BR112013003644B1

BR112013003644B1 - isolado biologicamente puro de uma bactéria clostridium autoethanogenum

Info

Publication number: BR112013003644B1
Application number: BR112013003644-3A
Authority: BR
Inventors: Bjorn Daniel Heijstra; Evgenia Kern; Michael Koepke; Simon Segovia; Fungmin Liew
Original assignee: Lanzatech New Zealand Limited
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2020-11-17
Also published as: US20130217096A1; WO2012015317A1; US10494600B2; EP2598630A1; KR20130097174A; CA2786903C; JP2013532481A; BR112013003644A2; AU2011283282B2; KR101375038B1; ZA201300612B; EA025778B1; CN103415612B; AU2011283282A1; EA201390179A1; CN103415612A; JP5922657B2; AU2011283282C1; EP2598630B1; US20160017276A1

Abstract

BACTÉRIAS E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se geralmente ao campo da fermentação microbiana de gases. Mais particularmente, refere-se a uma nova classe de bactérias com eficiência melhorada na produção de etanol pela fermentação anaeróbica de substratos contendo monóxido de carbono (CO).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se geralmente ao campo de fermentação microbiana de gases. Mais particularmente refere-se a uma nova classe de bactérias com eficiência melhorada na produção de etanol por fermentação anaeróbica de substratos contendo monóxido de carbono (CO).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O etanol está tomando-se rapidamente um combustível de transporte líquido rico em hidrogênio principal em tomo do mundo. O consumo mundial de etanol em 2005 foi aproximadamente 12,2 bilhões de galões. O mercado global da indústria de etanol combustível também foi predito crescer acentuadamente no futuro, devido a um interesse aumentado no etanol na Europa, Japão, EUA e vários países em desenvolvimento.

[003] Por exemplo, nos EUA, o etanol é usado para produzir E10, uma mistura de 10% de etanol na gasolina. Na mistura E10, o componente etanol atua como um agente de oxigenação, melhoria da eficiência de combustão e redução da produção de poluentes do ar. No Brasil, o etanol satisfaz aproximadamente 30% da exigência de combustível de transporte, como tanto um agente de oxigenação misturado à gasolina, como um combustível puro por si só. Também, na Europa, assuntos ambientais circundando as consequências das emissões de gases de efeito estufa (GHG) têm sido o estímulo da União Européia (UE) para estabelecer às nações- membro uma meta de mandato para o consumo de combustíveis sustentáveis de transporte, tais como etanol derivado de biomassa.

[004] A vasta maioria do etanol combustível é produzida através de processos tradicionais de fermentação baseados em levedura usando carboidratos derivados de culturas, tais como sacarose extraída de cana-de- açúcar ou amido extraído de culturas de grãos, como a fonte de carbon principal. Entretanto, o custo destes estoques de alimentação de carboidratos está sob o efeito de seu valor como alimento humano ou forragem, enquanto o cultivo de culturas de amido ou produtoras de sacarose para produção de etanol não é economicamente sustentável em todas as áreas geográficas. Por isso, é de interesse desenvolver tecnologias de converter recursos de carbono de custo mais baixo e/ou mais abundantes em etanol combustível.

[005] CO é um subproduto principal, livre, rico em energia da combustão incompleta de materiais orgânicos, tais como carvão ou petróleo e produtos derivados de petróleo. Por exemplo, é relatado que a indústria de aço na Austrália produza e lance na atmosfera mais de 500.000 toneladas de CO anualmente.

[006] Processos catalíticos podem ser usados para converter gases que consistem principalmente de CO e/ou CO e hidrogênio (H2) em uma variedade de combustíveis e produtos químicos. Micro-organismos também podem ser usados para converter estes gases em combustíveis e produtos químicos.

[007] A capacidade de micro-organismos de se desenvolver em CO como uma fonte única de carbono foi primeiro descoberta em 1903. Isto foi depois determinado sendo uma propriedade de organismos que usam a via bioquímica de acetil coenzima A (acetil CoA) de crescimento autotrófico (também conhecida como via de Woods-Ljungdahl e via de monóxido de carbono desidrogenase/acetil CoA sintase (CODH/ACS)). Foi mostrado que um grande número de organismos anaeróbicos incluindo organismos carboxidotróficos, fotossintéticos, metanogênicos e acetogênicos metabolizam CO a vários produtos finais, ou seja, CO2, Ft, metano, n-butanol, acetato e etanol. Usando CO como a fonte única de carbono, todos tais organismos produzem pelo menos dois destes produtos finais.

[008] Bactérias anaeróbicas, tais como aquelas do gênero Clostridium,demonstraram produzir etanol de CO, CO2 e H2 através da via bioquímica de acetil CoA. Por exemplo, várias cepas de Clostridium Ijungdahlii que produzem o etanol a partir de gases são descritas em WO 00/68407, EP 117309, patente US nos. 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438. Também é conhecido que a bactéria Clostridium autoethanogenum sp produz etanol a partir de gases (Abrini et al.,Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

[009] Entretanto, a produção de etanol por micro-organismos pela fermentação de gases está associada sempre com a coprodução de acetato e/ou ácido acético. Como uma parte do carbono disponível é convertida em acetato/ácido acético em vez de etanol, a eficiência da produção de etanol usando tais processos de fermentação pode ser menor do que a desejável. Também, a menos que o subproduto acetato/subproduto ácido acético possa ser usado com algum outro objetivo, pode representar um problema de eliminação de resíduos. O Acetato/ácido acético é convertido em metano por micro-organismos e por isso tem o potencial para contribuir para as emissões GHG.

[0010] A fermentação microbiana de CO na presença de H2 pode levar à transferência de carbono substancialmente completa em um álcool. Entretanto, na ausência de H2 suficiente, um pouco do CO é convertido em álcool, enquanto uma porção significante é convertida em CO2 como mostrado nas seguintes equações: 6CO + 3H2O -► C2H5OH + 4CO2 12H2 + 4CO2 -> 2C2H5OH + 6H2O

[0011] A produção de CO2 representa a falta de eficiência na captura de carbono total e se liberado, também tem o potencial para contribuir para emissões de gases de efeito estufa.

[0012] WO2007/117157 descreve um processo que produz álcoois, particularmente etanol, pela fermentação anaeróbica de gases contendo monóxido de carbono. O acetato produzido como um subproduto do processo de fermentação é convertido em gás hidrogênio e gás dióxido de carbono, ou ambos os quais podem ser usados no processo de fermentação anaeróbica.

[0013] WO2008/115080 descreve um processo da produção de álcool(is) em múltiplos estágios de fermentação. Os subprodutos produzidos em consequência da fermentação anaeróbica de gás(es) em um primeiro biorreator podem ser usados para produzir produtos em um segundo biorreator. Além disso, os subprodutos do segundo estágio de fermentação podem ser reciclados para o primeiro biorreator para produzir produtos.

[0014] WO2009/064200 descreve uma classe nova de bactérias que melhorou a eficiência na produção de etanol por fermentação anaeróbica de substratos contendo monóxido de carbono.

[0015] Seria benéfico fornecer micro-organismos que são capazes de fermentação de gases contendo monóxido de carbono a etanol com eficiência aumentada, que são micro-organismos capazes de absorção melhorada de monóxido de carbono, da produção de mais etanol, e/ou uma maior proporção de etanol para acetato do mesmo substrato, do que os micro-organismos da técnica prévia.

[0016] É um objetivo da presente invenção fornecer uma nova classe de bactérias que supera uma ou mais das limitações da técnica anterior na conversão de fontes gasosas contendo CO em etanol, ou pelo menos fornecer ao público uma escolha útil.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, em uma produtividade específica de pelo menos aproximadamente 2 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia.

