 포화시켜 바이오리액터로 첨가할 수 있다. 이것은 표준 방법론을 이용하여 달성된다. 예를 들어서, 이 목적을 위해, 마이크로 버블 분산 발생기(Hensirisak 외, Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3, October , 2002) 를 사용할 수 있다.
세균의 성장과 CO에서 에탄올로의 발효를 일으키기 위해서는 CO 함유 기질 가스에 더해서, 적절한 액상 영양 배지를 바이오리액터에 주입할 필요가 있다. 영양 배지는 사용되는 미생물이 성장하는데 충분한 비타민과 무기질을 함유한다. 유일한 탄소원으로서 CO를 이용하여 에탄올을 발효시키는데 적합한 혐기성 배지는 공지이다. 예컨대, 전술한 바와 같은 US 5,173,429호 및 5,593,886호, 그리고 WO 02/08438호, WO 2007/115157호 및 WO 2008/115080호, WO 2009/022925호, WO 2009/058028호, WO 2009/064200호, WO 2009/064201호 및 WO 2009/113878호에 설명되어 있다. 본 발명은 미생물의 생장 및/또는 발효 공정에서 알콜 제조를 뒷받침하는 효율을 증가시키는 신규한 배지를 제공한다. 이 배지를 이하에서 더 자세히 설명할 것이다.
발효는 좋기로는 원하는 발효가 일어나도록(예컨대 CO에서 에탄올로) 적당한 조건에서 수행되어야 한다. 고려되어야 할 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화 환원 전위, 교반율(연속 교반 탱크 리액터를 사용한다면), 접종원 수준, 액상에서 CO가 제한 요소가 되지 않도록 하기 위한 최대 가스 기질 농도, 및 산물 억제를 피하기 위한 최대 산물 농도 등이다. 적절한 조건이 WO 02/08438호, WO 2007/117157호, WO 2008/115080호 및 WO 2009/022925호에 설명되어 있다. 최적 반응 조건은 부분적으로는 사용되는 특정 미생물에 달려 있다. 그러나, 일반적으로, 발효는 주변 압력보다 높은 압력에서 수행되는 것이 좋다. 높은 압력에서 시행하면 가스상의 CO로부터, 미생물이 에탄올을 생성하기 위하여 탄소원으로 흡수할 수 있게 되는 액체상으로의 CO 전환률이 유의적으로 증가하게 된다. 이것은 결국 바이오리액터가 대기압보다는 높은 압력에서 유지되는 경우에 체류 시간(바이오리액터 내의 액체 부피를 유입 가스 유량으로 나눈 것으로 정의)이 감소한다는 것을 의미한다.
또한, 주어진 CO로부터 에탄올로의 주어진 전환률은 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고, 원하는 체류 시간의 달성은 곧 바이오리액터의 요구되는 용량을 가리키는 것이므로, 가압 장치의 사용은 요구되는 바이오리액터의 체적을 크게 감소시켜, 그 결과, 발효 장비에 드는 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. US 5,593,886호에 제시된 실시예에 따르면, 반응기 작업 압력 증가에 따라 반응기의 체적을 줄일 수 있다. 즉, 10 기압에서 작동하는 바이오리액터는 1 기압에서 작동하는 바이오리액터 체적의 단지 1/10만을 필요로 한다.
고압 하에서 가스를 에탄올로 발효시키는 공정의 장점은 다른 문헌에도 설명되어 있다. 예를 들어, WO 02/08438호는 30 psig와 75 psig의 압력 하에서 수행된 가스로부터 에탄올로의 발효는, 에탄올 생산량이 각각 150 g/l/1일 및 369 g/l/1일이었다고 설명하고 있다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지와 주입 가스 조성물을 사용하여 발효시킨 실시예에서는 1일 1리터당 에탄올 생산량이 10분의 1 내지 20분의 1 정도로 감소한 것으로 나타났다.
CO를 함유하는 가스상 기질의 도입 속도는 액상 CO의 농도가 제한적이 되지 않게 할 정도인 것이 바람직하다. 이는 CO-제한 조건 결과, 에탄올 생성물이 배양체에 의해 소비될 수 있기 때문이다.
생성물의 회수
발효 반응 산물은 공지 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예시적인 방법이 WO 2007/117157호, WO 2008/115080호 및 US 6,340,581호, 6,136,577호, 5,593,886호, 5,807,722호 및 5,821,111호에 설명되어 있다. 그러나, 단지 간략하게, 예시적으로만, 분별 증류 또는 증발, 및 추출식 발효와 같은 방법에 의해 발효 배지로부터 에탄올이 회수될 수 있다.
발효 배지로부터 에탄올을 증류시키면 에탄올과 물의 공비 혼합물(즉 95% 에탄올 및 5% 물)이 생산된다. 이어서, 역시 기술 분야에 공지인 분자체 에탄올 탈수 기술을 이용함으로써 무수 에탄올을 수득할 수 있다.