[0018] Em outras modalidades, a bactéria é capaz de produzir etanol em uma produtividade específica de pelo menos aproximadamente 3 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia, pelo menos aproximadamente 4 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia, pelo menos aproximadamente 5 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia, pelo menos aproximadamente 6 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia ou pelo menos aproximadamente 7 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia.

[0019] Em outro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, em uma produtividade de pelo menos aproximadamente 10 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia.

[0020] Em outras modalidades, a bactéria é capaz de produzir etanol em uma produtividade de pelo menos aproximadamente 20 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia, pelo menos aproximadamente 30 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia, pelo menos aproximadamente 40 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia ou pelo menos aproximadamente 50 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia, ou pelo menos aproximadamente 60 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia, ou pelo menos aproximadamente 70 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia.

[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, e em que a bactéria é capaz de uma absorção específica de pelo menos aproximadamente de CO 1,0 mMol CO/min/g de biomassa.

[0022] Em uma modalidade, a bactéria é capaz de uma absorção específica de CO de pelo menos aproximadamente 1,2 mMol de CO/min/g de biomassa, pelo menos aproximadamente 1,4 mMol de CO/min/g da biomassa, pelo menos aproximadamente 1,6 mMol de CO/min/g da biomassa, pelo menos aproximadamente 1,8 mMol de CO/min/g da biomassa, ou pelo menos aproximadamente 2,0 mMol de CO/min/g da biomassa. Em uma modalidade particular, a bactéria é capaz de uma entrada específica de CO de pelo menos aproximadamente 1,2 mMol de CO/min/g de biomassa.

[0023] Em outro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, e em que a bactéria é capaz de uma taxa de crescimento específica de pelo menos aproximadamente 0,8 dia-1.

[0024] Em certas modalidades a bactéria é capaz de uma taxa de crescimento específica de pelo menos aproximadamente 1,0 dia1, pelo menos aproximadamente 1,2 dia1, pelo menos aproximadamente 1,4 dia1, pelo menos aproximadamente 1,6 dia1, pelo menos aproximadamente 1,8 dia1 ou pelo menos aproximadamente 2,0 dia1.

[0025] Em outro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, e em que a bactéria é capaz de produzir etanol em uma proporção de etanol para acetato de pelo menos aproximadamente 2:1.

[0026] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de produzir etanol em uma proporção de etanol para acetato de pelo menos aproximadamente 3:1, de pelo menos aproximadamente 4:1, de pelo menos aproximadamente 5:1, de pelo menos aproximadamente 7:1 ou de pelo menos aproximadamente 10:1. Em uma modalidade, a bactéria é capaz de produzir etanol com substancialmente nenhum acetato.

[0027] Em outro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, e em que a bactéria é capaz de tolerar álcool de até aproximadamente 30g/L de caldo de fermentação.

[0028] Em certa modalidade, a bactéria é capaz de tolerar álcool de até aproximadamente 40g/L de caldo de fermentação, de até aproximadamente 50g/L de caldo de fermentação, de até aproximadamente 60g/L de caldo de fermentação, ou de até aproximadamente 70g/L de caldo de fermentação.

[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, e em que a bactéria tem duas ou mais das seguintes características: é capaz de produzir produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato compreendendo CO, em uma produtividade específica de pelo menos aproximadamente 2 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama da biomassa/dia; é capaz de produzir etanol em uma concentração de pelo menos aproximadamente 10 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia; é capaz de uma absorção específica de CO de pelo menos aproximadamente 1,0 mMol de CO/min/g da biomassa; é capaz de uma taxa de crescimento de pelo menos aproximadamente 1,0 g/dia; é capaz de produzir etanol em uma proporção de etanol para acetato pelo menos aproximadamente 2:1; e, é capaz de tolerar álcool de até aproximadamente 30g/L do caldo.

[0030] Em uma modalidade, as bactérias da invenção são derivadas de Clostridium autoethanogenum. Em uma modalidade preferencial, a bactéria da invenção é uma cepa de Clostridium autoethanogenum.

[0031] Em uma modalidade particular, a bactéria tem as características definidoras da cepa de Clostridium autoethanogenum depositada no DSMZ sob o número de acesso DMS23693. Em uma modalidade, a bactéria é a cepa de Clostridium autoethanogenum depositada no DSMZ sob o número de acesso DMS23693.

[0032] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um isolado biologicamente puro da cepa de Clostridium autoethanogenum depositado no DSMZ sob o número de acesso DMS23693.

[0033] Em outro aspecto, a invenção fornece um método da produção de um ou mais álcoois compreendendo a fermentação de um substrato compreendendo CO usando uma bactéria como descrito antes neste pedido.

[0034] Em uma modalidade, o método compreende as etapas de: (a) fornecimento de um substrato compreendendo CO a um biorreator contendo uma cultura de uma bactéria da invenção; e (b) fermentação anaeróbica da cultura no biorreator para produzir um ou mais álcoois.

[0035] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para reduzir as emissões atmosféricas totais de carbono de um processo industrial, o método compreendendo: (a) captura de gás contendo CO produzido em consequência do processo industrial, antes do gás ser liberado na atmosfera; (b) fermentação anaeróbica do CO contendo gás para produzir um ou mais álcoois por uma cultura contendo um ou mais bactérias da invenção.

[0036] Em uma modalidade dos aspectos de método, a fermentação é conduzida a uma temperatura de aproximadamente 34°C a aproximadamente 37°C. Em uma modalidade preferencial, a fermentação é conduzida a uma temperatura de aproximadamente 34°C.

[0037] Em certas modalidades dos aspectos de método, o acetato é produzido como um subproduto da fermentação. Preferencialmente um ou mais álcoois produzidos incluem etanol.

[0038] Em modalidades particulares dos aspectos do método, a bactéria é mantida em meio de cultura aquoso.

[0039] Em modalidades particulares dos aspectos do método, a fermentação do substrato é realizada em um biorreator.

[0040] Em certas modalidades, o substrato compreende pelo menos aproximadamente 25% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 30% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 40% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 50% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 65% em volume de CO ou pelo menos aproximadamente 70% em volume de CO. Em modalidades particulares, o substrato compreende pelo menos aproximadamente 75% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 80% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 85% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 90% em volume de CO ou pelo menos aproximadamente 95% em volume de CO.

[0041] Em uma modalidade, o substrato compreende aproximadamente 30% ou menos de H2 em volume. Em outras modalidades, o substrato compreende aproximadamente 20% ou menos H2 em volume, aproximadamente 15% ou menos H2 em volume, aproximadamente 10% ou menos H2 em volume, aproximadamente 5% ou menos H2 em volume, aproximadamente 4% ou menos H2 em volume, aproximadamente 3% ou menos H2 em volume, aproximadamente 2% ou menos H2 em volume, aproximadamente 1% ou menos H2 em volume, ou substancialmente sem H2.

[0042] Em uma modalidade, o substrato compreende menos do que ou igual a CO2 de aproximadamente 20% em volume. Em modalidades particulares o substrato compreende menos do que ou igual a CO2 de aproximadamente 15% em volume, menos do que ou igual a CO2 de aproximadamente 10% em volume, menos do que ou igual a CO2 de aproximadamente 5% em volume ou substancialmente sem CO2.

[0043] Em certas modalidades, o substrato compreendendo CO é um substrato gasoso contendo CO.

[0044] Em certas modalidades, o substrato gasoso compreende um gás obtido como um subproduto de um processo industrial.

[0045] Em certas modalidades, o processo industrial é selecionado a partir do grupo consistindo de fabricação de produtos metálicos ferrosos, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refino de petróleo, gaseificação da biomassa, gaseificação de carvão, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amónia, produção de metanol e fabricação de coque.

[0046] Em uma modalidade, o substrato gasoso pode compreender um gás obtido de um moinho de aço.