추출식 발효 공정은 묽은 발효 배지로부터 에탄올을 회수하기 위하여, 발효 미생물에 대한 독성 위험이 낮은 수혼화성 용매를 사용한다. 예컨대, 이러한 유형의 추출 공정에 사용할 수 있는 용매는 올레일 알콜이다. 이 공정에서, 올레일 알콜은 발효기 내로 연속 도입되고, 이 용매는 발효기 최상부에 층을 형성하여, 연속적으로 추출되어 원심분리기로 주입되게 된다. 이렇게 되면 물과 세포가 올레일 알콜로부터 용이하게 분리되어 발효기로 반송되는 한편, 에탄올이 많이 들어있는 용매는 플래쉬 증기화 유닛 내로 주입된다. 에탄올의 대부분은 기화 및 응축되는 한편 비휘발성인 올레일 알콜은 회수되어 발효에 재사용된다.
발효 반응에서 부산물로서 생성된 아세테이트 역시 기술 분야의 공지 방법에 따라 발효 배지로부터 회수될 수 있다.
예컨대, 활성탄 필터를 포함하는 흡착 장치를 사용할 수 있다. 이 경우, 미생물 세포는 적절한 분리 유닛을 사용하여, 가장 먼저 발효 배지로부터 제거된다. 기술 분야에는 생성물의 회수를 위해 무세포 발효 배지를 생산하는 수많은 여과 기반 방법이 공지되어 있다. 무세포 에탄올 - 및 아세테이트를 함유하는 삼출물(permeate)을 활성탄을 함유하는 컬럼을 통해 통과시킴으로써 아세테이트를 흡착시킨다. 염(아세테이트) 형태보다는 산 형태의 아세테이트(아세트산)가 활성탄에 더 용이하게 흡착된다. 따라서, 대부분의 아세테이트를 아세트산 형태로 전환시키기 위해서는, 발효 배지를 활성탄 컬럼에 통과시키기 전에 발효 배지의 pH를 약 3 미만으로 감소시키는 것이 좋다.
활성탄에 흡착된 아세트산은 기술 분야의 공지 방법을 이용하는 용리법에 의해 회수할 수 있다. 예컨대, 결합된 아세테이트를 용리시키기 위해 에탄올을 이용할 수 있다. 특정 실시 상태에서, 발효 공정 자체에 의해 생산된 에탄올은 아세테이트를 용리시키는데 이용될 수 있다. 에탄올의 끓는점은 78.8℃이고 아세트산의 끓는점은 107℃이므로, 증류와 같은 휘발성에 기반한 방법을 이용하여 에탄올과 아세테이트를 서로 쉽게 분리할 수 있다.
발효 배지로부터 아세테이트를 회수하는 기타 방법은 이 기술 분야에 공지이며 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 예컨대, US 6,368,819호 및 6,753,170호에는 발효 배지로부터 아세트산을 추출하는데 이용할 수 있는 용매 및 공용매 장치가 설명되어 있다. 에탄올의 추출식 발효와 관련하여 전술한 올레일 알콜-기반 장치의 경우와 마찬가지로, US 6,368,819호 및 6,753,170호에 설명된 장치는 아세트산 추출을 위하여 발효 미생물의 존재 또는 부재 하에 발효 배지와 혼합될 수 있는 수혼화성 용매/공용매를 설명하고 있다. 아세트산 산물을 함유하는 용매/공용매는 이어서 증류에 의해 배지로부터 분리된다. 이어서 2차 증류 단계를 이용하여 용매/공용매 장치로부터 아세트산을 정제할 수 있다.
발효 반응 산물(예컨대 에탄올과 아세테이트)의 회수는 발효 바이오리액터로부터 발효 배지의 일부분을 연속적으로 제거하고, 이 배지로부터 미생물 세포를 분리한 다음(간편하게 여과에 의해), 순차적으로 또는 동시에 배지로부터 1종 이상의 생성물을 회수함으로써 달성할 수 있다. 전술한 바와 같이 에탄올은 간편하게 증류에 의해 회수될 수 있고, 아세테이트는 활성탄 상에 흡착시킴으로써 회수할 수 있다. 분리된 미생물 세포는 발효 바이오리액터로 반송될 수 있다. 에탄올과 아세테이트가 제거된 후의 무세포 삼출물 역시 발효 바이오리액터로 반송될 수 있다. 부가적인 영양 성분(예컨대 비타민 B)를 이 무세포 삼출물에 첨가하여 배지가 바이오리액터로 반송되기 전에 영양 배지를 보강시킬 수 있다. 또한, 활성탄에 대한 아세트산의 흡착능을 증대시키기 위해 배지의 pH가 전술한 바와 같이 조정된 경우에는, 그 pH는 바이오리액터로 배지가 반송되기 전에, 발효 바이오리액터 내의 배지의 pH와 유사하게 재조정되어야 한다.
CO 흡수의 증가
이하의 설명은 발효 공정에 있어 본 발명의 특정 실시 상태에서의 응용에 초점을 맞춘다. 그러나, 본 발명이 일반적으로 미생물의 생장 효율 및/또는 산물 생합성을 증가시키거나 유지하는데 더욱 광범위하게 응용될 수 있음을 또한 이해하여야 한다.
본 발명의 방법에 따라, 일산화탄소 영양 세균의 CO 흡수를 증가시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 특정 실시 상태에서, 상기 방법은 니켈과 같은 보조 인자를 미생물 배양체에 첨가하는 것을 포함하고 이로써 CO 흡수가 증가한다. 특정 실시 상태에서, 상기 보조 인자는 통상적으로 공지의 계에서 제공되는 니켈 농도보다 높은 농도로 제공되어, 일산화탄소 영양 세균에 의한 CO 흡수가 증가한다.
일산화탄소 영양 미생물에 의한 CO 함유 기질의 발효는 기질을 원하는 속도로 제공하고 질소, 인, 칼륨, 황, 비타민 및 미량 금속과 같은 기타 필요한 영양분의 제공을 수반한다. 통상적으로, 상기 미생물은 1종 이상의 용해된 영양분을 함유하는 액체 영양 배지에 현탁되지만, 기질은 가스상 스트림으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 미생물은 생물막을 형성할 수도 있으나, 영양분은 마찬가지로 액체 영양 배지로 제공된다. 일산화탄소 영양 미생물에 의한 CO 함유 기질의 공지 발효 공정에서, 액체 영양 배지의 니켈 성분은 통상적으로 10 μmol/L 미만과 같은 낮은 마이크로 몰 범위로 존재한다.
본 발명의 특정 실시 상태에서, 니켈은 적어도 10 μM; 또는 적어도 50 μM; 또는 적어도 100 μM; 또는 적어도 200 μM; 또는 적어도 500 μM; 또는 적어도 1 mM; 또는 적어도 3 mM의 농도로 제공된다. 니켈은 미생물 생장 및/또는 산물 생합성을 뒷받침하기에 적합한 영양분을 함유하는 액체 영양 배지에 적어도 2.5 mg/L; 또는 적어도 10 mg/L; 또는 적어도 100 mg/L; 또는 적어도 500 mg/L 농도로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 니켈은 적어도 2.5 mg/L/미생물 세포 건조 중량 그램; 또는 적어도 10 mg/L/g; 또는 적어도 100 mg/L/g; 또는 적어도 500 mg/L/g의 농도로 유지된다.
예를 들어 증가된 CO 흡수 및/또는 증가된 생장 및/또는 증가된 알콜 생성과 같은 원하는 결과를 달성하기 위하여 발효 공정에 제공되는 최적 니켈의 양은 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적 생장을 위하여 양호한 농도는 다양한 니켈 농도로 발효를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다. 이하 실시예 부분은 최적 니켈 농도를 결정하기 위한 예시 방법을 제공한다.
추가적인 보조 인자 및/또는 금속의 존재는 일산화탄소 영양 세균이 CO 함유 기질을 이용할 수 있는 속도에 영향을 줄 수 있는 것으로 여겨진다. 특정 실시 상태에서, 니켈은 철, 코발트 및/또는 아연 등의 기타 금속 및/또는 보조 인자와 조합하여 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:철 비가 적어도 1:2; 또는 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:코발트 비가 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:아연 비가 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다.
일산화탄소 흡수율은 미생물 배양체의 생장률 및/또는 산 및 알콜 등의 산물 생성률과 관련이 있다. 따라서, 특정 실시 상태에서, 생장률 및/또는 CO 함유 기질을 발효시키는 미생물 배양체의 최대 생장은 본 발명의 방법에 따라 니켈을 제공함으로써 증가될 수 있다. 이에 더하여 또는 별법으로, 상기 알콜 생성률 및/또는 CO 함유 기질을 발효시키는 미생물 배양체에 의하여 제조되는 최적 알콜 농도는 본 발명의 방법에 따라 니켈을 제공함으로써 증가될 수 있다.
이에 더하여 또는 별법으로, 본 발명의 방법에 따라 CO 함유 기질을 발효시키는 것은 아세테이트 등의 산을 많은 양으로 생산함이 없이 에탄올과 같은 알콜의 생산이라는 결과를 낳는다. 따라서, 특정 실시 상태에서, 에탄올은 에탄올:아세테이트 비가 10:1; 또는 적어도 20:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1보다 큰, 발효 반응의 주요 생성물이다. 아세테이트와 같은 산을 실질적으로 감소된 양으로 가지는 에탄올을 생산하는 것은 많은 이점을 갖는다. 아세테이트가 상당한 부산물로 생성되는 공지의 계에서, 상기 아세테이트는 통상적으로 연속식으로 바이오리액터로부터 제거된다. 따라서, 연속식 배양체를, 원하는대로 아세테이트 농도를 낮게 유지하기 위하여는 많은 부피의 배지가 필요하다. 이에 더하여, 바이오리액터에서 배출되는 배지 스트림으로부터 아세테이트가 제거되지 않으면, 사용된 배지는 추후 산물 회수에 재활용될 수 없다. 특정 실시 상태에서, 본 발명은 아세테이트를 거의 또는 전혀 생성하지 않는, CO 함유 기질의 발효에 의한 알콜 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 니켈과 같은 1종 이상의 금속 보조 인자가, 통상적으로 바이오리액터에서 일어나는 발효 반응에 기정 시간에 첨가된다. 기정 시간에 첨가되는 이들 임의의 보조 인자의 수준은 영양 배지의 초기 접종으로부터의 시간, 미생물의 생장 주기 및 상기 금속의 소모 속도에 달려있다는 것이 이해되어야 한다. 상기 보조 인자는 염의 형태로 첨가될 수 있다. 통상적으로 보조 인자는 1종 이상의 희석제, 담체 및/또는 기타 성분들과 조합하여 존재하는 조성물의 형태로 첨가될 것이다. 본 발명의 가장 간단한 형태에서, 상기 조성물은 보조 인자 이온/염 및 물로 구성된다. 본 발명에 따르면, 특정 보조 인자의 첨가는 미생물에 의한 CO의 흡수를 증가시킬 것이다. 본 발명의 특정 형태에서 상기 보조 인자는 발효 반응에서(기타 다른 성분들과 비교하여 보조 인자의 농도가 상대적으로 높다는 것 외에는) 실질적으로 매치되는 영양 배지 또는 대안의 상보 배지에 제공된다. 상기 조성물은 좋기로는 예를 들어 수성 염기로 대략 pH 4.4 또는 6으로 완충된 인산 및/또는 아세테이트를 이용하여 완충된다. 상기 보조 인자를 함유하는 용액은 혐기성 가스로 처리되기 전 또는 혐기성 조건에 옮겨지기 전에 이들 용액으로부터 산소를 제거하기 위하여 오토클레이브 또는 여과에 의하여 멸균될 수 있다. 상기 보조 인자는 미생물의 CO 흡수를 제한할 수 있는 수준까지 감소되었다는 우려가 있는 어떤 시점에라도 발효 반응에 첨가될 수 있다. 보조 인자는 반응 배지에서의 그 농도가 상기 언급된 범위 이내가 되도록 계산된 속도로, 바이오리액터 내로 불연속적으로 또는 연속적으로 주입된다.