[0047] Em outra modalidade, o substrato gasoso pode compreender fumaça de escapamento automobilístico.

[0048] Em certas modalidades dos aspectos do método, o álcool é recuperado do caldo de fermentação, o caldo de fermentação que é o meio de cultura aquoso compreendendo células bacterianas e álcool.

[0049] Em certas modalidades, acetato é produzido como um subproduto da fermentação.

[0050] Em uma modalidade adicional, álcool e acetato são recuperados do caldo.

[0051] Embora a invenção seja amplamente como definida acima, não é limitada a esta e também inclui modalidades das quais a seguinte descrição fornece exemplos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0052] A invenção será descrita agora detalhadamente com referência às Figuras acompanhantes em que: Figura 1: Mostra o consumo de CO de DSM19630 e DSM23693 Figura 2: Mostra a produção de metabolite de DSM19630 (Figura 2a) e DSM23693 (Figura 2b) Figura 3: Mostra o acúmulo de biomassa otimizado e a produção de metabolite de DSM23693 como descrito no Exemplo 2.

[0053] Figura 4: Mostra que um mapa genético da nova cepa de C. autoethanogenumLZ1561 (DSM23693) mostrando as variações para a cepa LZ1560 (DSM19630) Figura 5: Seq. ID.l: Sequência nucleotídica do gene MutS da proteína de reparo de incompatibilidade do DNA na cepa LZ1561 Figura 6: Seq. ID.2: Sequência nucleotídica do gene MutS da proteína de reparo de incompatibilidade do DNA na cepa LZ1560 Figura 7: Seq. ID.3: Sequência de aminoácidos do gene MutS da proteína de reparo de incompatibilidade do DNA na cepa LZ1561 Figura 8: Seq. ID.4: Sequência de aminoácidos do gene MutS da proteína de reparo de incompatibilidade do DNA na cepa LZ1560 Figura 9: Seq. ID.5: Sequência nucleotídica encontrada ser rearranjada nas cepas LZ561 e LZ1560 Figura 10: Seq. ID.6: Sequência nucleotídica da região de promotor putativo do operon FiFo de ATP sintase na cepa LZ1561 Figura 11: Seq. ID.7: Sequência nucleotídica da região de promotor putativo do operon FiFo de ATP sintase na cepa LZ1560 Figura 12: Seq. ID.8: Sequência nucleotídica da região de promotor putativo do operon do complexo Rnf na cepa LZ1561 Figura 13: Seq. ID.9: Sequência nucleotídica da região de promotor putativo do operon do complexo Rnf na cepa LZ1560 Figura 14: Seq. ID. 10: Sequência nucleotídica da região de promotor putativo de proteína de carência de carbono na cepa LZ1561 Figura 15: Seq. ID.ll: Sequência nucleotídica da região de promotor putativo de proteína da carência de carbono na cepa LZ1560 Figura 16: Seq. ID. 12: Sequência nucleotídica do gene da subunidade beta do complexo CO desidrogenase/acetil-CoA sintase CO- metilante na cepa LZ1561 Figura 17: Seq. ID. 13: Sequência nucleotídica do gene da subunidade beta do complexo CO desidrogenase/acetil-CoA sintase CO- metilante na cepa LZ1560 Figura 18: Seq. ID. 14: Sequência de aminoácidos do gene da subunidade beta do complexo CO desidrogenase/acetil-CoA sintase CO- metilante na cepa LZ1561 Figura 19: Seq. ID. 15: Sequência de aminoácidos do gene da subunidade beta do complexo CO desidrogenase/acetil-CoA sintase CO- metilante na cepa LZ1560 Figura 20: Seq. ID. 16: Sequência nucleotídica do gene de 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase na cepa LZ1561 Figura 21: Seq. ID. 17: Sequência nucleotídica do gene de 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase na cepa LZ1560

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0054] Os inventores desenvolveram novas bactérias. As bactérias são caracterizadas tendo uma ou mais das diversas propriedades inesperadas (como delineadas a seguir), e em uma modalidade preferencial todas estas propriedades. O uso destas novas bactérias em processos de fermentação anaeróbica fornece um benefício inesperado sobre as cepas existentes de bactérias que podem permitir um aumento na eficiência total de um processo de fermentação para produção de produtos, tais como etanol e/ou acetato.

[0055] Consequentemente, em termos amplos, em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma nova bactéria e um isolado biologicamente puro de uma bactéria com eficiência aumentada em um processo de fermentação anaeróbica. Em um aspecto a bactéria é capaz de produzir um álcool, preferencialmente etanol, de um substrato compreendendo CO.

[0056] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a processos para produção de um álcool, preferencialmente etanol, pela fermentação anaeróbica de um substrato contendo CO pelas bactérias da invenção.

Definições

[0057] A menos que de outra maneira definido, os seguintes termos como usados ao longo deste relatório descritivo são definidos como se segue:

[0058] Um "substrato contendo CO", deve ser entendido que um "substrato compreendendo CO"e como termos incluem qualquer substrato no qual o monóxido de carbono está disponível a bactérias para crescimento e/ou fermentação, por exemplo. Em modalidades particulares da invenção, o "substrato contendo CO"é gasoso. Tais substratos podem ser referidos neste pedido como "substratos gasosos contendo CO", "substratos gasosos compreendendo CO"e similares.

[0059] Na descrição que segue, as modalidades da invenção são descritas em termos de entrega e fermentação de um "substrato gasoso contendo CO". Entretanto, deve ser apreciado que o substrato gasoso pode ser fornecido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato gasoso contendo CO pode ser fornecido dissolvido em um líquido. Essencialmente, um líquido é saturado com um gás contendo monóxido de carbono e em seguida aquele líquido é adicionado ao biorreator. Isto pode ser alcançado usando metodologia padrão. Por meio de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak et al.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3/October 2002 pode ser usado. Por meio de exemplo adicional, o substrato gasoso contendo CO pode ser adsorvido por um suporte sólido. Tais métodos alternativos são englobados pelo uso do termo "substrato contendo CO".

[0060] Os termos "aumento da eficiência", "eficiência aumentada" e similares, quando usados em relação a um processo de fermentação, incluem, mas não é limitados a, aumento de um ou mais de: taxa do crescimento de micro-organismos que catalisam a fermentação, a absorção ou consumo de CO pelos micro-organismos, o volume do produto desejado (tais como álcoois) produzido por volume do substrato (tais como CO) consumido, a concentração do produto desejado (tais como álcoois) produzido em meio de cultura, a taxa de produção ou nível de produção do produto desejado, e a proporção relativa do produto desejado produzido comparado com outros subprodutos da fermentação.

[0061] O termo "acetato" inclui tanto o sal acetato sozinho como uma mistura de sal de acetato e ácido acético molecular ou livre, tal como a mistura de sal acetato e ácido acético livre presente em um caldo de fermentação como descrito neste pedido. A proporção de ácido acético molecular para acetato no caldo de fermentação depende do pH do sistema.

[0062] O termo "biorreator" inclui um dispositivo de fermentação consistindo de um ou mais vasos e/ou torres ou arranjo de tubos, que inclui o Reator Tanque Agitado Contínuo (CSTR), Reator de Células Imobilizadas (ICR), Reator de Leito de Gotejamento (TBR), Coluna de Bolhas, Fermentador com Elevação de Gás, Misturador Estático, ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para o contato de gás e líquido.

[0063] O termo "tolerância ao álcool", como usado neste pedido, deve ser tomado para referir-se ao nível de álcool, preferencialmente etanol, que uma bactéria ou a população de bactérias tolerarão enquanto continuam a sobreviver, cultivar e/ou produzir pelo menos um nível do produto desejado.

[0064] As bactérias da invenção, ou culturas ou isolados das mesmas, podem ser descritas para estar em uma forma "isolada" ou "biologicamente pura". Estes termos são destinados a significar que as bactérias foram separadas de um ambiente ou um ou mais constituintes, celulares ou de outra maneira, com o qual podem estar associadas se encontradas na natureza ou de outra maneira. Os termos "isolado" ou "biologicamente puro" não devem ser tomados para indicar a extensão até a qual as bactérias foram purificadas. Entretanto, em uma modalidade, os isolados ou culturas das bactérias contêm uma predominância das bactérias da invenção.

[0065] A invenção fornece um isolado biologicamente puro de uma bactéria em que a bactéria é capaz de produção de produtos incluindo etanol e opcionalmente acetato, pela fermentação anaeróbica de um substrato contendo CO e em que a bactéria é capaz de um ou mais de: produzir etanol em uma produtividade específica de aproximadamente 2 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia; produzir etanol em uma produtividade de pelo menos aproximadamente lOg/L de caldo/dia de fermentação; uma absorção específica de CO de pelo menos aproximadamente 1,0 mMol de CO/min/g de biomassa; uma taxa de crescimento específica de pelo menos aproximadamente 0,8 dia 1 produzir etanol em uma proporção de etanol para acetato de pelo menos aproximadamente 2:1; e, tolerar álcool de até aproximadamente 30 g/L de caldo.

[0066] Em uma modalidade preferencial, uma bactéria da invenção é capaz de dois, três, quatro, ou cinco dos atributos acima.

[0067] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de produzir etanol em uma produtividade específica de pelo menos aproximadamente 3 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia, pelo menos aproximadamente 4 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia, pelo menos aproximadamente 5 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia, pelo menos aproximadamente 6 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia ou pelo menos aproximadamente 7 g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia.

[0068] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de produzir etanol em uma produtividade de pelo menos aproximadamente 20 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia, pelo menos aproximadamente 30 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia, pelo menos aproximadamente 40 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia ou pelo menos aproximadamente 50 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia. O valor máximo leva em conta a estequiometria, absorção de CO e remoção de etanol.

[0069] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de uma absorção específica de CO de pelo menos aproximadamente 1,2 mMol de CO/min/g de biomassa, pelo menos aproximadamente 1,4 mMol de CO/min/g da biomassa, pelo menos aproximadamente 1,6 mMol de CO/min/g da biomassa, pelo menos aproximadamente 1,8 mMol de CO/min/g da biomassa, ou pelo menos aproximadamente 2,0 mMol de CO/min/g da biomassa. Em uma modalidade particular, a bactéria é capaz de uma absorção específica de CO de pelo menos aproximadamente 1,2 mMol de CO/min/g de biomassa.

[0070] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de uma taxa de crescimento específica de pelo menos aproximadamente 1,0 dia1, pelo menos aproximadamente 1,2 dia1, pelo menos aproximadamente 1,4 dia1, pelo menos aproximadamente 1,6 dia1, pelo menos aproximadamente 1,8 dia1 ou pelo menos aproximadamente 2,0 dia1.

[0071] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de produzir etanol em uma proporção de etanol para acetato de pelo menos aproximadamente 3:1, de pelo menos aproximadamente 4:1, de pelo menos aproximadamente 5:1, de pelo menos aproximadamente 7:1 ou de pelo menos aproximadamente 10:1. Em uma modalidade particular, não há produção líquida de acetato durante a fermentação.

[0072] Em certas modalidades, a bactéria é capaz de tolerar álcool até aproximadamente 40 g/L de caldo de fermentação, até aproximadamente 50 g/L de caldo de fermentação, ou até aproximadamente 60 g/L de caldo de fermentação. Em uma modalidade particular, a bactéria é capaz de tolerar álcool até aproximadamente 70 g/L de caldo de fermentação.

[0073] Em uma modalidade preferencial, as bactérias da invenção são derivadas de Clostridium autoethanogenum. Em uma modalidade mais preferencial da invenção, as bactérias são derivadas da cepa DSM19630 de Clostridium autoethanogenum (DSMZ, Alemanha) (descrita em W02009/064200).

[0074] Em uma modalidade preferencial, a bactéria da invenção é uma cepa de Clostridium autoethanogenum.

[0075] Clostridium autoethanogenum é descrito, por exemplo, em Abrini et al; Clostridium autoethanogenum, sp. nov., uma bactéria anaeróbica que produz etanol a partir de monóxido de carbono, Arch Microbiol (1994) 161:345-351.

[0076] Em certas modalidades da invenção, as bactérias têm as características definidoras da cepa de Clostridium autoethanogenum DSM23693 depositada em DSMZ, Alemanha, conforme o Tratado de Budapeste, em 7 de junho de 2010. Em uma modalidade particular, a bactéria é a cepa DSM23693 de Clostridium autoethanogenum.

[0077] A invenção também se refere a bactérias derivadas das bactérias da invenção.

[0078] As bactérias de certas modalidades da invenção são capazes de uma taxa de produção de álcool aumentada, uma taxa de crescimento aumentada, uma taxa aumentada de consumo ou renovação de CO, uma proporção superior da produção de álcool em relação à produção de ácido e/ou uma tolerância aumentada ao álcool. Isto fornece um benefício sobre as outras cepas de Clostridiasp incluindo Clostridium autoethanogenum. Por isso, o uso de bactérias da presente invenção pode aumentar a eficiência total de um processo de fermentação para produção de produtos, tais como acetato e/ou etanol.

[0079] Em certas modalidades, as bactérias da invenção são capazes de produtividade, taxas de crescimento, proporção de álcool para ácido, consumo de CO e tolerância ao álcool mencionados antes neste pedido a níveis elevados de CO no substrato gasoso. Por exemplo, o substrato gasoso pode compreender pelo menos aproximadamente 50% em volume de CO, pelo menos aproximadamente 65% em volume de CO, ou pelo menos aproximadamente 70% em volume de CO. Em certas modalidades, o substrato gasoso compreende pelo menos aproximadamente 80% em volume de CO, ou pelo menos aproximadamente 85% em volume de CO, ou pelo menos aproximadamente 90% em volume de CO ou pelo menos aproximadamente 95% em volume de CO.

[0080] Similarmente, a produtividade, taxas de crescimento, proporção álcool para ácido, consumo de CO e tolerância ao álcool neste pedido antes descritos são realizáveis em certas modalidades em níveis baixos a não existentes de H2 no substrato gasoso. O substrato gasoso pode compreender aproximadamente 30% ou menos em volume de H2. Em modalidades particulares, o substrato gasoso compreende aproximadamente 20% ou menos em volume de H2, aproximadamente 15% ou menos em volume de H2, aproximadamente 10% ou menos em volume de H2, aproximadamente 5% ou menos em volume de H2, aproximadamente 4% ou menos em volume de H2, aproximadamente 3% ou menos em volume de H2, aproximadamente 2% ou menos em volume de H2, aproximadamente 1 % ou menos em volume de H2, ou substancialmente sem H2.

[0081] Em certas modalidades, as bactérias da invenção são também capazes de produtividade, taxas de crescimento, proporção álcool para ácido, consumo de CO e tolerância ao álcool mencionados neste pedido antes quando suprido com substrato gasoso compreendendo relativamente pouco CO2. Em uma modalidade, o substrato gasoso compreende menos ou igual a aproximadamente 20% de CO2 em volume. Em certas modalidades, o substrato gasoso compreende menos ou igual a aproximadamente 15% de CO2 em volume, menos ou igual a aproximadamente 10% de CO2 em volume, ou menos ou igual a aproximadamente 5% de CO2 em volume. Em uma modalidade particular, o substrato gasoso compreende substancialmente nenhum CO2.