이 기술 분야의 일반적 기술을 가진 자라면 알콜 생성의 평균 속도, 보조 인자의 평균 소모 속도 및/또는 세포 밀도의 평균 증가 속도 관찰에 기초하여, 특히 본 명세서에 제공되는 "실시예"를 참고하면 발효 공정 중 상기 보조 인자의 적당한 연속 전달 속도를 계산할 수 있을 것이다.
불연속적으로 보조 인자를 첨가하는 것에 관하여, 당업자는 상기 언급된 평균 알콜 생성 및 보조 인자의 소모 속도를 측정하여 발효 반응에 상기 보조 인자가 보충될 필요가 있는 시점을 계산할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 연속적으로 또는 원하는 시간에 상기 보조 인자를 반응에 첨가할 수 있을 것이다. 혹은, 당업자는 특정 시간에 상기 보조 인자, 1종 이상의 발효 반응 산물(예를 들어 알콜 및/또는 산) 및/또는 세포 밀도의 수준을 측정하기 위하여 바이오리액터로부터 시료를 채취하여 발효 공정을 능동적으로 모니터할 수 있을 것이다. 이러한 시료 채취로부터 얻은 정보는 작업자로 하여금 다음에 수행될 단계에 대하여 충분한 정보에 기초한 결정을 할 수 있도록 한다. 예를 들어, 보조 인자 및/또는 관련 발효 산물의 수준 또는 농도가 낮으면 작업자는 바이오리액터로 추가적인 보조 인자를 도입할 것을 결정할 수 있다. 보조 인자의 농도 또는 원하는 발효 산물의 수준이 높으면 작업자는 발효 반응의 보충을 늦추는 선택을 할 수 있다.
발효 배지에서 보조 인자가 심각한 정도로 소모될 것 같지는 않지만, 농도는 양호한 기정 수준으로 유지될 수 있다. 발효 배지에서 보조 인자의 수준은 이 기술 분야의 표준 방법론으로 측정될 수 있다. 그러나 예로 질량 분석법, 유도결합 플라즈마 질량 분석법, HPLC, 원자 흡수 질량 분석법 또는 볼타메트리가 사용될 수 있다.
세포 밀도를 이 기술분야의 공지 표준 기술로 측정할 수 있다. 그러나, 예로서, 현미경 하 육안 관찰 또는 좋기로는 분광광도계를 이용하는 광학 밀도 측정이 사용된다. 600nm에서의 광학 밀도 측정(OD600)이 특히 유용하다.
1종 이상의 발효 산물(알콜 및/또는 산) 수준을 이 기술 분야의 공지 표준 방법론을 사용하여 측정할 수 있다. 예로서, 이들은 가스 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피, 효소계 실험 또는 비색 또는 형광 실험으로 규명 및 측정될 수 있다.
상기 금속은 임의의 공지 방법에 의하여 바이오리액터에 첨가될 수 있다. 그러나, 예로서 용액은 리액터 내로 전용 펌프를 통해 자동으로 또는 주사기를 이용하여 중격으로 덮힌 출입구를 통하여 수기로 도입될 수 있다. 이에 더하여 또는 별법으로, 상기 보조 인자는 연속식으로 주입되는 바이오리액터에 보충되는 새 배지에 첨가될 수 있다. 이러한 실시 상태에서, 새 보충 배지의 상기 보조 인자는 특정 발효 공정을 위하여 양호한 기정 양과 매치될 것이다.
발효 배지
본 발명의 또 다른 구체예에서, 신규한 발효 배지는 니켈을 적어도 10 μM; 또는 적어도 50 μM; 또는 적어도 100 μM; 또는 적어도 200 μM; 또는 적어도 500 μM; 또는 적어도 1 mM; 또는 적어도 3 mM의 농도로 함유하도록 제공된다. 니켈은 미생물 생장 및/또는 산물 생합성을 뒷받침하기에 적합한 영양분을 함유하는 액체 배지에 적어도 2.5 mg/L; 또는 적어도 10 mg/L; 또는 적어도 100 mg/L; 또는 적어도 500 mg/L의 농도로 제공될 수 있다. 특정 실시 상태에서, 상기 니켈은 적어도 2.5 mg/L/미생물 세포 건조 중량 그램; 또는 적어도 10 mg/L/g; 또는 적어도 100 mg/L/g; 또는 적어도 500 mg/L/g의 농도로 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시 상태로, 니켈은 적어도 철, 코발트 및/또는 아연을 함유하는 액체 영양 배지로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 니켈은 니켈:철 비가 적어도 1:2; 또는 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:코발트 비가 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다. 특정 실시 상태에서, 상기 금속 및/또는 보조 인자는 니켈:아연 비가 적어도 1:1; 또는 적어도 2:1; 또는 적어도 5:1; 또는 적어도 10:1; 또는 적어도 50:1; 또는 적어도 100:1 등으로 제공된다.
상기 배지는 1종 이상의 니켈염을 이용하여 제조되어야 함이 이해되어야 한다. 양호한 염은 염화 니켈, 황산 니켈, 탄산 니켈 또는 아세트산 니켈을 포함한다. 유사하게 철, 코발트 및/또는 아연염이 또한 배지의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명과 관련된 기술분야의 숙련자라면 원하는 니켈의 농도 및 그들의 분자량에 기초하여 배지를 제조하는데 필요한 각 염의 양을 쉽게 알 수 있을 것이다.
이 기술분야 알려져 있듯이 상기 영양 배지가 또한 세균 생장에 양호하거나 필요한 기타 성분들을 함유한다는 것이 이해되어야 한다. 성분의 예로는 본 명세서에서 이 부분 뒤에 "실시예"로 설시된 것들이 포함된다. 추가의 실시예들은 상기 언급했던 US 5,173,429호 및 5,593,886호 및 WO 02/08438호에서 제공된다.
이 기술분야의 공지 표준 과정에 따라 제조된 배지가 본 명세서 및 US 5,173,429호 및 5,593,886호 및 WO 02/08438호에 예시되어 있다. 사용하기 전에, 필요하다면, "실시예"라는 제목의 부분으로 본 명세서에 예시되어 있는 표준 과정을 이용하여 상기 배지를 혐기성으로 만들 수 있다.
본 발명은 이하 비제한적 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.
실시예
배지의 제조
Figure 112011050664489-pct00001
Figure 112011050664489-pct00002
Figure 112011050664489-pct00003
실시예 1~5의 배지 제조
배지를 다음과 같이 pH 5.5로 준비하였다. 시스테인 HCL을 제외한 모든 성분들을 400 ml dH2O에서 혼합하였다. 95% CO, 5% CO2 가스를 끊임없이 흐르게 하면서 이 용액을 가열 비등시킨 다음 실온으로 냉각시켜 혐기성 상태로 만들었다. 일단 냉각 후에, 시스테인 HCL을 첨가하여 용액의 pH를 5.5로 조정한 다음 용액의 부피를 1000 ml로 만들었다. 실험 내내 혐기성 조건을 유지시켰다.
실시예 6의 배지 제조
모든 배지 성분들을 1 L dH2O에 용해시키고 HCL로 용액의 pH를 5.5로 조정하였다. 그 후 배지를 끓여 95% CO/5% CO2 가스하에서 현탁시켜 121℃에서 15 분간 오토클레이브하였다. 사용하기 직전에, 시스테인 HCL(4.0 g/l) 및 Na2S(4.0 g/l)의 환원제의 멸균 스톡 용액을 총 농도 0.006%(w/v)로 첨가하였다.
크롬( II ) 용액의 제조
1 L 삼구 플라스크를 기밀성 가스 입구 및 출구를 가지도록 하여 불활성 가스하에서 사용하고, 이어서 원하는 산물을 적합한 저장 플라스크로 옮길 수 있게 하였다. 상기 플라스크를 4O g(0.15 mol) CrCl3.6H20, 18.3 g 20 메쉬 아연 그래뉼(0.28 mol) 및 13.55 g 또는 1 mL 수은(0.0676 mol) 및 500 mL 증류수로 채웠다. 플라스크에 한 시간 동안 N2를 흘려보내어 세정한 후, 상기 혼합물을 약 80℃로 덥혀 반응을 개시하였다. 이후 두 시간을 일정하게 N2를 흘려보내면서 교반하고, 반응 혼합물이 진한 푸른색 용액으로 전환될 때까지 상기 혼합물을 48 시간 동안 실온에서 연속 교반하였다. 용액을 N2 제거 세럼병으로 옮기고 냉장고에 저장하였다.
실시예 1~5의 금속 용액의 제조
사용되는 금속 염은 FeCl3, CoCl2.6H2O, 및 NiCl2.6H2O이다. 각 금속 염을 50 ml 물이 담긴 세럼병에 더하여 0.1 M 스톡 용액을 제조하였다. N2를 용액을 통과시켜 기포가 생기도록 하고 그 후 상기 보틀을 오토클레이브하였다. 스톡 용액은 그 후 혐기성으로 유지하여 배지에 첨가되었다.
실시예 6의 금속 용액의 제조
생장 실험 중 다양한 니켈 농도를 얻기 위하여, 11.8 g/L NiCl2 를 함유하는 니켈 스톡을 제조하고 121℃에서 15 분간 오토클레이브하였다.