[0082] Em certas modalidades, uma cultura de uma bactéria da invenção é mantida em meio de cultura aquoso. Preferencialmente, o meio de cultura aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Meios adequados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas patente US no.s 5.173.429 e 5.593.886 e WO 02/08438, e em Klasson et al [(1992). Bioconversion of Synthesis Gas into Liquid or Gaseous Fuels. Enz. Microb. Technol. 14:602-608.], Najafpour e Younesi [(2006). Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture of Clostridium ljungdahlii. Enzyme and Microbial Technology, Volume 38, Issues 1-2, p. 223-228] e Lewis et al [(2002). Making the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol. Abst. Bioenergy, p. 2091-2094]. Em modalidades particulares da invenção, o meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo é como descrito em seguida na seção de Exemplos.

[0083] A invenção também fornece métodos para a produção de um ou mais álcoois de um substrato gasoso compreendendo CO, os métodos compreendendo manutenção de uma cultura de um ou mais isolados bacterianos da invenção na presença do substrato, e a fermentação anaeróbica do substrato a um ou mais álcoois por um ou mais isolados bacterianos.

[0084] A invenção também fornece um método para redução das emissões atmosféricas totais de carbono de um processo industrial, o método compreendendo: (a) captura de gás contendo CO produzido em consequência do processo industrial, antes do gás ser liberado na atmosfera; (b) fermentação anaeróbica do gás contendo CO para produzir um ou mais álcoois por uma cultura contendo um ou mais isolados bacterianos da invenção.

[0085] Em certas modalidades dos métodos da invenção, acetato é produzido como um subproduto da fermentação. O álcool produzido é etanol.

[0086] Em certas modalidades, a cultura é mantida em um meio nutritivo líquido.

[0087] A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator adequado, tal como um reator tanque agitado contínuo (CTSR), um reator de coluna de bolhas (BCR) ou um reator de leito de gotejamento (TBR). Também, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento no qual os micro- organismos são cultivados, e um segundo reator de fermentação, ao qual o caldo de fermentação do reator de crescimento é alimentado e no qual a maior parte do produto de fermentação (etanol e acetato) é produzida.

[0088] Como descrito acima, a fonte de carbono da reação de fermentação é um substrato gasoso contendo CO. O substrato gasoso pode ser um gás contendo CO residual obtido como um subproduto de um processo industrial, ou de alguma outra fonte tal como de fumaça de escapamento automobilístico. Em certas modalidades, o processo industrial é selecionado a partir do grupo consistindo na fabricação de produtos metálicos ferrosos, tal como um moinho de aço, fabricação de produtos não ferrosos, processos de refino de petróleo, gaseificação de carvão, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amónia, produção de metanol e fabricação de coque. Nestas modalidades, o gás contendo CO pode ser capturado do processo industrial antes que seja emitido na atmosfera, usando qualquer método adequado. Dependendo da composição do substrato gasoso contendo CO, também pode ser desejável tratá-lo para remover qualquer impureza indesejada, tal como partículas de pó antes de introduzi-lo à fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtrado ou lavado usando métodos conhecidos.

[0089] Além disso, é muitas vezes desejável aumentar a concentração de CO de uma corrente de substrato (ou pressão parcial de CO em um substrato gasoso) e dessa forma aumentar a eficiência de reações de fermentação onde CO é um substrato. Aumentar a pressão parcial de CO em um substrato gasoso aumenta a transferência de massa de CO nos meios de fermentação. A composição das correntes de gás usadas para alimentar uma reação de fermentação pode ter um impacto significante na eficiência e/ou custos daquela reação. Por exemplo, 02 pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbica. O processamento de gases não desejados ou desnecessários em estágios de um processo de fermentação antes ou após fermentação pode aumentar a carga em tais estágios (por exemplo, onde a corrente de gás é comprimida antes de entrar em um biorreator, energia desnecessária pode ser usada para comprimir gases que não são necessários na fermentação). Consequentemente, pode ser desejável tratar as correntes de substrato, particularmente correntes de substrato derivadas de fontes industriais, para remover componentes não desejados e aumentar a concentração de componentes desejáveis.

[0090] Correntes de substrato derivadas de uma fonte industrial são tipicamente variáveis na composição. Além disso, correntes de substrato derivadas de fontes industriais compreendendo altas concentrações de CO (tais como, por exemplo, pelo menos 40% de CO, pelo menos 50% de CO ou pelo menos 65% de CO) muitas vezes têm um componente Fh baixo (tal como menos de 20% ou menos de 10% ou substancialmente 0%). Como tal, é particularmente desejável que os micro-organismos sejam capazes de produzir produtos pela fermentação anaeróbica de substratos compreendendo uma faixa de concentrações de CO e H2, concentrações particularmente altas de CO e concentrações baixas de H2. As bactérias da presente invenção têm uma taxa de crescimento e taxa de produção surpreendentemente altas de etanol fermentando um substrato compreendendo CO (e sem H2).

[0091] A presença de hidrogênio na corrente de substrato pode levar a uma melhora na eficiência de captura de carbono total e/ou produtividade de etanol. Por exemplo, W002/08438 descreve a produção de etanol usando corrente de gás de várias composições. W002/08438 relata que uma corrente de substrato compreendendo 63% de H2, 32% de CO e 5% de CH4 que é fornecida a uma cultura de C. Ijungdahlii em um biorreator promove o crescimento microbiano e a produção de etanol. Quando a cultura alcançou um estado permanente e o crescimento microbiano não era mais o objetivo principal, a corrente de substrato foi trocada para 15,8% de H2, 36,5% de CO, 38,4% de N2 e 9,3% de CO2 a fim de fornecer CO em um leve excesso e promover a produção de etanol. Este documento também descreve correntes de gás com concentrações de CO mais altas e de H2 mais baixas.

[0092] Será apreciado que os processos da presente invenção como descritos neste pedido podem ser usados para reduzir as emissões atmosféricas totais de carbono dos processos industriais, capturando gases contendo CO produzidos em consequência de tais processos e usando-os como substratos dos processos de fermentação descritos neste pedido.

[0093] Altemativamente, em outras modalidades da invenção, o substrato contendo CO gasoso pode ser obtido da gaseificação da biomassa. O processo de gaseificação envolve a combustão parcial da biomassa com uma provisão restringida de ar ou oxigênio. O gás resultante tipicamente compreende principalmente CO e H2, com volumes mínimos de CO2, metano, etileno e etano. Por exemplo, os subprodutos de biomassa obtidos durante a extração e o processamento de gêneros alimentícios, tais como açúcar da cana-de-açúcar, ou amido de milho ou grãos, ou resíduos de biomassa não alimentícios gerados pela indústria florestal podem ser gaseificados para produzir um gás contendo CO adequado para o uso na presente invenção.

[0094] É geralmente preferencial que o substrato contendo CO gasoso contenha uma proporção principal de CO. Em modalidades particulares, o substrato gasoso compreende pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 65%, ou pelo menos aproximadamente 70% a aproximadamente 95% em volume de CO. Não é necessário para o substrato gasoso conter algum hidrogênio. O substrato gasoso também opcionalmente contém algum CO2, tal como aproximadamente 1% a aproximadamente 30% em volume, tais como aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de CO2.

[0095] Será apreciado que para ocorrer o crescimento das bactérias e fermentação de CO a etanol, além do gás contendo CO do substrato, um meio nutritivo líquido adequado precisará ser alimentado ao biorreator. Um meio nutritivo conterá vitaminas e minerais suficientes para permitir o crescimento do micro-organismo usado. Meios anaeróbicos adequados para a fermentação de etanol usando CO como a única fonte de carbono são conhecidos na técnica. Por exemplo, meios adequados são descritos nas patentes US no.s 5.173.429 e 5.593.886 e WO 02/08438 bem como outras publicações referidas antes neste pedido. Em uma modalidade da invenção, os meios são como descritos na seção de Exemplos em seguida.