미생물
실시예 1~5: 사용된 클로스트리듐 오토에타노게눔은 독일생물자원센터(DSMZ)에 기탁되고 수탁 번호 19630를 부여받았다.
실시예 6: 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM 10061, 클로스트리듐 카르복시디보란스 DSM 15243, 및 클로스트리듐 륭달리이 DSM 13528를 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)로 부터 얻었다.
시료채취 및 분석 과정:
원하는 시점에 발효 반응으로부터 배지 시료를 채취하였다. 배지를 채취할 때마다 리액터에 가스가 유입되거나 그로부터 가스가 유출되지 않도록 주의를 기울였다.
세포 밀도를 측정하기 위해 모든 샘플을 이용하여 600 nm(분광광도계)에서의 흡수도를 측정하고 외삽법으로 건조 중량을 측정하였다.
HPLC:
기질 및 아세테이트, 에탄올, 과당, 자일로스 및 파이루베이트 등의 산물의 수준을 특징화하기 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하였다. HPLC System Agilent 1100 시리즈. 이동상: 0.0025 N 황산. 유량 및 압력: 0.800 mL/min. 컬럼: Alltech IOA; 카탈로그 # 9648, 150 x 6.5 mm, 입도 5 ㎛. 컬럼 온도: 60℃. 검출기: 굴절률. 검출기 온도: 45℃.
샘플 제조 방법: 샘플 400 μL+ 0.15 M ZnSO4 50 μL+ 0.15 M Ba(OH)2 50 μL를 에펜도르프 튜브에 넣는다. 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상등액 200 μL를 HPLC 바이알에 넣고 HPLC 장치에 5 μL를 주입한다.
실시예 1: 선택된 금속의 발효 산물에 대한 효과
멸균 234 ml 세럼병을 95% CO, 5% CO2 가스로 세 차례 씻어내고 그 후 5 psi까지의 진공으로 낮추었다. 세럼병을 25 ml LM33 배지로 충전하고 Cr(II) 용액을 첨가하였다(최종 농도 0.4 mM). 세럼병에 필요에 따라 FeCl3, NiCl2 및 CoCl2 용액을 첨가하고(각각 최종 농도 1 mM, 0.5 mM 및 0.5 mM로) 연속식 바이오리액터에서 왕성하게 생장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체 2 ml로 접종하였다. 세럼병의 헤드스페이스를 그 후 CO 함유 가스로 30 psi까지 채웠다(조성 50% CO; 20% CO2; 3% H2; 27% N2). 세럼병을 37℃에서 배양하고 연속하여 교반하였다. 시료 채취 후 일정 시간 간격으로 시료를 채취하고 헤드스페이스를 비워 30 psi로 다시 채웠다.
결과: 표 1은 수일에 걸친 상기 발효 반응의 대사 물질 농도를 나타낸 것이다.
Figure 112011050664489-pct00004
LM33은 니켈을 대략 1 μM의 농도로 함유한다. CO를 함유하는 기질의 발효에 사용되는 기타 공지의 배지는 대략 8 μM까지의 농도의 니켈을 함유한다. 분명히, 이러한 비교적 낮은 니켈 농도에서는, 아세테이트가 주요 산물이다. 그러나, 상기 배지에 추가의 니켈, 코발트 및 철이 제공되면, 총 대사 산물(아세테이트 및 에탄올)이 대략 50% 증가한다. 이에 더하여, 상기 금속은 또한 80 시간 이후에 에탄올의 생성을 총 5배 증가시키는 자극 효과를 가진다.
실시예 2A: 생장 및 대사 산물 생성에 미치는 니켈 농도의 효과
멸균 234 ml 세럼병을 95% CO, 5% CO2 가스로 세 차례 씻어내고 그 후 5 psi까지의 진공으로 낮추었다. 세럼병을 25 ml LM33 배지로 충전하였다. 필요에 따라 추가 NiCl2 용액을 세럼병에 첨가하여(최종 농도 0.1 mM 및 1 mM) 연속식 바이오리액터에서 왕성하게 생장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체 19630 1 ml로 접종하였다. 세럼병의 헤드스페이스를 그 후 CO 함유 가스로 30 psi까지 채웠다(조성 100% CO). 세럼병을 37℃에서 배양하고 연속하여 교반하였다. 시료 채취 후 일정 시간 간격으로 시료를 채취하고 헤드스페이스를 비워 30 psi로 다시 채웠다.
결과: 표 2는 다양한 니켈 농도에서 미생물 생장 속도 및 대사 산물 속도를 나타낸 것이다.
Figure 112011050664489-pct00005
니켈의 추가 없는 대조군 발효는 총 미생물 세포 밀도가 대략 0.5 g/L까지 생장한 반면, 니켈 농도가 높으면(상기 LM33 0.1 mM 및 1 mM), 세포 밀도는 각각 1.1 및 1.2 g/L까지 증가하였다. 이에 더하여, 니켈의 농도가 높은 경우, 총 대사 산물 생산량이 또한 상승하였다. 이에 더하여, 에탄올:아세테이트 비는 분명하게 니켈의 농도가 높을 때 에탄올이 증가하는 방향으로 움직였다. 니켈 농도가 0.1 mM인 경우, 30 시간 경과 후 에탄올:아세테이트 비는 대략 19:1(v/v)였다. 이는 대략 23:1 몰비와 동일한 것이다.
실시예 2B: 생장 및 대사 산물 생성에 미치는 니켈 농도의 효과
멸균 234 ml 세럼병을 95% CO, 5% CO2 가스로 세 차례 씻어내고 그 후 5 psi까지의 진공으로 낮추었다. 세럼병을 25 ml LM33 배지로 충전하였다. NiCl2 용액(최종 농도 1 mM로) 및 과당(3 g/L)를 세럼병에 첨가하여 연속식 바이오리액터에서 왕성하게 생장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체 19630 1 ml로 접종하였다. 세럼병의 헤드스페이스를 그 후 CO 함유 가스로 30 psi까지 채웠다(조성 100% CO). 세럼병을 37℃에서 배양하고 연속하여 교반하였다. 시료 채취 후 일정 시간 간격으로 시료를 채취하고 헤드스페이스를 비워 30 psi로 다시 채웠다.
결과: 표 3은 시간 흐름에 따른 CO 함유 기질과 과당으로부터의 미생물 생장 및 대사 산물 생성을 보여준다.
Figure 112011050664489-pct00006
과당과 같은 추가 기질의 존재하에서, 니켈 농도의 증가는 에탄올:아세테이트 산물의 비를 양호하게 하였다. 발효 반응의 초기 단계 중에(30 시간까지), 과당은 소비되었고 에탄올과 아세테이트 비는 9:1을 넘었다. 그러나, 과당이 완전히 소비되고(30 시간 후), 에탄올:아세테이트 비는 적어도 25:1(v/v) 또는 적어도 30:1(몰 비)로 증가하였다.
실시예 4: 가스 소비에 대한 니켈의 효과
멸균 234 ml 세럼병을 95% CO, 5% CO2 가스로 세 차례 씻어내고 그 후 5 psi까지의 진공으로 낮추었다. 세럼병을 25 ml LM33 배지로 충전하였다. NiCl2 용액 및 과당(30 g/L) 및 효모 추출물(5 g/L)를 필요에 따라 세럼병에 첨가하고 오토클레이브하였다. 크롬(II) 용액을 필요에 따라 세럼병에 첨가하여(최종 농도 0.4 mM) 연속식 바이오리액터에서 왕성하게 생장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체 19630 1 ml로 접종하였다. 세럼병의 헤드스페이스를 그 후 CO 함유 가스로 30 psi까지 채웠다(조성 100% CO). 세럼병을 37℃에서 배양하고 연속하여 교반하였다. 시료 채취 후 일정 시간 간격으로 시료를 채취하고 헤드스페이스를 비워 30 psi로 다시 채웠다.
결과: 표 4는 CO 함유 기질에 더하여 증강된 과당/효모 추출물(FYE)을 이용하는 발효 반응의 미생물 생장 및 대사 산물 생성을 비교한 것이다.
Figure 112011050664489-pct00007
18 시간에, 두 개의 발효 반응 모두는 유사한 생장 단계(세포 밀도 대략 0.7~0.8 g/L)에 있었다. 그 후 12 시간 동안, 대조군 발효(추가 니켈 없는)의 바이오매스는 90% 이상 증가하였다. 그러나, 추가 니켈을 함유하는 반응에서는 대략 120%가 증가하였다. 놀랍게도, 이 시간 동안, 대조군 발효는 단지 10 g/L을 넘는 과당, 및 적은 양의 CO를 소비하였다. 그러나, 추가 니켈을 함유하는 반응은 과당을 훨씬 덜(대략 5 g/L) 소비하였지만 실질적으로 사용 가능한 모든 CO를 소비하였다.
이 시간 동안, 추가 니켈을 함유하는 반응은 또한 80% 이상의 더 많은 대사 산물(추가 니켈이 없는 반응에서 4.1 g/L인 것과 대조적으로 7.6 g/L 아세테이트 + 에탄올)을 생성하였다. 이들 결과는 추가 니켈이 CO 흡수를 증가시켜 총 생장 및 생장 속도 및 대사 산물 생성을 증가시킴을 보여준다.
실시예 5: 미생물 생장에 미치는 니켈 농도의 효과
LM33과 추가 니켈(1 mM NiCl2)을 함유하는 배지를 LM33에 1 ml/웰의 부피로 96 웰 플레이트에서 순차적으로 희석하여, 이하 표시된 추가 니켈 농도를 만들었다(표 5 참조). 각 웰을 연속식 바이오리액터에서 왕성하게 생장하고 있는 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체 19630 50 μL로 접종하였다. 상기 웰을 완전히 섞고 각 웰에서 200 μL를 96 웰 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 그 후 통기성 밀봉 필름으로 상기 플레이트를 밀봉하고 혐기성 압력 용기에 위치시켰다. 이 용기를 100% CO 가스로 30 psi까지 가압하여 37℃에서 배양되는 챔버 내 오비탈 쉐이커(150 rpm) 상에 위치시켰다. 시료를 배양 54 시간 후 분석하였다.
결과: 표 5는 증가된 니켈 농도(LM33 내의 니켈 백그라운드 수준에 더하여)의 기능으로서 클로스트리듐 오토에타노게눔의 최종 생장 밀도 및/또는 생장 속도를 비교한 것이다. 니켈 농도를 증가시키면(LM33 + 800 μM까지) 미생물 생장이 증가한다.