[0096] A fermentação deve ser desejavelmente realizada sob condições apropriadas para ocorrer a fermentação CO a etanol. As condições de reação que devem ser consideradas incluem pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo líquida, pH dos meios, potencial redox dos meios, taxa de agitação (usando um reator tanque agitado contínuo), nível de inoculo, concentrações de substrato de gás máximas para assegurar que CO na fase líquida não se tome limitante, e concentrações de produto máximas para evitar a inibição do produto.

[0097] As condições ótimas de reação dependerão em parte do micro- organismo particular da invenção usado. Entretanto, em geral, é preferencial que a fermentação seja realizada em pressão mais alta do que a pressão ambiente. Operar em pressões aumentadas permite um aumento significante na taxa de transferência de CO da fase gasosa à fase líquida onde pode ser absorvida pelo micro-organismo como uma fonte de carbono para a produção de etanol. Isto por sua vez significa que o tempo de retenção (definido como o volume líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo do gás de entrada) pode ser reduzido quando os biorreatores são mantidos em pressão elevada em vez de pressão atmosférica.

[0098] Além disso, uma vez que uma dada taxa de conversão de CO a etanol é em parte uma função do tempo de retenção do substrato, e a realização de um tempo de retenção desejado por sua vez dita o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir muito o volume do biorreator necessário, e consequentemente o custo de capital do equipamento de fermentação. De acordo com os exemplos dados na Patente US no. 5.593.886, o volume do reator pode ser reduzido em proporção linear a aumentos na pressão operacional do reator, isto é, biorreatores operados em 10 atmosferas de pressão necessitam somente ter um décimo do volume dos operados em 1 atmosfera de pressão.

[0099] Os benefícios de conduzir uma fermentação gás a etanol em pressões elevadas também foram descritos em outro pedido. Por exemplo, WO 02/08438 descreve fermentações gás a etanol realizadas sob pressões de 30 psig e 75 psig, fornecendo produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia respectivamente. Entretanto, foi descoberto que fermentações de exemplo realizadas usando meios similares e composições de gás de entrada em pressão atmosférica produziam entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.

[00100] É também desejável que a taxa da introdução do substrato contendo CO gasoso seja a de assegurar que a concentração de CO na fase líquida não se tome limitante. Isto é porque uma consequência das condições limitantes CO pode consistir em que o produto etanol seja consumido pela cultura.

[00101] Em certas modalidades, um processo de fermentação de acordo com a presente invenção descrita acima resultará em um caldo de fermentação compreendendo etanol, bem como células bacterianas, em meio de cultura aquoso. Em modalidades preferenciais do método, o etanol é recuperado do caldo de fermentação.

[00102] Em certas modalidades, a recuperação de etanol compreende continuamente a remoção de uma porção de caldo e recuperação do álcool da porção removida do caldo.

[00103] Em modalidades particulares, a recuperação de etanol inclui a passagem da porção removida do caldo contendo etanol por uma unidade de separação para separar células bacterianas do caldo, para produzir um permeado contendo álcool sem células, e restituição das células bacterianas ao biorreator.

[00104] Em certas modalidades, os métodos da invenção são processos contínuos.

[00105] Em modalidades particulares, acetato é produzido como um subproduto da fermentação.

[00106] Em uma modalidade adicional, etanol e acetato são recuperados do caldo.

[00107] Em certas modalidades, a recuperação de etanol e acetato compreende continuamente a remoção de uma porção do caldo e recuperação separadamente etanol e acetato da porção removida do caldo.

[00108] Em algumas modalidades, a recuperação de etanol e acetato inclui a passagem da porção removida do caldo contendo etanol e acetato por uma unidade de separação para separar células bacterianas do etanol e do acetato, para produzir um permeado contendo etanol e acetato sem células, e restituição das células bacterianas ao biorreator.

[00109] Nas modalidades acima, a recuperação de etanol e acetato preferencialmente inclui primeiro remoção do permeado de etanol sem células seguido por remoção do permeado de acetato sem células. Preferencialmente, os permeados sem células então são devolvidos ao biorreator.

[00110] O etanol é o produto final desejado preferencial da fermentação. Etanol pode ser recuperado do caldo de fermentação por métodos conhecidos na técnica, tais como destilação fracionada ou evaporação, e fermentação extrativa. A destilação de etanol de um caldo de fermentação produz uma mistura azeotrópica de etanol e água (isto é etanol 95% e água 5%). O etanol anidro pode ser posteriormente obtido pelo uso da tecnologia de desidratação de etanol por peneira molecular, que também é bem conhecida na técnica. Os procedimentos de fermentação extrativa envolvem o uso de um solvente miscível em água que apresenta um risco de baixa toxicidade ao organismo de fermentação, para recuperar o etanol do caldo de fermentação diluído. Por exemplo, álcool oleílico é um solvente que pode ser usado neste tipo do processo de extração. Álcool oleílico é continuamente introduzido em um fermentador, após o qual este solvente sobe formando uma camada acima do fermentador que é continuamente extraída e alimentada através de uma centrífuga. Água e células então são prontamente separadas do álcool oleílico e devolvidas ao fermentador enquanto o solvente carregado com etanol é alimentado em uma unidade de vaporização rápida. A maior parte do etanol é vaporizada e condensada enquanto álcool oleílico não é volátil e é recuperado para a reutilização na fermentação.

[00111] Acetato também pode ser recuperado do caldo de fermentação usando métodos conhecidos na técnica. Métodos para a recuperação de acetato são descritos detalhadamente em W02007/117157 e W02008/115080.

[00112] Em certas modalidades da invenção, etanol e acetato são recuperados do caldo de fermentação removendo continuamente uma porção do caldo do biorreator de fermentação, separando células microbianas do caldo (convenientemente por filtração), e recuperando primeiro etanol e em seguida acetato a partir do caldo. Etanol pode ser convenientemente recuperado por destilação, e acetato pode ser recuperado por adsorção em carvão vegetal ativado, usando os métodos descritos acima. As células microbianas separadas são preferencialmente devolvidas ao biorreator de fermentação. O permeado livre de células remanescente após o etanol e o acetato serem removidos também é preferencialmente devolvido ao biorreator de fermentação. Nutrientes adicionais (tais como vitaminas B) podem ser adicionados ao permeado livre de células para reconstituir o meio nutritivo antes que seja devolvido ao biorreator. Também, se o pH do caldo foi ajustado como descrito acima para aumentar a adsorção de ácido acético no carvão vegetal ativado, o pH deve ser reajustado a um pH similar àquele do caldo no biorreator de fermentação, antes de ser devolvido ao biorreator.

Estequiometria de reação

[00113] Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, acredita-se que as reações químicas da fermentação de CO para etanol (a) e ácido acético (b) no processo da presente invenção são como se segue: (a) 6CO + 3H2O => CH3CH2OH + 4CO2 (b) 4CO + 2H2O => ICH3COOH + 2CO2

[00114] A invenção será descrita agora em mais detalhes com referência aos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLOS Materiais e Métodos:

Preparação de solução de Cr(II)

[00115] Um frasco de 1 L com três pescoços foi ajustado com uma entrada e saída firmes de gás para permitir trabalhar sob gás inerte e transferência subsequente do produto desejado em um frasco de armazenamento adequado. O frasco foi carregado com CrCh.ólUO (40 g, 0,15 mol), grânulos de zinco [20 mesh] (18,3 g, 0,28 mol), mercúrio (13,55 g, 1 mL, 0,0676 mol) e 500 mL de água destilada. Seguinte à lavagem com N2 por uma hora, a mistura foi aquecida a aproximadamente 80°C para iniciar a reação. Duas horas seguintes de agitação sob um fluxo de N2 constante, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e continuamente misturada por outras 48 horas momento o qual mistura de reação virou para uma solução azul intensa. A solução foi transferida em garrafas de soro purgadas com N2 e armazenadas na geladeira para futuro uso.