Figure 112011050664489-pct00008
실시예 6: 3가지 클로스트리디아 세균에서 미생물 생장에 대한 니켈 농도의 효과
클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM 10061, 클로스트리듐 카르복시디보란스 DSM 15243, 및 클로스트리듐 륭달리이 DSM 13528 등의 초산 생성균 범주의 세균에 미치는 니켈의 효과를 시험하기 위하여, 95% CO, 5% CO2 가스로 세 차례 씻어내고 그 후 5 psi까지의 진공으로 낮춘 멸균 234 ml 세럼병에서 생장 실험을 수행하였다. 상기 세럼병을 다양한 농도의 염화 니켈(1 μM, 200 μM, 400 μM, 700 μM, 및 1000 μM)을 함유하는 50 mL PETC 배지로 충전하고 동일한 전-배양으로부터의 접종원으로 접종시켰다. 상기 세럼병을 CO 함유 가스(2% H2; 30% N2; 47% CO; 21% CO2)로 30 psi의 과압까지 충전하였다. 상기 가스를 씻어내고 54 시간 후 재충전하였다. 생장을 600 nm(OD 600nm)에서 측정하여 모니터하고 대사 산물을 HPLC로 검출하였다.
결과: 표 6은 다양한 니켈 농도에서 클로스트리듐 오토에타노게눔(DSM10061)의 미생물 생장 및 대사 산물을 나타낸다. 표 7은 다양한 니켈 농도에서 클로스트리듐 카르복시디보란스(DSM15243)의 미생물 생장 및 대사 산물을 나타낸다. 표 8은 다양한 니켈 농도에서 클로스트리듐 륭달리이(DSM13528)의 미생물 생장 및 대사 산물을 나타낸다. 세 가지 모든 발효에서 니켈 농도를 높이면 미생물 생장 및 에탄올 생성이 증가한다.
Figure 112011050664489-pct00009
Figure 112011050664489-pct00010
Figure 112011050664489-pct00011
본 발명은 독자가 과도한 실험 없이 본 발명을 실시할 수 있게 하기 위하여 특정 양호한 실시 상태에 준거하여 본 명세서에 기술되었다. 이 기술 분야의 숙련자라면 본 명세서에 구체적으로 설명된 것들 이외에도 변형예와 개조예가 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변형예 및 개조예를 포괄한다. 뿐만 아니라, 제목, 표제 등은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것이므로, 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
상기 및 하기에 인용된 모든 출원, 특허 및 기타 문헌은 그 내용이 본 발명에 참고로 포함되었다.
본 발명 명세서에서 종래기술과 관련한 언급은 세계 어느 국가에서건 본 발명 분야에서 그러한 종래 기술이 일반 상식 수준의 일부를 구성함을 인정하거나, 또는 그러하다고 암시하는 것도 아니고, 또 그러한 의미로 받아들여져서도 아니된다.
본 발명의 상세한 설명과 특허청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 필요하지 않는 한, "포함하다", "포함하는" 등의 용어는 배타적인 의미와 반대로 포괄적인 의미로 이해되어야 하며, 따라서 "포함하며, 이에 한정되지 않는"의 의미로 이해되어야 한다.

Claims (23)

  1. 산, 알콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 산물을 제조하는 방법으로서, 1종 이상의 일산화탄소 영양(carboxydotrophic) 미생물의 배양체를 포함하는 바이오리액터에 CO를 포함한 기질을 제공하는 단계 및 상기 기질을 혐기적으로 발효시켜 1종 이상의 산물을 제조하는 단계를 포함하고, 상기 배양체는 200 μM 이상의 니켈을 함유하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 산과 알콜 둘다가 제조되고 알콜:산의 비가 10:1 이상인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 알콜:산의 비가 20:1 이상인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 알콜은 에탄올이고 산은 아세테이트인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 니켈은 염화니켈, 황산니켈, 탄산니켈, 아세트산니켈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물의 수용액으로서 상기 배양체에 첨가되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 니켈 화합물이 염화니켈인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 니켈은 200 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 니켈은 300 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 니켈은 400 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 기질은 15 부피% 내지 100 부피%의 CO를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 기질은 40 부피% 내지 70 부피%의 CO를 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 기질은 스틸 밀(steel mill)로부터 얻어지는 가스를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 일산화탄소 영양 미생물은 클로스트리듐(Clostridium), 무렐라(Moorella), 피로코쿠스(Pyrococcus), 유박테리움(Eubacterium), 데설포박테리움(Desulfobacterium), 카르복시도써무스(Carboxydothermus), 아세토제니움(Acetogenium), 아세토박테리움(Acetobacterium), 아세토안에어로비움(Acetoanaerobium), 부티리박테리움(Butyribacterium) 및 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 일산화탄소 영양 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxydivorans) 또는 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii)인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 배양체는 1:2 내지 100:1의 Ni:Fe 비로 존재하는 철을 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 배양체는 1:1 내지 100:1의 Ni:Co 비로 존재하는 코발트를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 배양체는 1:1 내지 100:1의 Ni:Zn 비로 존재하는 아연을 더 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 배양체는 1:1 내지 100:1의 Ni:Zn 비로 존재하는 아연을 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 배양체는 1:1 내지 100:1의 Ni:Co 비로 존재하는 코발트를 더 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 배양체는 1:1 내지 100:1의 Ni:Zn 비로 존재하는 아연을 더 포함하는 것인 방법.
  21. 삭제
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