Bactérias:

[00116] Os dois tipos de Clostridium autoethanogenum usados foram aqueles depositados no Centro Alemão de Recursos para Material Biológico (DSMZ) e alocaram os números de acesso DSM 19630 e DSM 23693. DSM 23693 foi desenvolvido de DSM19630 da cepa de Clostridium autoethanogenum (DSMZ, Alemanha) através de um processo de seleção iterativo.

Amostragem e procedimentos analíticos

[00117] Amostras de meios foram tomadas do reator CSTR de tempos em tempos ao longo do curso de cada fermentação. A cada vez que os meios foram amostrados, cuidado foi tomado para assegurar que nenhum gás entrasse ou escapasse do reator. HPLC:

[00118] Sistema de HPLC Agilent 1100 Series. Fase Móvel: Ácido Sulfúrico 0,0025N. Fluxo e pressão: 0,800 mL/min. Coluna: Alltech IOA; Catálogo # 9648, 150 x 6,5 mm, tamanho de partícula 5 pm. Temperatura de coluna: 60°C. Detector: índice Refrativo. Temperatura do detector: 45°C.

[00119] Método de preparação de amostra:

[00120] 400 pL de amostra e 50 pL de 0,15M ZnSC>4 e 50 pL de 0,15M Ba(OH)2 são carregados em um tubo Eppendorf. Os tubos são centrifugados por 10 min. em 12.000 rpm, 4°C. 200 pL do sobrenadante são transferidos em um frasco HPLC, e 5 pL são injetados no instrumento HPLC.

Análise do Espaço de cabeça:

[00121] As medidas foram realizadas em um Varian CP-4900 micro GC com dois canais instalados. O canal 1 foi uma coluna de peneira molecular de 10 m correndo a 70°C, 200 kPa de argônio e um tempo de reversão de fluxo de 4,2 s, enquanto o canal 2 foi uma coluna PPQ de 10 m correndo a 90°C, 150 kPa de hélio e sem reversão de fluxo. A temperatura de injetor de ambos os canais era 70°C. Os tempos de execução foram estabelecidos em 120 s, mas todos os picos de interesse eluiriam normalmente antes de 100 s.

Densidade Celular:

[00122] A densidade celular foi determinada contando células bacterianas em uma alíquota definida do caldo de fermentação. Altemativamente, a absorvância das amostras foi medida em 600 nm (espectrofotômetro) e a massa seca determinada através do cálculo de acordo com os procedimentos publicados.

Sequenciamento:

[00123] O sequenciamento de genoma revelou que várias modificações em genomas da cepa LZ1560 de C. autoethanogenum (DSM19630) e a nova cepa LZ1561 (DSM23693), que provavelmente contribuirão para o desempenho melhorado.

[00124] Ambas as cepas foram cultivadas anaerobicamente em meios PETC a uma densidade ótica (ODeoonm) de 1 e DNA genômico foi isolado de 100 ml de culturas noturnas. As células foram coletadas por centrifugação (6.000 x g, 15 min, 4°C), lavadas com tampão de fosfato de potássio (10 mM; pH 7,5) e suspensas em 1,9 ml de tampão STE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, sacarose 200 mM; pH 8,0). Esta suspensão foi tratada com 300 pl de lisozima (-100.000 U; 30 min, 37°C) e 280 pl de uma solução de SDS (10% (p/v); 10 min). RNA foi digerido pela adição de 240 pl de uma solução de EDTA (0,5 M; pH 8), 20 pl de Tris-HCl (1 M; pH 7,5), e 10 pl de RNase A (50.000 U) por 1 hora. A proteólise foi realizada pela adição de 100 pl de Proteinase K (0,5 U) por 1 a 3 h a 37 °C. Finalmente, 600 pl de perclorato de sódio (5 M) foram adicionados, seguido por uma extração com fenol- clorofórmio e uma precipitação com isopropanol. A pureza e a quantidade de DNA foram verificadas usando um espectrofotômetro NanoDrop® 1000 (Thermo Fisher Científico, Waltham, MA, EUA) e por eletroforese em gel.

[00125] O sequenciamento de genoma shotgunfoi realizado usando um 454 GS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA). 191.368 leituras únicas com um comprimento total de 44.424.523 bases foram criadas para LZ1560 (cobertura 10x), enquanto 579.545 leituras de extremidades pareadas com um comprimento total de 202.591.572 bp foram criadas para LZ1561 (cobertura 47,5x). As leituras foram montadas usando o pacote Newbler (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) e as sequências comparadas usando Geneious (Biomatters Ltd., Auckland, NZ) com o pacote MAUVE (Darling et al., 2004, Genoma Res. 14: 1394-1403) e por Artemis Comparison Tool (Carver et al., 2008, Bioinformatics 24:2672-6).

[00126] Um total de 64 modificações foi encontrado em sequências de genoma montadas de LZ1560 (DSM19630) e a nova cepa LZ1561 (DSM23693) (Fig. 4). Enquanto a maioria das modificações foram variações de bases únicas, uma deleção de 21 bp (no gene que codifica uma proteína de reparo de incompatibilidade de DNA putativa MutS; Seq. ID. 1-4) e um evento de rearranjo de uma região de 15.408 bp (Seq. ID.5) contendo 11 genes (envolvidos em fixação de nitrogênio, metabolismo de açúcar, transporte de açúcar e controle de catabólito) foram encontrados. De 62 variações de bases únicas, 22 foram mutações pontuais, e 40 inserções/deleções. 18 destas variações foram encontradas em regiões intergênicas e 44 nas regiões de codificação. Enquanto 5 das variações na região de codificação foram silenciosas e não resultaram em uma modificação da sequência de aminoácidos, 14 resultaram em uma modificação de aminoácido única e 25 em um quadro de leitura.

[00127] Mais notavelmente foram modificações nas posições 212.530 (região de promotor putativo do operon FiFo de ATP sintase, Seq. ID.6-7), 1.171.874 (região de promotor putativo do operon do complexo Rnf, Seq. ID.8-9), 3.717.495 (região de promotor putativo da proteína de carência de carbono, Seq. ID. 10-11), e duas variações no agrupamento do gene Wood- Ljungdahl nas posições 3.741.730 (subunidade beta do complexo CO desidrogenase/acetil-CoA sintase CO-metilante, Seq. ID.12-15) e 3.748.058 (gene de 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase, Seq. LD.16-17), que podem ser rastreadas de volta diretamente para se desenvolver em CO/H2 e metabolismo de energia. A maioria dos outros genes afetados são genes não caracterizados.

Exemplo 1; A: Fermentação em batelada em CSTR

[00128] Aproximadamente 1500 mL da solução A foram transferidos em um fermentador de 1,5 L e dispersados com nitrogênio. Resazurina (1,5 mL de uma solução 2 g/L) e H3PO4 (solução 85%, 2,25 mL) foram adicionados e o pH ajustado a 5,3 usando NH4OH concentrado (aq). Acido nitriloacético (0,3 ml de uma solução 0,15 M) foi adicionado antes de 1,5 ml da solução C. Isto foi seguido por NiCl2 (0,75 ml de solução 0,1 M) e Na2WO3 (1,5 mL de uma solução 0,01 M). 15 ml da solução B foram adicionados e a solução dispersada com N2 antes de alternar para o gás contendo CO (CO 50%; N2 28%, H2 2%, CO2 20%) em 70 mL/min. O fermentador então foi inoculado com 200 ml de uma cultura Clostridium autoethanogenum 19630. O fermentador foi mantido a 37°C e agitado em 300 rpm. Durante este experimento, a solução de Na2S (solução 0,2 M) foi adicionada em uma taxa de aproximadamente 0,3 ml/hora. O suprimento de substrato foi aumentado em resposta às exigências da cultura microbiana.

[00129] A cultura bacteriana não proliferou nas condições experimentais usadas. A cultura mostrou a uma absorção de 350 mM de CO após 48 horas de crescimento (Figura la e Tabela 2) enquanto o tempo de duplicação da cultura foi 40,8 horas (Figura 2a). Isto corresponde a uma taxa de crescimento específica de 0,41 dia -1. A absorção de CO específica aumentou durante o experimento com um valor máximo de 0,54 mM de CO/min/g de biomassa. Dia 1.0 absorção específica: 0,28 mM de CO/min/g de biomassa (Tabela 1). Dia 2.0 absorção específica: 0,54 mM de CO/min/g de biomassa (Tabela 2).

B: Fermentação em batelada em CSTR

[00130] Aproximadamente 1500 mL da solução A foram transferidos em um fermentador de 1,5 L e dispersados com nitrogênio. Resazurina (1,5 mL de uma solução 2g/L) e H3PO4 (solução 85%, 2,25 mL) foram adicionados e o pH ajustado a 5,3 usando NH4OH concentrado (aq). Ácido nitriloacético (0,3 ml de uma solução 0,15 M) foi adicionado antes de 1,5 ml da solução C. Na2WO3 (1,5 mL de uma solução 0,01 M) foi adicionado. 15 ml da Solução B foram adicionados e a solução dispersada com N2 antes de alternar para o gás contendo CO (CO 50%; N2 50%) em 60 mL/min. O fermentador então foi inoculado com 180 ml de uma cultura de Clostridium autoethanogenum 23693. O fermentador foi mantido a 37 °C e agitado em 300 rpm. Durante este experimento, a solução de Na2S (solução 0,5 M) foi adicionada em uma taxa de aproximadamente 0,12 ml/hora. O suprimento de substrato foi aumentado em resposta às exigências da cultura microbiana.

[00131] A cultura bacteriana proliferou nas condições experimentais usadas. A cultura mostrou uma absorção de 8400 mM de CO após 43 horas de crescimento (Figura 2b) enquanto o tempo de duplicação da cultura foi 9,6 horas (Figura 2b). Isto corresponde a uma taxa de crescimento específica de 1,73 dia1. A absorção de CO específica máxima alcançada durante o experimento foi 1,17 mMol de CO/min/g de biomassa. Dia 1.0 absorção específica: 1,17 mM de CO/min/g de biomassa (Tabela 1). Dia 2.0 absorção específica: 1,03 mM de CO/min/g de biomassa (Tabela 2). As condições de fermentação foram idênticas ou pelo menos altamente similares às condições usadas no Exemplo IA. A preparação de meios tem componentes idênticos em concentrações similares enquanto ambos os gases continham pelo menos 50% (v/v) de CO. Condições de fermentação similares em comparação com a vasta diferença na entrada de CO indicam o desempenho de cultura variado devido à eficiência melhorada da cultura de Clostridium autoethanogenum 23693 desenvolvida comparada à cepa parental de Clostridium autoethanogenum 19630. Resultados: Tabela 1: Dia 1

Tabela 2: Dia 2

Exemplo 2

[00132] Aproximadamente 1500 mL da solução A foram transferidos em um fermentador de 1,5 L e dispersados com nitrogênio. Resazurina (1,5 mL de uma solução 2 g/L) e H3PO4 (solução de 85%, 0,56 mL) foram adicionados e o pH ajustado 5,3 usando NH4OH concentrado (aq). A Solução C (1,5 mL) foi adicionada após a qual Na2WOβ (1,5 mL de uma solução 0,01 M) foi adicionado. 15 ml da Solução B foram adicionados e a solução dispersada com N2 antes de alternar para o gás contendo CO (CO 50%; N2 50%) em 60 mL/min. O fermentador então foi inoculado com 100 ml de uma cultura de Clostridium autoethanogenum 23693. O fermentador foi mantido a 37°C e agitado em 300 rpm. Durante este experimento, a solução de Na2S (solução 0,5 M) foi adicionada em uma taxa de aproximadamente 0,15 ml/hora. O suprimento de substrato foi aumentado em resposta às exigências da cultura microbiana.

[00133] A cultura bacteriana proliferou nas condições experimentais usadas. As condições de fermentação foram idênticas ou pelo menos altamente similares às condições usadas no Exemplo IA + B enquanto ambos os gases continham pelo menos 50% (v/v) de CO. A cultura foi cultivada à fase estacionária onde a concentração de etanol máxima foi medida por HPLC (55,8 g/L).

[00134] Os métodos e composições específicos descritos neste pedido são representativos de modalidades preferenciais e são exemplares e não desejados como limitações do escopo da invenção. Outros objetos, aspectos e modalidades ocorrerão aos versados na técnica em consideração deste relatório descritivo, e são englobados dentro do escopo e do espírito da invenção. Será prontamente evidente para um versado na técnica que substituições e modificações variadas podem ser feitas à invenção descrita neste pedido sem se afastar do escopo e do espírito da invenção. A invenção descrita ilustrativamente neste pedido apropriadamente pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, ou limitação ou limitações, que não são especificamente descritos neste pedido como essenciais. Dessa forma, por exemplo, em cada exemplo neste pedido, em modalidades ou exemplos da presente invenção, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo" etc. devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Além disso, títulos, cabeçalhos ou similares são fornecidos para aumentar a compreensão do leitor deste documento, e não devem ser lidos como limitação do escopo da presente invenção.

[00135] As revelações completas de todos os pedidos de patente, patentes e publicações, citados acima e abaixo, se houver algum, são por meio deste incorporadas por referência. Entretanto, referência a quaisquer pedidos de patente, patentes e publicações neste relatório descritivo não é, e não deve ser tomada como um reconhecimento ou nenhuma forma da sugestão que constitua técnica prévia válida ou seja parte do conhecimento geral comum em qualquer país no mundo.

Claims

1. Isolado biologicamente puro de uma bactéria Clostridium autoethanogenum,caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium autoethanogenum é a cepa de Clostridium autoethanogenum depositada na Coleção alemã de Micro-organismos e culturas celulares (DSMZ) sob o número de acesso DSM23693 e em que a bactéria fermenta um substrato compreendendo CO em produtos compreendendo etanol.

2. Isolado biologicamente puro de Clostridium autoethanogenum de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria fermenta um substrato compreendendo CO em produtos compreendendo etanol em que a produtividade específica da bactéria é pelo menos 2g de etanol/L caldo de fermentação /grama de biomassa/dia.

3. Isolado de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a produtividade específica é pelo menos 7g de etanol/L de caldo de fermentação/grama de biomassa/dia.

4. Isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os produtos compreendem etanol e acetato.

5. Isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a bactéria fermenta um substrato compreendendo CO para produzir etanol em uma produtividade de pelo menos 10g de etanol/L de caldo de fermentação/dia.

6. Isolado de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a produtividade da bactéria é pelo menos aproximadamente 50 g de etanol/L de caldo de fermentação/dia.

7. Isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a bactéria produz etanol e acetato, pela qual a proporção etanol para acetato é pelo menos 2:1.

8. Isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a bactéria tem uma absorção específica de CO de pelo menos 1,0 mMol de CO/min/g de biomassa.

9. Isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a bactéria tem uma absorção específica de CO de pelo menos 2,0 mMol de CO/min/g de biomassa.

10. Isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a bactéria tem uma taxa de crescimento específica de pelo menos 0,8 dia 1

11. Isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a bactéria tolera uma concentração de álcool de até 30 g/L de caldo de fermentação.

12.Isolado de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a bactéria tolera uma concentração de álcool de até 70 g/L de caldo de fermentação.